淺論ezrin和merlin基因在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其意義

1、淺論ezrin和merlin基因在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其意義         【摘要】  目的： 研究ezrin和merlin基因在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及其對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法： 應(yīng)用RTPCR與Western blotting 檢測(cè)ezrin和merlin基因在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞及胰腺癌細(xì)胞中的mRNA 和蛋白表達(dá)水平;利用脂質(zhì)體分別將ezrin和merlin基因轉(zhuǎn)染入SW1990細(xì)胞株中，應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、遷移實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染基因?qū)?xì)胞增殖、遷移和黏附能力，細(xì)胞周期及

2、凋亡的影響。結(jié)果： ezrin和merlin基因在8株細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)，其表達(dá)水平與胰腺癌細(xì)胞的分化程度無關(guān)。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染ezrin和merlin基因的SW1990細(xì)胞增殖速度緩慢(P0.01);細(xì)胞周期表現(xiàn)為G1 期細(xì)胞增多,S期細(xì)胞減少(均P0.05);細(xì)胞與基質(zhì)的黏附能力明顯下降(P0.01);且轉(zhuǎn)染merlin的SW1990細(xì)胞其遷移能力亦有明顯降低(P0.05),而轉(zhuǎn)染ezrin的SW1990細(xì)胞其遷移能力無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變(P0.05)。結(jié)論： ezrin和merlin蛋白在胰腺癌細(xì)胞增殖、進(jìn)展過程中可能發(fā)揮著負(fù)性調(diào)節(jié)作用。 【關(guān)鍵詞】  胰腺癌; ez

3、rin基因; merlin基因; 增殖; 遷移ezrin蛋白是埃茲蛋白、根蛋白和膜突蛋白(ezrinradixinmoesin, ERM)家族成員之一, 與merlin蛋白同屬于4.1 蛋白超家族成員。人ERM 之間有75%80% 的同源性,人merlin 與ERM蛋白僅有45% 的同源性1。ezrin與merlin蛋白主要定位于與細(xì)胞骨架重塑有關(guān)的區(qū)域，如細(xì)胞膜的皺褶、動(dòng)力微絲以及卵裂溝等部位，主要參與上皮細(xì)胞中細(xì)胞骨架與胞膜之間的連接，具有維持細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)、連接黏附分子及調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。大量研究表明,ezrin蛋白作為近年在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移研究中的相關(guān)蛋白，在很多腫瘤組織中都有異常表達(dá)

4、,并與促腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。merlin蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制作用的蛋白質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)其編碼基因發(fā)生突變時(shí)，merlin蛋白失活, 其生長(zhǎng)抑制功能喪失, 最終導(dǎo)致腫瘤的形成。關(guān)于ezrin和merlin蛋白在胰腺癌中的研究，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)的研究目的是通過觀察ezrin和merlin蛋白在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，來探討它們之間可能存在的關(guān)系，以及分別轉(zhuǎn)染野生型ezrin和merlin基因后各自對(duì)對(duì)方的影響和對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，為以后這兩種蛋白的臨床應(yīng)用打下一定的基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 細(xì)胞系和質(zhì)粒 人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE和人胰腺癌細(xì)胞系COLO35

5、7、SW1990、PANC1、CAPAN1、CAPAN2、CFPAC1和BXPC3為本實(shí)驗(yàn)室所保存，用含有10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。pcDNA3.1+HA、pcDNA3.1+HAezrin和pcDNA3.1+HAmerlin質(zhì)粒由德國(guó)美因茨大學(xué)蘇占海博士惠贈(zèng)。1.1.2 試劑 質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Qiagen公司;逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RTPCR)試劑盒購(gòu)自Toyobo公司;鼠抗人ezrin單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotech公司;兔抗人merlin單克隆抗體及鼠抗人HA單克隆抗體購(gòu)自Cell Si

6、gnaling Tech公司;G418購(gòu)自Sigma公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000及Trizol購(gòu)自Invitrogen公司。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測(cè)ezrin和merlin基因mRNA表達(dá)水平 Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA ,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。取2 l質(zhì)粒行PCR反應(yīng)。ezrin基因引物：上游為5ATGCCGAAACCAATCAATGT3，下游為5GGCCAAAGTACCACACTTCC3,擴(kuò)增片段大小為139 bp。merlin基因引物：上游為5ACCGTTGCCTCCTGACATAC3，下游為5GGCCTCGATTTCTG

7、TCTTGA3,擴(kuò)增片段大小為178 bp。G3PDH基因引物：上游為5ACCACAGTCCATGCCATCAC3，下游為5TCCACCACCCTGTTGCTGTA3,擴(kuò)增片段大小為450 bp。引物根據(jù)GenBank中所查到的ezrin和merlin全基因序列應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成。PCR反應(yīng)體系50 l。反應(yīng)條件：94 預(yù)變性2 min;98 變性10 s，45 (ezrin)/47 (merlin)/60 (G3PDH)退火30 s，68 延伸1 min，共33個(gè)循環(huán);68 延伸10 min。取4 l產(chǎn)物2.0%瓊脂糖凝膠電泳

8、、照相。1.2.2 Western blotting檢測(cè)ezrin和merlin蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的8株細(xì)胞(HPDE、COLO357、SW1990、PANC1、CAPAN1、CAPAN2、CFPAC1和BXPC3)和3株轉(zhuǎn)染后細(xì)胞(SW1990HA、SW1990ezrin和SW1990merlin)，提取總蛋白質(zhì),樣品蛋白濃度測(cè)定按試劑盒說明書進(jìn)行,每泳道加40 g總蛋白行SDSPAGE 蛋白電泳并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜;一抗分別為鼠抗人ezrin單克隆抗體、兔抗人merlin單克隆抗體 (11 500)和抗人actin多克隆抗體(13 000) , 4 孵育過夜;漂洗后滴加HRP標(biāo)記的二

9、抗(110 000)室溫孵育2 h,以ECL試劑盒顯色,Western blotting檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用BIORAD公司的Quantitive one軟件進(jìn)行分析,計(jì)算條帶的光密度比值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 在6孔板中每孔接種3×105個(gè)SW1990細(xì)胞，培養(yǎng)至生長(zhǎng)密度為80%時(shí)，用脂質(zhì)體按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分未轉(zhuǎn)染組(空白對(duì)照組)、轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒組(陰性對(duì)照組)和轉(zhuǎn)染陽(yáng)性質(zhì)粒組。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，換含500 g·ml-1 G418的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，7 d后空白對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，換含100 g·ml-1 G418的選擇培養(yǎng)基維持篩選至細(xì)胞密度達(dá)到70

10、%80%時(shí)，轉(zhuǎn)至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。1.2.4 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖 分別選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4組細(xì)胞(SW1990、SW1990HA、SW1990ezrin和SW1990merlin)，以5×103孔-1的細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中。分別在培養(yǎng)1、2、3、4 d后，每孔加入MTT溶液(5 mg·ml-1)20 l,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，吸干孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 l DMSO，震蕩至結(jié)晶充分溶解，選擇492 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度(A)值。以時(shí)間為橫軸，細(xì)胞增殖率(=A實(shí)驗(yàn)組/A空白對(duì)照組 ×100%)為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。1.2.5 流式細(xì)

11、胞儀分析細(xì)胞周期 分別選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4組細(xì)胞，用70%乙醇溶液于-20 固定過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2遍，依次加入50 g·ml-1碘化丙啶和1 mg·ml-1RNase A，室溫避光孵育30 min后上機(jī)檢測(cè)。1.2.6 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 分別選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4組細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，Transwell(購(gòu)自美國(guó)BD公司，孔徑為8 m)上室加入細(xì)胞密度為1×105 ml-1含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基200 l，24孔板下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基500 l，培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后棄去室內(nèi)培養(yǎng)液，PBS沖洗2遍，用棉簽輕輕擦去基底膜上室細(xì)胞，

12、按95%乙醇15 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min程序固定，再用蘇木精染色5 min，伊紅染色30 s，清水沖洗3遍，晾干后于高倍鏡下(×400)計(jì)數(shù)細(xì)胞并拍照。每組做3次，取均值。1.2.7 細(xì)胞基質(zhì)黏附實(shí)驗(yàn) 按照司徒鎮(zhèn)強(qiáng)等的方法進(jìn)行操作。分別用未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(SW1990)、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(SW1990HA)和轉(zhuǎn)染組細(xì)胞(SW1990ezrin和SW1990merlin)按2×104孔-1接種于包被有質(zhì)量濃度為50 g·ml-1 Matrigel 的96 孔培養(yǎng)板, 每組設(shè)置4個(gè)平行孔, 用RPMI1640 完全培養(yǎng)基置于37 、5%CO2培

13、養(yǎng)箱內(nèi)孵育。分別在培養(yǎng)1 h和2 h后，按MTT比色法測(cè)定各孔細(xì)胞的光吸收值(A值)，按以下公式計(jì)算黏附率黏附率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A空白對(duì)照組 ×100%。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)值用x-±s表示,應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)，以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 ezrin和merlin基因在不同細(xì)胞中的mRNA表達(dá)情況電泳結(jié)果顯示，在所檢測(cè)的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞(HPDE)和7種不同胰腺癌細(xì)胞中均有3條特異性擴(kuò)增條帶,且條帶位置與預(yù)期相符。ezrin mRNA在PANC1、CAPAN1和HPDE細(xì)胞中具有較高的表達(dá)水平，在SW1990細(xì)胞中中度表達(dá)

14、，在COLO357、CFPAC1、BXPC3和CAPAN2細(xì)胞中表達(dá)水平偏低。merlin mRNA表達(dá)水平在COLO357、HPDE、PANC1和CAPAN2細(xì)胞中表達(dá)較高，在SW1990、CAPAN1、CFPAC1和BXPC3表達(dá)較低(圖1)。         圖1 ezrin和merlin基因的mRNA在細(xì)胞中的表達(dá)2.2 ezrin、merlin蛋白在胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和不同胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)情況Western blotting 結(jié)果顯示，ezrin蛋白在PANC1、CAPAN1和HPDE細(xì)胞中具有較高的表達(dá)水

15、平，在COLO357、SW1990、CFPAC1和BXPC3細(xì)胞中中度表達(dá)，在CAPAN2細(xì)胞中表達(dá)水平較低。merlin蛋白除在CAPAN1和BXPC3細(xì)胞中表達(dá)水平稍低外，在HPDE和COLO357、SW1990、PANC1、CAPAN2、CFPAC1細(xì)胞中均有較高的表達(dá)水平。ezrin和merlin蛋白表達(dá)情況在正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和惡性胰腺癌細(xì)胞中無明顯的差異，且其表達(dá)水平與胰腺癌細(xì)胞的分化程度無關(guān)(圖2)。2.3 轉(zhuǎn)染前后SW1990細(xì)胞ezrin和merlin蛋白表達(dá)水平的變化Western blotting 結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，陽(yáng)性質(zhì)粒(pcDNA3.1+H

16、Aezrin)轉(zhuǎn)染組(SW1990ezrin)ezrin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.01)，而merlin蛋白表達(dá)情況無明顯差異(P0.05)。同樣，陽(yáng)性質(zhì)粒(pcDNA3.1+HAmerlin)轉(zhuǎn)染組(SW1990merlin)merlin蛋白表達(dá)水平明顯升高(P0.01)，而ezrin蛋白表達(dá)情況無明顯差異(P0.05)(圖3)。2.4 ezrin和merlin蛋白抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)MTT結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染組(SW1990)和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(SW1990HA)相比，陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(SW1990ezrin和SW1990merlin)細(xì)胞增殖受到明顯抑制，細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯下降(P0.01

17、)，且merlin蛋白比ezrin蛋白有更強(qiáng)的作用效果(P0.05), 未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比無明顯差異(P0.01)(圖4)。圖4 轉(zhuǎn)染前后SW1990細(xì)胞增殖能力的變化2.5 ezrin和merlin基因轉(zhuǎn)染對(duì)SW1990細(xì)胞周期和凋亡的影響流式細(xì)胞儀分析顯示，與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染ezrin和merlin基因后的細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加(P0.05)，S期比例減少(P0.05)，且merlin較ezrin基因?qū)?xì)胞周期的影響要強(qiáng);轉(zhuǎn)染基因?qū)D(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡無明顯的影響。表1 ezrin和merlin基因轉(zhuǎn)染前后SW1990細(xì)胞周期分布和凋亡的變化2.6 ezr

18、in和merlin蛋白的過度表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移能力的影響顯微鏡下對(duì)轉(zhuǎn)移到Transwell小室膜另一側(cè)的細(xì)胞觀察計(jì)數(shù)，未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞SW1990、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞SW1990HA、陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞SW1990ezrin和SW1990merlin細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)分別為32.53±3.74、31.67±3.98、29.73±2.37和7.93±1.01，轉(zhuǎn)染ezrin基因后的細(xì)胞其遷移能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的改變(P0.05),而轉(zhuǎn)染merlin基因后的細(xì)胞其遷移能力明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.7 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞SW1990ezrin和SW1990mer

19、lin較SW1990細(xì)胞與基質(zhì)黏附能力下降通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞SW1990ezrin和SW1990merlin與基質(zhì)黏附能力在60 min和120 min均有明顯下降(P0.01)，而未轉(zhuǎn)染組和空白對(duì)照組之間細(xì)胞黏附率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),轉(zhuǎn)染組細(xì)胞SW1990ezrin和SW1990merlin之間，基質(zhì)黏附能力亦無明顯差異(P0.05)(圖5)。圖5 轉(zhuǎn)染前后SW1990細(xì)胞基質(zhì)粘附能力的變化3 討 論ezrin和merlin同為細(xì)胞骨架蛋白，其結(jié)構(gòu)具有較高的同源性，均包含氨基端球形膜結(jié)合區(qū)(FERM)、伸長(zhǎng)的螺旋區(qū)、帶正電的羧基末端3個(gè)結(jié)

20、構(gòu)域，所不同的是merlin蛋白羧基端缺少F肌動(dòng)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。盡管存在著結(jié)構(gòu)上的同源性，但關(guān)于它們兩者在腫瘤中的研究顯示，它們可能各自發(fā)揮著不同的功能，甚至可相互競(jìng)爭(zhēng)抑制，發(fā)揮相反的功能。ezrin蛋白的表達(dá)水平與多種惡性腫瘤的分化程度、惡性程度及侵襲存在著聯(lián)系，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、肝癌、胃癌等，在許多類型的惡性腫瘤中存在著突變和表達(dá)異常。研究發(fā)現(xiàn),ezrin蛋白在高度惡性骨肉瘤中的表達(dá)水平比低度惡性骨肉瘤高3倍，而在卵巢癌中其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度成負(fù)相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，通過降低ezrin蛋白在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力明顯下降，而ezrin蛋白在結(jié)直腸

21、癌上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平受到抑制后，可增加腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。關(guān)于ezrin蛋白研究發(fā)現(xiàn)，在不同的細(xì)胞和組織類型中其發(fā)揮的作用也不盡相同，其功能很可能具有細(xì)胞和組織特異性。Akisawa等10在1999年的研究發(fā)現(xiàn)，ezrin蛋白的高表達(dá)預(yù)示著胰腺癌細(xì)胞具有更高的轉(zhuǎn)移能力。而在本實(shí)驗(yàn)，通過基因轉(zhuǎn)染使胰腺癌細(xì)胞SW1990過表達(dá)ezrin蛋白后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后腫瘤細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，遷移能力并無明顯的升高。ezrin蛋白發(fā)揮作用主要是通過磷酸化激活后產(chǎn)生，所以我們考慮轉(zhuǎn)染ezrin基因后的細(xì)胞，其遷移能力無明顯改變的原因可能是由于ezrin總蛋白水平提高，而磷酸化的水平并無明顯改變所引起的。然而，值得一提的是，在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞SW1990ezrin與未轉(zhuǎn)染組和空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，其與基質(zhì)的黏附能力卻表現(xiàn)出了明顯的下降，這應(yīng)該是有活性的ezrin蛋白發(fā)揮作用引起的。針對(duì)以上的研究情況，我們提出以下三種可能：1)ezrin蛋白是作為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)相關(guān)蛋白的下游效應(yīng)因子存在，它可被細(xì)