一種高效可直接用于PCR擴(kuò)增的不吸水鏈霉菌基因組DNA的提取方法

1、生物技術(shù)通報(bào)研究報(bào)告年第期一種高效可直接用于擴(kuò)增的不吸水鏈霉菌基因組的提取方法吳紅艷摘要：陳飛桓明輝關(guān)艷麗郭玲玲（遼寧省微生物科學(xué)研究院，沈陽(yáng)）通過(guò)對(duì)提取不吸水鏈霉菌基因組的凍融法、微波法和溶菌酶破壁法等幾種方法進(jìn)行對(duì)比、分析，得出結(jié)論：溶菌酶破壁法所提取的不吸水鏈霉菌基因組可直接用于擴(kuò)增。這為今后不吸水鏈霉菌相關(guān)基因的實(shí)驗(yàn)研究提供了可靠的理論依據(jù)。關(guān)鍵詞：不吸水鏈霉菌基因組提取擴(kuò)增（，）：，：不吸水鏈霉菌是由遼寧省微生物科學(xué)研究院在廣西梧州地區(qū)土樣中分離得到一株不吸水鏈霉菌（），其經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物為廣譜抗真菌抗生素（命名為梧寧霉素），對(duì)多種植物病原菌具有較強(qiáng)的抑制和殺死作用，而且其毒

2、性很低，具有廣闊開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。但其一直存在著產(chǎn)量低、效價(jià)低、保存期短等問(wèn)題，阻礙其廣泛的推廣應(yīng)用，這就需要找到一種改善的方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，克隆不吸水鏈霉菌次級(jí)代謝過(guò)程中的激活因子和限速酶基因，增加其在菌種次級(jí)代謝中的表達(dá)，要對(duì)目的基因進(jìn)行表達(dá)，首要的任務(wù)就是基因組或的提取，然后進(jìn)行擴(kuò)增、產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后與載體連接、轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以及表達(dá)產(chǎn)物相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)等，因而其基因組或的獲得是前提條件。下面對(duì)于不吸水鏈霉菌基因組的提取方法進(jìn)行了研究探討。材料與方法材料菌種不吸水鏈霉菌菌種由遼寧省微生物科學(xué)研究院菌種中心提供。裂解液、蛋白酶、無(wú)水乙醇、苯酚、氯仿、異戊醇、異丙醇

3、、亞精胺、試劑緩沖液、酶、等。水浴鍋、電泳儀、儀器高速冷凍離心機(jī)、儀等。方法不吸水鏈霉菌基因組提取。收稿日期：作者簡(jiǎn)介：吳紅艷（），女，副研究員，研究方向：微生物及其分子生物學(xué)研究生物技術(shù)通報(bào)凍融法（一）提取基因組年第期（）菌種發(fā)酵用滅菌的接種針將不吸水鏈霉菌菌接種于培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)，備用。（）菌體裂解取發(fā)酵液于離心，收集菌體，用緩沖液懸浮、洗滌，離心，收集菌體，加入緩沖液懸浮，再加入裂解液，混合均勻，再加入適宜濃度的蛋白酶，混合均勻，于水浴。（）基因組的提取取菌體裂解液離心收集上清液，加入無(wú)水乙醇、苯酚：氯仿：異戊醇混合液抽提，收集上層液，抽提兩次。按一定比例加入氯化鈉、異丙醇沉淀約，離心

4、收集沉淀。（）基因組的純化：步驟（）中收集到的沉淀加入混勻，再加入亞精胺沉淀，離心，收集沉淀，加入，以及異丙醇進(jìn)一步沉淀，離心，收集沉淀。（）用乙醇洗滌沉淀，離心，收集沉淀，揮干，將沉淀溶解于含酶的緩沖液中，水浴消化，保存。凍融法（二）提取基因組（）菌種發(fā)酵：用滅菌的接種針將不吸水鏈霉菌菌接種于培養(yǎng)液中，（）（）與凍融法提取（一）相同，去掉步驟（），進(jìn)行步驟（）即得。微波法提取基因組振蕩培養(yǎng)，備用。（）基因組的提?。喝“l(fā)酵液于離心，收集菌體，加入洗滌液洗滌，在旋渦混合器上振蕩，離心，收集菌體，加入裂解液，振蕩懸浮，使溶液均勻，然后于功率為微波爐中處理；加入預(yù)熱的抽提液，振蕩；加入等體積的飽和酚

5、氯仿溶液抽提，離心，收集上清液，上清液以等體積的異丙醇沉淀，乙醇洗滌沉淀，離心，收集沉淀，干燥后溶解于含酶的緩沖液中，水浴消化，保存。溶菌酶破壁法提取基因組取培養(yǎng)的發(fā)酵液，離心，收集茵體，用（，）洗滌菌體，再用倍體積的含蔗糖的重懸菌體并加入溶菌酶，溫育；離心收集沉淀，用含蔗糖的懸浮沉淀，加入，室溫處理，再加入蛋白酶，溫育；加的和，溫育；然后用氯仿異戊醇（：）抽提二次，×體積異丙醇沉淀，收集沉淀，用乙醇洗滌，揮干，用溶解，保存。基因組瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品：（）凍融法（一）提取基因組；（）凍融法（二）提取的基因組；（）微波法提取的基因組；（）溶菌酶破壁法提取的基因組；（）為標(biāo)準(zhǔn)。瓊脂糖

6、凝膠濃度：電壓：電泳時(shí)間：。觀察：紫外燈觀察照相。以提取的基因組做模板進(jìn)行擴(kuò)增經(jīng)研究表明在不吸水鏈霉菌的代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生膽固醇氧化酶，這種酶對(duì)鞘翅目、鱗翅目、雙翅目、直翅目等害蟲(chóng)都有毒殺作用，對(duì)鞘翅目的棉鈴蟲(chóng)象甲具有極強(qiáng)的毒殺能力，是產(chǎn)生梧寧霉素的限速酶之一，因而，克隆膽固醇氧化酶基因是提高不吸水鏈霉菌梧寧霉素效價(jià)的重要途徑之一。模板：（）為凍融法（二）提取的基因組（）、（）、（）為溶菌酶破壁法提取的基因組（）為微波法提取的基因組引物：利用相關(guān)的分子生物學(xué)軟件，通過(guò)分析比較中已知的膽固醇氧化酶基因序列，獲得膽固醇氧化酶基因保守序列信息，設(shè)計(jì)并合成一對(duì)簡(jiǎn)并引物，用來(lái)從不吸水鏈霉菌梧州新亞種基因組

7、中擴(kuò)增膽固醇氧化酶基因片段，簡(jiǎn)并引物序列如下。上游引物：下游引物：加入了、兩個(gè)酶切位點(diǎn)。反應(yīng)條件：，；個(gè)循環(huán)，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。年第期吳紅艷等：一種高效可直接用于擴(kuò)增的不吸水鏈霉菌基因組的提取方法，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品：（）模板為凍融法（二）提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物（）、（）、（）模板為溶菌酶破壁法提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物（）模板為微波法提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物（）為標(biāo)準(zhǔn)（）為陰性對(duì)照（）為模板；瓊脂糖凝膠濃度：電壓：電泳時(shí)間：；觀察：紫外燈觀察照相。結(jié)果與討論結(jié)果凍融法提取（二）、微波法快速提取放線菌基因不吸水鏈霉菌基因組提取凍融法提取（一）、組、溶菌酶破壁法提取基因組均得到白色沉淀。

8、基因組瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖）。以提取的基因組做模板進(jìn)行擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖）。圖基因組瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果凍融法（一）提取的基因組、凍融法（二）提取、的基因組、微波破壁法提取的基因組、溶菌酶破壁法提取的基因組、標(biāo)準(zhǔn)樣品以提取的基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果模板為凍融法（二）提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物、模板為溶菌酶破壁法提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物、模板為微波法提取的基因組擴(kuò)增產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)為陰性對(duì)照為模板圖討論不吸水鏈霉菌基因組提取經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果看到。凍融法提?。ㄒ唬┲械玫降牟晃溍咕蚪M看不到帶，說(shuō)明已經(jīng)降解或者所提取的濃度很低，無(wú)法由電泳檢測(cè)。凍融法提?。ǘ┲械玫降?/p>

9、可以看到清晰的帶，但是還可以看到和基因組帶濃度相近的幾條帶，這說(shuō)明所提取的樣品純度較低，有很多雜質(zhì)存在，這將很大程度的影響擴(kuò)增結(jié)果。分析原因可能因?yàn)榘褍鋈诜ㄌ崛。ㄒ唬┲泻竺娴膩喚返募兓^(guò)程去掉以后，純化過(guò)程減少，因而純度降低，而且經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)表明使用此方法提取不吸水鏈霉菌基因組時(shí)結(jié)果不穩(wěn)定，每次提取的樣品純度各不相同，并存在降解的現(xiàn)象。微波法提取的基因組同樣可以看到一條清晰的帶，雖然純度較好，但是濃度較低。另外，在提取基因組進(jìn)行微波破壁的時(shí)候，所用的功率，時(shí)間等都有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。溶菌酶破壁法提取的基因組可以看到一條很明亮的帶，濃度很高，無(wú)其它的雜帶顯示，利用這種方法提取不吸水鏈霉菌基因組

10、，穩(wěn)定，濃度高，純度好。以不同方法提取的基因組做模板進(jìn)行擴(kuò)增后利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，由結(jié)果可以看出，以凍融法（二）提取的基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增后無(wú)帶顯示，可能由于模板中雜質(zhì)太多，影響反應(yīng)，未能擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)失敗。以微波法提取的基因組為模板擴(kuò)增后有特異性帶出現(xiàn)，但是濃度很低，影響回收、純化，以至于酶切等實(shí)驗(yàn)研究。而以溶菌酶破壁法提取的基因組為模板擴(kuò)增后顯現(xiàn)明亮的帶，特異性強(qiáng)，且濃度較高，可以用于回收、純化、酶切等等實(shí)驗(yàn)，所以此種方法是一種高效的可直接用于擴(kuò)增的不吸水鏈霉菌基因組提取方法。（下轉(zhuǎn)第頁(yè)）生物技術(shù)通報(bào)年第期的幼胚，得到轉(zhuǎn)基因水稻植株。對(duì)所得潮霉素抗性水稻植株的和析表明：基因已經(jīng)整合

11、到受體基因組中。代轉(zhuǎn)基因植株根的生長(zhǎng)被葡萄糖所抑制，表現(xiàn)出對(duì)葡萄糖的敏感性，這一研究表明了基因可能與糖信號(hào)的傳導(dǎo)有關(guān)。即可能說(shuō)明在葡萄糖作用下，其信號(hào)傳導(dǎo)起到正調(diào)控作用。其中葉綠素降低，葉綠素的值比野生型低，說(shuō)明超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株葉片葉綠素降低主要是由于葉綠素減少所引起的作用。秦春圃! （上接第頁(yè)）參考文獻(xiàn)徐平，等微生物學(xué)通報(bào)，（）：徐平，等中國(guó)抗生素雜志，（）：鄭景生，等分子植物育種，（）：銀國(guó)利，等西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，（）：! 中國(guó)科技核心期刊、全國(guó)優(yōu)秀農(nóng)業(yè)期刊植物遺傳資源學(xué)報(bào)征訂啟事植物遺傳資源學(xué)報(bào)是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所和中國(guó)農(nóng)學(xué)會(huì)主辦的學(xué)術(shù)期刊，為中國(guó)科技核心期刊、全國(guó)優(yōu)秀農(nóng)業(yè)期刊。該刊為中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊、中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源期刊（核心期刊）、中國(guó)核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫(kù)收錄期刊、中國(guó)學(xué)術(shù)期刊綜合評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)源期刊，又被中國(guó)生物學(xué)文摘和中國(guó)生物學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)、中文科技期刊數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。據(jù)中國(guó)期刊引證研究報(bào)告統(tǒng)計(jì)，年度植物遺傳資源學(xué)報(bào)影響因子達(dá)。報(bào)道內(nèi)容為大田、園藝作物，觀賞、藥用植物，林用植物、草類植物及其一切經(jīng)濟(jì)植物的有關(guān)植物遺傳資源基礎(chǔ)理論研究、應(yīng)用研究方面的研究成果、創(chuàng)新性學(xué)術(shù)論文和高水平綜述或評(píng)