菌肽在中藥生物工程中的應用前景

1、抗菌肽在中藥生物工程中的應用前景.780.中草藥ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第5期2005年5月抗菌肽在中藥生物工程中的應用前景董燕,周聯(lián),王培訓(廣州中醫(yī)藥大學免疫與分子生物學研究室,廣東廣州510405)摘要:中藥栽培中的病害問題以及農(nóng)藥的施用都對中藥品質造成不良影響.抗菌肽是具有廣譜抗微生物活性的小分子肽,已成為植物基因工程抗病育種研究的熱點,并在多種植物中實現(xiàn)了表達,獲得了抗菌性增強的植株.將外源抗菌肽基因轉入中藥植株中,增強其抗微生物活性,在中藥的種植和中藥新品種的開發(fā)上展現(xiàn)出誘人的前景.關鍵詞:中藥;抗菌肽;基因工程中圈分類號:R282.

2、71文獻標識碼:A文章編號:02532670(2005)05078004ApplicationandprospectofantimicrobialpeptidesinbiologicalengineeringofChinesemateriamedicaDoNGYan.ZHOULian.WANGPeixHn(DepartmentofImmunologyandMolecularBiology,GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405,China)Keywords:Chinesemateriamedica;anti

3、microbialpeptides;geneengineering我國是中藥的發(fā)源地和最大的生產(chǎn)使用國,猶如其他經(jīng)濟作物,中藥的大面積栽培同樣存在病害問題,且某些中藥植株的病害較為嚴重,導致罹病株成片枯死.在病害防治中,常常需先清除病葉殘體,再施用化學農(nóng)藥,不僅耗費人力,物力.還造成土壤環(huán)境的污染以及殘毒對中藥品質的影響.而且,化學農(nóng)藥的經(jīng)常使用也會導致病菌,害蟲耐藥性的逐漸產(chǎn)生和增強.按照中藥材生產(chǎn)質量管理規(guī)范(GAP)的生產(chǎn)綠色中藥材的目標,在病害防治中應優(yōu)先選用抗病品種,但以常規(guī)育種手段難以獲得,利用基因工程技術有可能在傳統(tǒng)中藥材中引入有用的新遺傳特性,提高植株抗病能力.而目前大多數(shù)可利

4、用的抗病基因的抗性譜不廣,如抗細菌的溶菌酶,番茄pto基因等,抗真菌的幾丁質酶,口一1,3一葡聚糖酶基因等,抗病毒的病毒外殼蛋白(cp),動物來源的干擾素基因等.由于抗菌肽具有廣譜抗菌活性和快速殺菌能力,不易產(chǎn)生耐藥突變株,對耐藥性菌同樣具有殺滅活性1,與其他抗病基因相比具有獨特的優(yōu)勢,因而已成為植物基因工程抗病育種研究的熱點之一,并且已獲得抗真菌,抗細菌,抗病毒的轉基因植株.本文就抗菌肽的結構,活性及其在中藥生物工程中的應用前景作一綜述.1抗菌肽的分類與結構抗菌肽是一類具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽,是機體先天非特異性免疫中起重要作用的一類免疫效應因子,廣泛存在于哺乳動物,鳥類,兩棲類,昆

5、蟲,植物等生物體內.這些抗菌肽絕大部分都是帶正電荷的陽離子型.陽離子型抗菌肽種類繁多,不同生物來源和結構特點的抗菌肽,其抗微生物活性有所不同2j,名稱也有不同.目前研究較多的主要有4類:來源于昆蟲的天蠶素類抗菌肽(cecropin),富含甘氨酸的蜂毒素(melittin),富含半胱氨酸,存在于昆蟲和動植物的防御素(defensin),富含脯氨酸,來源于青蛙的蛙皮素(magainin).抗菌肽通常由不到5O個氨基酸殘基組成,含有多個堿性氨基酸殘基使其帶有凈正電荷,還有占50或更多的疏水殘基l3.總體來看,各種抗菌肽的一級結構有一定的保守性,其N端富含賴氮酸或精氮酸,C端富含丙氮酸,甘氨酸等非極性

6、氨基酸,中間部分則富含脯氨酸.基于抗菌肽的二級結構可分為4種類型:a一螺旋型,如天蠶素類抗菌肽,蛙皮素等;以二硫鍵固定的p一折疊型,如動物a一防御素,pI防御素;伸展結構型(線性);環(huán)狀結構型.前兩類結構普遍存在于天然抗菌肽中,而不論是a一螺旋型還是口一折疊型,抗菌肽的共同特點是能夠形成兩親結構,且通常是在與細胞膜或膜的類似物發(fā)生相互作用時形成.2抗菌肽的活性與作用機制抗菌肽具有廣譜抗微生物活性,它不僅能殺死細菌,真菌,原蟲等病原微生物,抑制病毒的繁殖與擴散,而且也能殺死癌細胞.某些抗菌肽又只對原核生物和突變細胞起作用,而對真核生物無作用.其最小抑制濃度(MIC)為0.254/lg/mI.E4

7、,特別對一些耐藥菌,如傷寒桿菌,金黃色葡萄球菌收稿日期:20040909基金項目:國家自然科學基金資助項目(30271651);廣東省自然科學基金資助項目(04300450)作者簡介:董燕(1969一),女,講師.博士,研究方向為分子生物學技術在中醫(yī)藥研究中的應用Tel:(020)36585479E-mail:dondy001中草藥ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第5期2005年5月.781.等同樣敏感.抗菌肽的作用機制獨特,微生物不易對其產(chǎn)生耐藥性,而且能與抗生素發(fā)生協(xié)同作用,逆轉細菌耐藥.目前主要認為是帶正電的抗菌肽與帶負電的微生物細胞膜作用,使細胞

8、膜產(chǎn)生穿孔現(xiàn)象,造成內容物溢出胞外而死亡.大部分抗菌肽都在5min內迅速引起細胞膜損傷,導致細胞死亡j.某些抗菌肽并不破壞膜結構.而是穿過細胞膜或核膜,作用于胞內大分子跚,如DNA,RNA和蛋白質分子,導致其合成受抑制.某些酶也是抗菌肽的作用靶標.抗菌肽能抑制被膜病毒的繁殖與擴散,在抗菌肽對皰疹病毒(HSV一1)n,煙草花葉病毒(TMV),I型人免疫缺陷病毒(HIV一1)I9的研究中,發(fā)現(xiàn)抗菌肽可以從核酸復制到病毒顆粒包裝的全過程進行干擾,抑制病毒基因表達.起到抑制細胞內病毒復制,快速抵御病毒擴散的作用.真菌屬于真核細胞,與細胞不同,具有甲殼質或纖維素構成的細胞壁,研究發(fā)現(xiàn),正在萌發(fā)的真菌孢子

9、比非萌發(fā)的真菌孢子對抗菌肽要敏感得多,因而推測真菌孢子在萌發(fā)時為抗菌肽與膜作用提供了機會.3抗菌肽的轉基因植物研究由于抗菌肽的廣譜抗微生物活性,將抗菌肽基因轉入植物,提高其抗細菌,抗真菌及抗病毒的能力已成為植物基因工程的研究熱點.在植物基因工程抗病育種中研究較多的是天蠶素和防御素,且人工設計的抗菌肽在轉基因植物中表現(xiàn)出了更好的活性.3.1天蠶素:天蠶素是來源于昆蟲的抗菌肽,在體外實驗中表現(xiàn)出較強的廣譜抑菌活性,在幾種肽對引起梨樹火燒病的歐文氏菌Erwinia.amylovoraWinslow的抗性實驗中發(fā)現(xiàn).與來自谷物的嘌呤硫素,動物的溶菌酶和微生物的T4溶菌酶相比,天蠶素具有更強的抗菌活性,

10、尤其能有效抵御一些植物病原菌,而且在殺菌濃度下未表現(xiàn)出對植物細胞的毒性l】,可作為轉基因研究中的備選基因.天蠶素由3139個氨基酸組成,相對分子質量約為4000,具有兩性a一螺旋結構,其N端帶正電荷,C端為疏水區(qū).天蠶素已在煙草,馬鈴薯,水稻,大白菜和蘋果等植株中進行了轉化研究,并首先在轉基因煙草和馬鈴薯研究中獲得了抗病性增強的植株,但也有報道在天蠶素B以及天蠶素B/天蠶素A雜合肽的轉基因植物中抗病性沒有變化,其原因在于宿主蛋白酶的降解作用.不同作物對抗菌肽的降解率不同,天蠶素B在馬鈴薯中的半衰期為3min,在煙草中為2.5h,在水稻中為25.5h.在轉基因水稻中.將天蠶素B與水稻的幾丁質酶信

11、號肽序列融合表達,有利于提高天蠶素B的轉錄水平,且天蠶素B分泌至細胞間隙,有助于防止細胞內的降解Ll3.用梨的葉片提取液處理幾種昆蟲抗菌肽,也觀察到抗菌肽的降解和抗菌活性降低n.由于抗菌肽在不同植物中的穩(wěn)定性不同,為保持抗菌肽在細胞外空間的抑菌濃度,要設計合理的表達策略才能獲得抗病植株.3.2防御素:防御素是一類富含半胱氨酸,具有分子內二硫鍵,相對分子質量約在4000左右的陽離子抗菌肽,分布于哺乳動物,昆蟲和植物體內.在來源于植物的防御素DmAMP1(來自光滑大麗花D”hliamerckiLehm.種子)和RsAFP2(來自蘿卜RaphanussativusL.種子)的轉擬南芥研究中,可觀察到

12、DmAMP1,連接肽和RsAFP2作為一個編碼區(qū)的表達水平明顯高于DmAMP1單體的表達水平,提示多聚蛋白表達策略可能是一個有效的表達小分子多肽的方法n.在來源于苜蓿種子的防御素aliAFP基因轉化馬鈴薯研究中獲得了對輪枝孢菌VrticilliumdahliaeKlebahn的抗性株.并且在田間種植情況下仍能保持很好的抗菌活性n.哺乳動物防御素具有更為廣譜的抗微生物活性,同時也具有細胞毒活性.兔防御素NP一1(neutrophilpeptide一1)是迄今表現(xiàn)出抗微生物最廣譜,活性最強的防御素之一,還可抑殺腫瘤細胞,尤其與其他抗菌肽相比,NP一1表現(xiàn)出對多種真菌有明顯的抑制作用,對番茄青枯病,

13、小麥赤霉病和棉花枯萎病等的病原菌具有很好的抑菌效果l】.對兔防御素NP一1基因的轉化煙草l】一和番茄】研究中.培育出了抗煙草花葉病毒的轉基因植株,轉基因番茄植株的蛋白粗提液表現(xiàn)出明顯的抑菌效果.由于NP一1對靶細胞的殺傷作用與靶細胞膜的脂質成分有關2,而原核細胞與真核細胞的結構,尤其是膜結構的不同,所以,在植物中表達防御素對植物細胞本身具有殺傷作用的擔心可能是不必要的.且在防御素轉基因植物的研究中也未觀察到對植物細胞的毒性.3.3人工設計抗菌肽:在揭示抗菌肽結構與功能關系的基礎上.可對天然抗菌肽進行人工改造和設計,這類抗菌肽往往具有更好的靶細胞特異性和抗菌活性.與其天然來源的抗菌肽相比,對植物

14、蛋白酶降解作用的敏感性降低.人工設計的抗菌肽D4E1在對植物病原菌的殺菌濃度下對哺乳動物紅細胞的溶血活性極低,在體外實驗中可抑制約2O種植物病原菌,包括細菌和真菌,且不易被蛋白酶降解.Cary等將D4E1抗菌肽的基因轉入煙草,轉基因株表現(xiàn)出明顯的對炭疽病的抗性,表達D4E1的植物蛋白粗提液能顯著抑制產(chǎn)黃曲霉素真菌和V.dahliaeKlebahn的生長.在對蛋白酶敏感性實驗中發(fā)現(xiàn),在煙草粗提液中添加蛋白酶抑制劑后,再加入D4E1,其抗真菌活性無變化,說明D4E1的穩(wěn)定性較好,不易被蛋白酶降解_2.有些抗菌肽的抗菌活性強但又具有溶血作用,可對其分子進行人工設計和改造,如雜合肽CEMA的C端是來自

15、天蠶素A的8個氨基酸殘基,N端則是來自蜂毒素的16個氨基酸,其后又添加2個帶正電荷的賴氨酸,既保留了強抗菌活性,又降低了蜂毒素的溶血活性.然而前期研究工作顯示CEMA對植物仍然具有毒性l2.Osusky等利用軟件設計了MsrA1肽,即在CEMA的N端添加了6個氨基酸,并預測可形成兩性a一螺旋結構.體外抑菌實驗表明MsrA1具有廣譜抗菌活性,但活性低于CEMA.將其編碼基因msrA1轉人馬鈴薯Desiree和RussteBurbank品系.獲得的轉基因植株在抗病性實驗中表現(xiàn)出對植物病原菌Phytophthoracacto-.782?中草藥ChineseTraditionalandHerbalDr

16、ugs第36卷第5期2005年5月r”Schroter,鐮刀菌FusariumsolaniSaccardo和歐文氏菌具有明顯的抗性.馬鈴薯塊莖長期貯存于4C達1年時仍保持了對病原菌的抗性,也說明塊莖中MsrA1可以保持一定的濃度并具有生物活性,而且以這種塊莖喂養(yǎng)小鼠未觀察到毒性反應.但研究中發(fā)現(xiàn)RussetBurbank品種的轉基因馬鈴薯植株在形態(tài)上有所改變,出現(xiàn)所謂模擬性損害(1esionmimic),包括葉片拳曲和塊莖縮小;而Desiree品種的轉基因植株未出現(xiàn)形態(tài)學和產(chǎn)量上的變化,表達MsrA1的轉基因煙草也同樣表現(xiàn)出廣譜抗菌活性和正常的形態(tài),并具有遺傳穩(wěn)定性.由此說明,模擬性損害的出現(xiàn)

17、與植物種類有關.4抗茵肽在中藥生物工程中的應用前景自2O世紀9O年代初首次報道在煙草和馬鈴薯中進行轉抗菌肽基因研究以來,迄今已在多種植物中實現(xiàn)了外源抗菌肽的表達,其蛋白提取液具有抗微生物活性,而且已有轉抗菌肽基因植物在田問種植時仍具有抗菌活性的報道.因此,利用生物技術將外源抗菌肽基因轉入中藥植株中,賦予其有利的遺傳特性,在中藥的種植和中藥新品種的開發(fā)上具有誘人的前景.一方面,利用外源抗菌肽培養(yǎng)出中藥抗病新品種,可減少農(nóng)藥的施用,將有利于實現(xiàn)中藥的規(guī)范化種植和”綠色藥材”的生產(chǎn).目前,抗菌肽基因轉化中藥植株培養(yǎng)抗病新品種的研究已有報道.為提高廣藿香植株抗病能力,防治青枯病,張家明等將昆蟲抗菌肽天

18、蠶素B和D基因克隆到雙元表達載體pBinl9上,構建成雙價抗菌肽基因表達載體,通過農(nóng)桿菌介導轉化廣藿香,獲得的轉基因植株在與病原菌假單胞菌PseudomonassolanacearumYabuuchi的盆栽接菌試驗中表現(xiàn)出較強的抗病性233.另一方面,在轉基因中藥植株中表達外源抗菌肽,有可能獲得新增的活性成分.抗菌肽被稱為天然抗生素24,特別對一些難治性疾病的病原微生物,如愛滋病毒,皰疹病毒,肝炎病毒等具有抑制作用,某些抗菌肽還能特異性地抑制腫瘤細胞的生長,而對正常細胞無害.此外,抗菌肽還具有免疫調節(jié),免疫增強活性,能促進傷口愈合,其藥用價值不言而喻,某些抗菌肽已進入臨床試驗階段.但天然抗菌肽

19、來源極為有限,化學合成的成本很高,不適于大規(guī)模生產(chǎn),且由于抗菌肽的抗菌活性,應用基因工程技術在微生物中成功表達抗菌肽的例子很少.植物反應器具有上游生產(chǎn)成本(包括發(fā)酵生產(chǎn))較低,轉基因植物自交后得到的同質后代的新遺傳性狀穩(wěn)定遺傳的特點,因此將具有臨床應用價值的抗菌肽在中藥植株中表達,有可能作為中藥材的一種有效成分,增強中藥的抗炎活性而提高藥效,可用于中藥新產(chǎn)品的開發(fā),同時省去了下游加工成本.此外,可在中藥有效成分離提取工藝中獲得抗菌肽,開發(fā)抗菌肽的藥用價值.5存在問題綜上所述,抗菌肽的轉基因植物研究已取得一定進展,外源抗菌肽已在多種植物(包括藥用植物)體內實現(xiàn)了表達,并獲得了抗病性增強的轉基因植

20、株.根據(jù)現(xiàn)有研究,某種抗菌肽在不同植物中表達時,其表達量,穩(wěn)定性和對植物生長的影響具有差異性.提高外源抗菌肽在植物體內的表達量和活性是獲得抗病植株的關鍵.已有研究表明,多聚蛋白表達策略可能有利于小分子多肽的表達,融合表達的融合肽往往具有各融合部分的優(yōu)點.而構建多價表達載體使不同的抗菌肽在同一植物體內同時表達,有可能使抗菌肽之間發(fā)揮協(xié)同作用而表現(xiàn)出更強的抗菌活性.由于不同抗菌肽在不同植物中的穩(wěn)定性不同,在細胞內與細胞外的穩(wěn)定性也不同,還要針對植物和抗菌肽的特性選擇胞內表達或胞外表達等合適的表達方式,以保持抗菌肽的抑菌濃度.雖然某些抗菌肽尚未表現(xiàn)出對植物細胞的毒性,某些抗菌肽對哺乳動物細胞無毒或毒

21、性極低,但目前在中藥植株中表達抗菌肽的研究還極為有限,外源抗菌肽對中藥品質和原有藥效是否有影響尚需深入研究.References:1HancockREW.PeptideantibioticsJ.1.amet,l997,349:418422,I2;GiacomettiA,CirioniO,BarcbieslF,Ptal,Antimicrobia1activityofpolycationicpeptidesJ.fJptides,1999,2O:12651273.13IPowersJPS,HancockREW.Fhere1ationshipbetweenpeptidestructureandanti

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