重組人次級(jí)淋巴組織趨化因子（SLC）體外活性的研究

1、重組人次級(jí)淋巴組織趨化因子（SLC）體外活性的研究                      作者：劉明學(xué), 尹長城, 春雷, 李瓊芳, 黃華樑【摘要】  目的: 對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)E.coli中表達(dá)的SLC進(jìn)行體外活性的研究, 為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供。方法: 采用Boyden小室測定趨化活性。結(jié)果: 對(duì)含有pALMSLC質(zhì)粒的E.coli菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá), 產(chǎn)物經(jīng)SDS

2、PAGE鑒定, 表達(dá)產(chǎn)物以可溶蛋白為主, 相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)在20 000左右。采用表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行趨化性測定結(jié)果表明, 此蛋白對(duì)新鮮分離的外周血淋巴細(xì)胞具有明顯的趨化作用, 其濃度為46 g/L時(shí)對(duì)淋巴細(xì)胞的趨化指數(shù)最高可達(dá)2.3, 與國外報(bào)道相比, 趨化作用有效濃度更低。結(jié)論: 獲得了具有生物學(xué)功能的重組SLC蛋白。 【關(guān)鍵詞】  次級(jí)淋巴組織趨化因子; 體外活性; 趨化作用    次級(jí)淋巴組織趨化因子(secondary lymphoidtissue chemokine,  SLC)是全長134個(gè)氨基酸的高度堿性的CC亞族趨化因子。SLC是

3、一種介導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)入外周淋巴器官的趨化因子,  同時(shí)對(duì)成熟樹突狀細(xì)胞 (dendritic cell,  DC)、  B淋巴細(xì)胞也有強(qiáng)的趨化能力1。對(duì)SLC的抗腫瘤活性研究表明其具有良好的應(yīng)用前景。Sharma等2發(fā)現(xiàn)在腫瘤內(nèi)注射重組的SLC可消除40%的實(shí)驗(yàn)鼠的肺癌腫瘤。馬飛等3, 4研究發(fā)現(xiàn)SLC 基因轉(zhuǎn)染并沒有降低細(xì)胞的致瘤性,  但是移植瘤的生長明顯慢于野生型惡性黑色素瘤細(xì)胞移植瘤的生長。因此認(rèn)為SLC 基因轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。Qin等5將人前列腺特異的細(xì)胞膜抗原 (hPSM),  鼠前列腺酸性磷酸酶(mPAP), 

4、; 人前列腺特異抗原(hPSA)DNA片段連接在一起形成3P基因。然后把SLC,  3P和人IgG Fc基因插入到pcDNA3.1 形成一DNA疫苗,  稱為pSLC3PFc。接種后DNA被細(xì)胞吸收并產(chǎn)生SLC3PFc融合蛋白,  其可以產(chǎn)生強(qiáng)的抗腫瘤反應(yīng)。Liang等6利用腺相關(guān)病毒重組載體（rAAVSLC）進(jìn)行肝細(xì)胞癌動(dòng)物實(shí)驗(yàn),  發(fā)現(xiàn)rAAVSLC能夠明顯的抑制腫瘤生長。He等7的實(shí)驗(yàn)表明SLC與IL2和GMCSF聯(lián)合使用時(shí)可誘發(fā)強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)。另外還發(fā)現(xiàn)SLC在損傷修復(fù)及腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用8, 9。本研究前期采用重疊PCR的方法合成了全長

5、的人SLC DNA片段,  并構(gòu)建了表達(dá)載體,  經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot鑒定,  確定所表達(dá)蛋白即為目的蛋白10。在此研究中對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行體外活性的研究,  為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。    1  材料和方法    1.1  材料  pALMSLC質(zhì)粒載體由本試驗(yàn)室構(gòu)建; NiNTA購自NAVOGEN公司; rhSLC標(biāo)準(zhǔn)品購自R&D System 公司; 淋巴細(xì)胞分離液購自華美公司; Baso劉氏染料購自珠海Baso公司; 其余常

6、用試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。12孔趨化性測定板(12well chemotaxis plate )購自Neuro Probe,  Inc 公司; 5 m孔徑無PVP聚碳酸酯膜（Polyvinylpyrrolidonefree filter）購自Neuro Probe,  Inc公司; CO2培養(yǎng)箱為Forma Scientific產(chǎn)品。    1.2  方法    1.2.1  質(zhì)粒pALMSLC在GI724中的表達(dá)  將含有SLC基因的重組質(zhì)粒pALMSLC,  轉(zhuǎn)化大腸桿

7、菌GI724,  挑取單克隆菌30過夜培養(yǎng),  次日以150的比例接種于50 mL RM培養(yǎng)基中30放大培養(yǎng),  然后以150的比例轉(zhuǎn)接于2 L RM培養(yǎng)基中,  于30生長至A600=0.50.7,  再以1100的比例加入Trp于37誘導(dǎo)表達(dá)4 h后,  離心收集菌體。在收獲的菌體中加入適量的超聲緩沖液用高壓細(xì)胞破碎儀（600bar）破碎菌體。高速離心（8 000 r/min, 離心40 min）分離上清和沉淀備用。上清用NiNTA親和層析。    1.2.2  趨化性測定  外周

8、血淋巴細(xì)胞分離: 采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離。聚碳酸酯膜的預(yù)處理: 在聚碳酸酯膜面向趨化物質(zhì)的一面覆蓋上5 g/L四型膠原蛋白。趨化活性測定采用Boyden小室法,  簡述如下: (1)在趨化性測定板底板每孔加入 160 L不同濃度的待測液及對(duì)照,  在本研究中,  用PBS稀釋樣品,  因此采用PBS作為對(duì)照; (2)在上層板每孔加滿細(xì)胞液（130 L）,  細(xì)胞總量約105; 將加了細(xì)胞液的趨化性板在37含5 mL/L CO2,  飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育3 h; (3)孵育結(jié)束后用吸水紙吸去上孔的培養(yǎng)液, 

9、 取下濾膜,  固定兩側(cè)后在清水中漂洗沒有遷移細(xì)胞的一面,  再用橡皮刷輕輕刷去沒有遷移的細(xì)胞; (4)將濾膜的光面向上置于載玻片上,  用700    mL/L甲醇固定10 min,  用Baso劉氏染料染色,  將膜放在玻片上晾干,  在高倍鏡下進(jìn)行細(xì)胞記數(shù),  隨意選取5個(gè)視野,  計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù),  然后求每個(gè)視野的平均細(xì)胞個(gè)數(shù); (5)趨化指數(shù)（chemotactic index,  CI）的: 趨化指數(shù)CI=遷移到待測樣品孔細(xì)胞數(shù)/遷移到對(duì)照孔的細(xì)胞數(shù)。&

10、#160;   2  實(shí)驗(yàn)結(jié)果    2.1  重組人SLC在原核系統(tǒng)中的表達(dá)  pALM是由pAL781改造來的,  含PL啟動(dòng)子,  將SLC序列克隆至pALM載體中后,  經(jīng)PCR鑒定,  陽性克隆經(jīng)測序分析,  正確的克隆轉(zhuǎn)化GI724,  依常規(guī)程序在30誘導(dǎo)表達(dá),  電泳結(jié)果如圖1所示,  可見表達(dá)產(chǎn)物以可溶蛋白為主,  相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）20 000左右。親和層析純化后電泳結(jié)果表明純化產(chǎn)物純度達(dá)到90%以上。&

11、#160;   圖1  SLC在E.coli中表達(dá)的電泳結(jié)果    1,  2: 分別為空載體的上清和沉淀; 3,  4: 分別為含pALMSLC質(zhì)粒菌體的上清和沉淀; M: 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)記;  : SLC.    2.2  重組人SLC標(biāo)準(zhǔn)品的趨化結(jié)果  為了比較本研究中表達(dá)的SLC的體外活性作用,  采用R&D公司生產(chǎn)的rhSLC作為陽性對(duì)照,  以SLC的稀釋溶劑PBS和BSA（牛血清白蛋白）作為陰性對(duì)照, 

12、從統(tǒng)計(jì)的結(jié)果來看rhSLC對(duì)淋巴細(xì)胞趨化指數(shù)較高,  而對(duì)單核細(xì)胞和多形核細(xì)胞幾乎沒有趨化作用。細(xì)菌內(nèi)毒素LPS可以激活巨噬細(xì)胞,  誘導(dǎo)單核細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子11,  為了排除SLC的活性是由細(xì)菌內(nèi)毒素LPS引起的,  做了LPS的趨化性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LPS對(duì)單核細(xì)胞遠(yuǎn)較對(duì)淋巴細(xì)胞和多形核細(xì)胞趨化性強(qiáng),  其對(duì)單核細(xì)胞的最大趨化指數(shù)在10100 mg/L之間。    2.3  樣品的趨化結(jié)果  對(duì)含pALMSLC質(zhì)粒的E.coli菌體進(jìn)行高壓細(xì)胞破碎,  離心分離沉淀和上清,&#

13、160; 對(duì)上清采用NiNTA親和層析純化。上清與純化樣品在趨化活性上相比較,  在總細(xì)胞趨化指數(shù)上兩者相差不大; 純化樣品對(duì)淋巴細(xì)胞的趨化指數(shù)比上清對(duì)淋巴細(xì)胞的趨化指數(shù)高35倍; 純化樣品對(duì)單核細(xì)胞和多形核細(xì)胞幾乎沒有趨化活性,  但上清對(duì)這兩類細(xì)胞的趨化指數(shù)都在415之間。    2.4  趨化活性的最佳濃度結(jié)果  由于趨化因子作用濃度極低,  為了確定SLC趨化作用的最佳濃度,  于是設(shè)計(jì)了梯度稀釋實(shí)驗(yàn)。從圖2可看出,  SLC對(duì)PBL的最大趨化活性在0.0040.006 mg/L之間。方

14、差分析數(shù)據(jù)都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。    圖2  純化SLC對(duì)外周血淋巴細(xì)胞的趨化活性結(jié)果1             3  討論    趨化因子最基本的功能是引起特定細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng),  但只有一定劑量范圍的趨化因子才有趨化作用。對(duì)其活性的檢測可采用體內(nèi)和體外2種方法。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)較繁瑣; 體外實(shí)驗(yàn)中最常用的方法是Boyden小室法。在用pALMSLC表達(dá)載體表達(dá)的SLC所做的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上

15、清與純化蛋白趨化的細(xì)胞類型不同,  上清趨化的細(xì)胞類型中除了淋巴細(xì)胞外,  還含有大量的單核細(xì)胞和多形核細(xì)胞,  但純化蛋白趨化的細(xì)胞類型中幾乎全是淋巴細(xì)胞。從數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)來看,  其數(shù)據(jù)差異較大,  但都在均值附近,  從方差分析結(jié)果來看,  P均<0.05,  因此組間差異是明顯的。為了確證SLC的功能所做的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)與對(duì)照實(shí)驗(yàn),  其數(shù)據(jù)也都經(jīng)方差分析,  結(jié)果顯示: 各組實(shí)驗(yàn)中,  對(duì)單核細(xì)胞和多形核細(xì)胞的趨化指數(shù)方差分析結(jié)果都不具有明顯性（P>0.05）, 

16、產(chǎn)生這一結(jié)果的原因是由于在各次實(shí)驗(yàn)中,  單核細(xì)胞與多形核細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)比例很小,  因此統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)差異十分大,  從而導(dǎo)致組內(nèi)均差很大。LPS對(duì)總細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的趨化結(jié)果經(jīng)方差分析沒有差異明顯性,  說明LPS對(duì)淋巴細(xì)胞沒有趨化作用; 而陽性對(duì)照SLC對(duì)淋巴細(xì)胞的趨化結(jié)果數(shù)據(jù)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,  即趨化活性是與濃度相關(guān)的。最后用純化的SLC做濃度梯度實(shí)驗(yàn),  所得數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。    為了證明本研究所表達(dá)的SLC是有活性的,  把其趨化性與陽

17、性重組SLC的結(jié)果相比較,  發(fā)現(xiàn)它們都對(duì)淋巴細(xì)胞具有強(qiáng)的趨化作用,  而對(duì)單核細(xì)胞和多形核細(xì)胞幾乎沒有趨化作用。細(xì)菌內(nèi)毒素LPS可以激活巨噬細(xì)胞,  誘導(dǎo)單核細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子11,  為了排除本研究所表達(dá)的SLC的活性是由細(xì)菌內(nèi)毒素LPS引起的,  本研究又做了LPS的趨化性實(shí)驗(yàn),  發(fā)現(xiàn)LPS主要對(duì)單核細(xì)胞發(fā)生趨化作用,  對(duì)淋巴細(xì)胞的趨化作用不強(qiáng)。所以SLC的作用不是由LPS所引起的。從其他陰性與無關(guān)對(duì)照實(shí)驗(yàn)來看,  SLC的作用不是細(xì)菌的一些組成成分發(fā)揮的作用,  而的確是SLC的趨化作用。綜上

18、所述,  可以認(rèn)為本研究所表達(dá)的SLC是有趨化活性的。    從已發(fā)表的文章中所得出的數(shù)據(jù)來看12,  SLC發(fā)揮體外的趨化活性的濃度一般都是在g/L級(jí),  從本研究的結(jié)果來看,  最大趨化活性在46 g/L的水平,  這與他們的水平相一致,  但作用有效濃度更低,  例如,  Nagira等12達(dá)到最大趨化指數(shù)時(shí)SLC作用濃度為15 g/L。在用純化的SLC做濃度梯度實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),  在濃度達(dá)到40400 g/L的濃度時(shí),  趨化活性反而下降,  表現(xiàn)為抑制

19、效果。這也與其他人的研究相一致。【】  1 Gunn MD, Kyuwa S, Tam C, et al. Mice lacking expression of secondary lymphoid organ chemokine have defects in lymphocyte homing and dendritic cell localizationJ. J Exp Med, 1999, 189 (3): 451-460.2 Sharma S, Stolina M, Luo J, et al. Secondary lymphoid tissue chemokine medi

20、ates T celldependent antitumor responses in vivoJ. J Immunol, 2000, 164(9): 4558-4563.3 馬 飛, 孫文欣, 張叔人, 等. 次級(jí)淋巴組織趨化因子基因轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的影響J. 免疫學(xué)雜志, 2005, 21(5): 362-365.4 Kirk CJ, HartiganOConnor D, Nickoloff BJ, et al. T celldependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokin

21、e: augmentation of dendritic cellbased immunotherapyJ. Cancer Res, 2001, 61(5): 2062-2070.5 Qin H, Zhou C, Wang D, et al. Enhancement of antitumour immunity by a novel chemotactic antigen DNA vaccine encoding chemokines and multiepitopes of prostatetumourassociated antigensJ. Immunology, 2006, 117(3

22、): 419-430.6 Liang CM, Zhong CP, Sun RX, et al. Local expression of secondary lymphoid tissue chemokine delivered by adenoassociated virus within the tumor bed stimulates strong antiliver tumor immunityJ. J Virol, 2007, 81(17): 9502-9511.7 He YF, Zhang GM, Wang XH, et al. Blocking programmed death1 ligandPD1 interactions by local gene therapy reslts in enhancement of antitumor effect of secondary lymphoid tissue chemokineJ. J Immunol, 2004, 173(8): 4919-4928.8 Sasaki M, Ab