蛋白質(zhì)的定量測(cè)定一——雙縮脲法ppt課件

1、 浙江中醫(yī)藥大學(xué)浙江中醫(yī)藥大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定 引言：蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其他生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要目的，也是許多生物制品，藥物、食質(zhì)量量檢測(cè)的重要目的。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)展準(zhǔn)確可靠的定量分析，那么是經(jīng)常進(jìn)展的一項(xiàng)非常重要的任務(wù)。v 目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法：v物理性質(zhì)：紫外分光光度法。v化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法等。v染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法。v其他性質(zhì)：免疫比濁法。蛋白質(zhì)的

2、定量測(cè)定雙縮脲法v實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊髒 1、學(xué)習(xí)分光光度法原理，了解分光光度計(jì)的構(gòu)造。v 2、掌握雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理及方法。v 3、了解規(guī)范曲線的制造方法及其在物質(zhì)定量測(cè)定中的運(yùn)用。分光光度法原理 分光光度法，常被用來(lái)測(cè)定溶液中存在的光吸收物質(zhì)的濃度，其根本原理是根據(jù)Lambert和Beer定律。 Lambert定律 v 一束平行單色光垂直照射于一均勻物質(zhì)溶液時(shí)，由于溶液吸收一部分光能，使光的強(qiáng)度減弱，假設(shè)溶液的濃度不變，那么溶液的厚度愈大，光線強(qiáng)度的減弱也愈顯著。v 設(shè)：入射光強(qiáng)度為I0 L表示溶液的厚度即光程 出射光透過(guò)光強(qiáng)度為Iv根據(jù)輻射能實(shí)際推導(dǎo)， I0與I之間關(guān)系為v lg I0

3、 /I = K1L 1v K1是常數(shù)，受光線波長(zhǎng)、溶液性質(zhì)、溶液濃度的影響。 Beer定律 v 當(dāng)一束單色光經(jīng)過(guò)一溶液時(shí)，光能被溶液介質(zhì)吸收一部分，假設(shè)溶液的厚度不變，那么溶液濃度C愈大，光吸收愈大，透射光線強(qiáng)度的減弱也愈顯著，光強(qiáng)度減弱的量與溶液濃度添加量成正比v lg I0 /I = K2C 2v K2為吸收系數(shù)，是常數(shù)，溶液對(duì)光吸收的大小與溶液濃度C成正比。 Lambert-Beer定律又稱吸收定律 v上二式合并即l與2合并v lg I0 /I = CL v令A(yù)= lg I0 /I ， T= I / I0 ；那么 A=CL， A=-lgT 。v T為透光率，A為吸光度光密度、消光度。v

4、其中為常數(shù)，又稱消光系數(shù)extinction coefficient，表示物質(zhì)對(duì)光線吸收的才干，其值因物質(zhì)種類和光線波長(zhǎng)而異。對(duì)于一樣物質(zhì)和一樣波長(zhǎng)的單色光那么消光系數(shù)不變。分光光度計(jì)的構(gòu)造分光光度計(jì)的構(gòu)造 v光源：鎢燈和氫燈或氘燈光源：鎢燈和氫燈或氘燈 v單色器單色器 ：分解為單一波長(zhǎng)光的安裝：分解為單一波長(zhǎng)光的安裝 v狹縫：調(diào)理入射單色光的強(qiáng)度，構(gòu)成平行狹縫：調(diào)理入射單色光的強(qiáng)度，構(gòu)成平行光光 線線 v吸收池：又稱比色杯、比色皿、比色池，吸收池：又稱比色杯、比色皿、比色池，裝待測(cè)溶液用裝待測(cè)溶液用 v檢測(cè)系統(tǒng)：感受光能，轉(zhuǎn)化為電能，輸出檢測(cè)系統(tǒng)：感受光能，轉(zhuǎn)化為電能，輸出A值、值、T值。值

5、。本室?guī)最惙止夤舛扔?jì)22PC型可見(jiàn)光分光光度計(jì) UNICO2000型 S54型紫外分光光度計(jì) UV8500型紫外分光光度計(jì) 比色杯比色皿玻璃比色杯 石英比色杯 熒光比色杯比色杯運(yùn)用本卷須知 1 、拿取比色皿時(shí)，只能用手指接觸兩側(cè)的毛玻璃，防止接觸光學(xué)面。2 、不得將光學(xué)面與硬物或臟物接觸。盛裝溶液時(shí)，高度為比色皿的2/3處即可，光學(xué)面如有殘液可先用濾紙悄然吸附，然后再用檫鏡紙擦拭。3、 比色皿在運(yùn)用后，應(yīng)立刻用水沖洗干凈。必要時(shí)可用1：1的鹽酸浸泡，然后用水沖洗干凈。4、 不能將比色皿放在火焰或電爐上進(jìn)展加熱或枯燥箱內(nèi)烘烤；5、 在丈量時(shí)如對(duì)比色皿有疑心，可自行檢測(cè)。 微量移液器v吸嘴裝在吸液

6、桿上，應(yīng)套牢防止間隙。v根據(jù)所需容量旋轉(zhuǎn)手輪，使數(shù)輪顯示所需值。v悄然地將推進(jìn)按鈕下壓，使推進(jìn)按鈕推移至第一停點(diǎn)位置。v手持取液器垂直浸入溶液中，吸嘴浸入深度為2-4mm，停留2-3秒后緩慢放松按鈕，即回到原來(lái)位置，溶液吸入后稍停即可將吸嘴移出液面。v將取液器吸嘴置于排液容器內(nèi)。使吸嘴尖緊貼容器內(nèi)壁，按壓推進(jìn)按鈕至第二停點(diǎn)位置，使溶液排盡，松開(kāi)按鈕。v移液終了，按壓卸嘴按鈕，將吸嘴脫卸。v【實(shí)驗(yàn)原理】【實(shí)驗(yàn)原理】v具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有具有兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵的化合物皆有雙縮脲反響，因此蛋白質(zhì)在堿性溶液中，雙縮脲反響，因此蛋白質(zhì)在堿性溶液中，也能與也能與Cu2+構(gòu)成紫紅色絡(luò)合物，顏色

7、構(gòu)成紫紅色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用來(lái)深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度。 v N HON HN HON HCCN HON HON HCC加 熱 1 8 0 Co+ N H2222223v紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子構(gòu)造為：紫紅色銅雙縮脲復(fù)合物分子構(gòu)造為： v v 但必需留意，此反響并非蛋白質(zhì)所特有，凡分子內(nèi)有兩個(gè)或兩個(gè)以上的肽鍵的化合物以及分子內(nèi)有H2NOC-NH -CONH2等構(gòu)造化合物，雙縮脲反響也呈陽(yáng)性。v v【實(shí)驗(yàn)資料】【實(shí)驗(yàn)資料】v 1試劑試劑v 1雙縮脲試劑：取雙縮脲試劑：取1.50g硫酸銅硫酸銅CuSO45H2O和和6.0g酒石酸

8、鉀鈉酒石酸鉀鈉NaKC4H4O64H2O，用，用500mL水溶解，水溶解，在攪拌下參與在攪拌下參與300mL 10氫氧化鈉溶液，氫氧化鈉溶液，1.0g KI；用水稀釋到；用水稀釋到1000mL，儲(chǔ)存于塑料，儲(chǔ)存于塑料瓶中或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中，避光保管。瓶中或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中，避光保管。此試劑可長(zhǎng)期保管。假設(shè)儲(chǔ)存瓶中有黑色或此試劑可長(zhǎng)期保管。假設(shè)儲(chǔ)存瓶中有黑色或暗紅色沉淀出現(xiàn)，那么需重新配制。暗紅色沉淀出現(xiàn)，那么需重新配制。v v2規(guī)范和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液：規(guī)范和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液：v1 規(guī)范蛋白溶液規(guī)范蛋白溶液 ：10mg/ml牛血潔白蛋牛血潔白蛋白溶液或一樣濃度的酪蛋白溶液用白溶液或一樣濃度的酪蛋

9、白溶液用0.05mol/L氫氧化鈉溶液配制。作為規(guī)范用氫氧化鈉溶液配制。作為規(guī)范用的蛋白質(zhì)要預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白的蛋白質(zhì)要預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度稱量，配制成規(guī)范溶液。質(zhì)含量，根據(jù)其純度稱量，配制成規(guī)范溶液。v2待測(cè)蛋白質(zhì)溶液待測(cè)蛋白質(zhì)溶液 ：測(cè)定血清等樣品時(shí)：測(cè)定血清等樣品時(shí)需做適當(dāng)稀釋，使其濃度在規(guī)范曲線測(cè)試范需做適當(dāng)稀釋，使其濃度在規(guī)范曲線測(cè)試范圍內(nèi)。圍內(nèi)。v3器材器材 v試管、試管架、刻度吸管、微量移液器、旋試管、試管架、刻度吸管、微量移液器、旋渦混合器、渦混合器、22PC型、型、UNICO2000型可見(jiàn)分型可見(jiàn)分光光度計(jì)、光光度計(jì)、S54型、型、UV-8

10、500型紫外分光光型紫外分光光度計(jì)。度計(jì)。v【實(shí)驗(yàn)方法】【實(shí)驗(yàn)方法】v1制造規(guī)范曲線制造規(guī)范曲線v 取取6支枯燥干凈試管編號(hào)，支枯燥干凈試管編號(hào)，按下表參與以下試劑：按下表參與以下試劑：v 加入物（ml） 012345標(biāo)準(zhǔn)蛋白液/ml 00.20.40.60.81.0蛋白濃度/(mg/ml) 02.04.06.08.010.0蒸餾水/ml 1.00.80.60.40.20.0雙縮脲試劑/ml 4.04.04.04.04.04.0充分混勻后，室溫下（2025）放置30min A540 v采用規(guī)范曲線法，即采用規(guī)范曲線法，即A540(540nm吸光度值吸光度值)為縱坐標(biāo)，蛋為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制規(guī)范曲線。白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制規(guī)范曲線。v2樣品測(cè)定樣品測(cè)定v 取取2支試管，參與待測(cè)樣品液各支試管，參與待測(cè)樣品液各1ml，參與雙縮脲試劑，參與雙縮脲試劑4ml，室溫下室溫下2025放置放置30min，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。v3.結(jié)果結(jié)果v由測(cè)得的吸光度在規(guī)范曲線上查得樣品濃度。以由測(cè)得的吸光度在規(guī)范曲線上查得樣品濃度。以mg/ml計(jì)。計(jì)。 v【本卷須知】【本卷須知】v1本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定范圍本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定范圍110mg/ml蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。 v2各管由顯色到比色的時(shí)間應(yīng)盡能夠一致。各管由顯色