色譜和毛細(xì)管電泳在中藥現(xiàn)代化過程中的作用

1、色譜和毛細(xì)管電泳在中藥現(xiàn)代化過程中的作用眾所周知，中藥現(xiàn)代化有一個必須解決的關(guān)鍵問題就是質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。雖然目前西方發(fā)達(dá)國家醫(yī)藥市場已逐漸開始接受天然復(fù)方藥物，承認(rèn)中藥復(fù)方的臨床療效和安全性，但是，如何有效控制中藥的質(zhì)量仍然是一個尚未解決的問題，這在很大程度上限制了中藥的臨床應(yīng)用，阻礙了中藥的國際化進(jìn)程。鑒于中藥本身的藥理特性和成分復(fù)雜性，加之目前藥材來源的多樣性、生產(chǎn)工藝的不規(guī)范和分析要求的特殊性，美國食品藥品管理局（MND）、世界衛(wèi)生組織（OJC）、歐共體、英國、印度和加拿大草藥典E均接受指紋圖譜作為申報材料的組成部分。不過，這大多是針對保健性植物藥的，對于臨床用藥品則尚無此類規(guī)定。因此，中

2、藥的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)仍是一個亟待解決的國際性難題。這無疑是一個嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，但同時又是我們在該領(lǐng)域做出世界領(lǐng)先水平工作的契機(jī)。從!"世紀(jì)9"年代將薄層掃描圖譜用于中成藥分析，到&"年版中國藥典設(shè)置薄層色譜鑒別對照藥材，再到!"""年國家藥品監(jiān)督局發(fā)布“中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）”，我國中醫(yī)界對指紋圖譜在中藥質(zhì)量控制中的作用已經(jīng)達(dá)成了重要的共識，并提出了色譜指紋圖譜(和中藥材特征性總成分指紋圖%等概念，已有不少JKL9、I8、核磁共振（PQG）、紅外光 譜（MRSG）和熒光光譜&"等技術(shù)用于指紋圖譜分析

3、的報道。指紋圖譜不要求呈現(xiàn)在圖譜中的每一個組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)都清楚，也不要求對每個組分都精確定量，但要求圖譜具備指紋特征，即專屬、穩(wěn)定、實(shí)用，憑借指紋圖譜可確認(rèn)產(chǎn)品的真?zhèn)?，且能判斷質(zhì)量穩(wěn)定與否&&?，F(xiàn)代分析儀器的發(fā)展已可提供用于指紋圖譜分析的強(qiáng)有力技術(shù)，特別是色譜和毛細(xì)管電泳這樣的分離分析方法及其與質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)，可以提供多維的數(shù)據(jù)。比如采用毛細(xì)管柱I或頂空氣相色譜（JFI）可以獲得中藥中可揮發(fā)性成分的譜圖&!；采用裂解氣相色譜（K>$I）可以獲得藥物成分降解產(chǎn)物的信息&#；采用 JKL&E，&(則可以獲得中藥中難揮發(fā)和不揮發(fā)成分的譜圖。)由于

4、分離效率高，適用樣品范圍廣，分析成本低而得到廣泛的應(yīng)用，在中藥指紋圖譜研究中已有不少報道&%，比如，十大功勞藥材&9和梔子藥材&8的)指紋圖譜等。然而，必須承認(rèn)，中藥指紋圖譜的研究才剛剛起步由于指紋圖譜分析是一項極為復(fù)雜的系統(tǒng)工程，原料藥材和成藥的組成和療效又受許多因素的影響，故要將色譜或)指紋圖譜作為普適而有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚有很多必須解決的問題。原料藥材的質(zhì)量穩(wěn)定性和投料物的選擇、用于不同藥材和制劑的指紋圖譜分析的技術(shù)確定和方法驗(yàn)證、數(shù)據(jù)處理的規(guī)范和圖譜解析標(biāo)準(zhǔn)&、優(yōu)良實(shí)驗(yàn)室規(guī)范（ILK）、優(yōu)良制造規(guī)范（IQK）和整個分析方法的自動化問題等等，均需要做全面而系統(tǒng)

5、的研究。" 有效成分的提取和測定雖然指紋圖譜肯定是建立中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一條途徑，但僅僅靠指紋圖譜恐怕還不能完全解決畢竟經(jīng)過祖輩幾千年的積累，又有現(xiàn)代中國幾十年!""#年9月T0->!""#色 譜!"#$%&%()*$+,(-!"*(.+/(0*+1"2U;-3!&P;3E#"9"#&"的研究，我們在中藥有效成分的分離鑒定方面已經(jīng)獲得了豐富的知識，已經(jīng)可以準(zhǔn)確分析和測定許多中藥的有效成分。我們認(rèn)為，有效成分的定量分析與指紋圖譜的研究是中藥質(zhì)量評價的兩個重要方面

6、，缺一不可。二者的有效結(jié)合，才是建立中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的有效途徑。在中藥有效成分的提取和測定方面，色譜和!"技術(shù)一直扮演著主要的角色。從早期的以薄層色譜為主，到后來#!和$%&!的應(yīng)用越來越普遍，再到近十年來!"的異軍突起，使得中藥有效成分的提取分離和測定技術(shù)日趨先進(jìn)。目前，$%&!在中藥有效成分的分析方面發(fā)揮著不可替代的作用，(，而近年來快速發(fā)展的!"技術(shù)則是液相色譜的有力補(bǔ)充，因?yàn)?"有多種分離模式，切換方便且分析成本低，很適合于復(fù)雜樣品的分離分析。在基因測序、蛋白質(zhì)分析和手性藥物分離方面，!"已經(jīng)顯示了強(qiáng)大的優(yōu)勢。在中藥分析中也

7、已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)報道)，所 涉 及 的 方 法 有 毛 細(xì) 管 區(qū) 帶 電 泳（!*" ）!+、 膠 束 電 動 毛 細(xì) 管 色 譜（,"-!）.!/、微乳電動色譜（,""-!）/，/0非水毛細(xì)管電泳（12!"）/3、毛細(xì)管電色譜（!"!/4等，分析對象包括中草藥中的各類物質(zhì)（包括酸性、堿性和中性的物質(zhì)），如有機(jī)酸生物堿、黃酮及其甙類、香豆素類、氨基酸類、蛋白質(zhì)類及皂甙等成分的分析。利用!"的快速分離特征，還可以研究植物生長環(huán)境如空間失重條件對中藥質(zhì)量的影響/5。研究結(jié)果表明，不同的模式可用于同一類有效成分的分析，但選擇性不

8、同/+；!"不僅是$%&!很好的補(bǔ)充，而且在很多方面優(yōu)于$%&!，比如，!"所采用的毛細(xì)管柱易于清洗、易于平衡，且成本低/.。然而，就中藥有效成分分析而言，!"在重復(fù)性和檢測靈敏度方面尚不及 $%&!。原因是!"中影響電滲流的因素較多，人們對高電場作用下熔融石英毛細(xì)管內(nèi)表面的物理化學(xué)性質(zhì)還缺乏充分的認(rèn)識，而大部分中藥組分極其復(fù)雜，某些組分可能與毛細(xì)管內(nèi)壁發(fā)生相互作用，導(dǎo)致進(jìn)樣分析過程中毛細(xì)管內(nèi)表面性質(zhì)的變化，從而造成電滲流的不重復(fù)。采用相對遷移值和疊加對比法可以在一定程度上克服重復(fù)性差的問題0(。另一方面，目前大部分!"

9、配備紫外吸收（67）或二極管陣列檢測器（828）進(jìn)行柱上檢測，由于光程（毛細(xì)管內(nèi)徑一般為3(!)("9）較短，進(jìn)樣量有限（/(:&左右），故難以檢測樣品中的微量成分，特別是當(dāng)這些微量成分是中藥的有效成分時，就難以準(zhǔn)確判定樣品的質(zhì)量。因此，深入研究熔融石英管內(nèi)表面的物理化學(xué)性質(zhì)，開發(fā)新的涂層技術(shù)、制備電滲流穩(wěn)定或精確可控的毛細(xì)管，開發(fā)成本低、靈敏度高且通用性好的檢測器，無疑是中現(xiàn)代化過程中!"研究的重要內(nèi)容。目前改善!"檢測靈敏度主要有三個途徑。一是采用電噴霧譜（"<=,;）、激光誘導(dǎo)熒光（&<>）或電化學(xué)檢測等高靈敏度檢

10、測器。但前二者成本高，普及有困難，而且"<=,;對緩沖鹽的應(yīng)用有較苛刻的要求，&<>則需要對很多無熒光特性的物質(zhì)進(jìn)行柱前或柱后的標(biāo)記；電化學(xué)檢測器的通用性較差，電極的耐用性和重復(fù)性尚不能令人意。二是研究柱上濃縮或樣品堆積技術(shù)。對某些樣品成分，適當(dāng)?shù)臐饪s可以使檢測靈敏度提高百倍到上千倍，這是很有意義的研究。三是進(jìn)行分析前樣品預(yù)處理。采用包括超臨界流體萃取膜提取分離、超聲提取、微波萃取、酶法、半仿生提取法、破碎提取法、空氣爆破法、液泛法、大孔樹脂吸附分離以及雙水相萃取等高效提取工藝0)，0，比如高速逆流色譜對中藥有效成分的提取就非常有效0/!04。最近，分子印跡

11、聚合物（,<%）用于中藥有效成分的固相萃?。?%"）顯示了誘人的結(jié)果，徐筱杰教授的研究組05用;%"直接提取了銀杏葉中的黃酮。最近他們以抗表皮生長因子受體抑制劑（中藥有效成分）為模板分子合成了具有特殊選擇性的 ,<%，以此填充;%"小柱，從中藥中萃取了有關(guān)活性成分0+；進(jìn)而他們此類 ,<%作親和色譜固定相，采用液相色譜=質(zhì)譜在線聯(lián)用技術(shù)（&!=,;）選擇性分離和鑒定中藥中的抗癌成分0.。若將此類技術(shù)應(yīng)用于!"分析的樣品處理，或者用于親和!"!以及!"!=,;對中藥有效成分的分離分析，必將進(jìn)一步推動!"

12、;在中藥有效成分分析中的應(yīng)用。! 活性成分的篩選過去的幾十年里，在分子水平上高通量篩選藥物先導(dǎo)化合物已經(jīng)成為新藥開發(fā)的主手段。中藥的藥理作用主要是基于分子水平上多成分、多靶點(diǎn)的組合作用，采用單一靶蛋白中藥中的活性成分難以取得滿意的結(jié)果。借鑒西藥的研究方法來篩選中藥活性成分也是中藥現(xiàn)代化研究的一個重要方面，而$%&!和!"在這方面無疑是極為重要的技術(shù)。日本學(xué)者曾以或動物為篩選模型，結(jié)合$%&!分離分析，對傳統(tǒng)中藥復(fù)方小柴胡湯的有效成分進(jìn)行了篩選究3(；我國學(xué)者則提出了基于藥中多種活性成分的分離分析3)?？捎糜谥兴幍暮Y選3，固定化脂質(zhì)體色譜也是一種有效的方法3/。近來，有

13、人又明確提出了生物功能化色譜的概念30，即將生物活性分子作為色譜固定相，或者鍵合到固定相上，使其具有某些生物的功能，在模擬生物條件下，對藥物分子進(jìn)行分離，從而·/(+· 色 譜 第)卷" 有效成分的提取和測定雖然指紋圖譜肯定是建立中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的一條途徑，但僅僅靠指紋圖譜恐怕完全解決問題。畢竟經(jīng)過祖輩幾千年的積累，又有現(xiàn)代中國幾十年!""#年9月T0->!""#色 譜!"#$%&%()*$+,(-!"*(.+/(0*+1"2U;-3!&P;3E#"9"#&

14、amp;"的研究，我們在中藥有效成分的分離鑒定方面已經(jīng)獲得了豐富的知識已經(jīng)可以準(zhǔn)確分析和測定許多中藥的有效成分。我們認(rèn)為，有效成分的定量分析與指紋圖的研究是中藥質(zhì)量評價的兩個重要方面，缺一不可。只有二者的有效結(jié)合，才是建立中藥質(zhì)量的有效途徑。在中藥有效成分的提取和測定方面，色譜和!"技術(shù)一直扮演著主要的角色。從早期的以薄層色譜為主，到后來#!和$%&!的應(yīng)用越來越普遍，再到近十年來!"的異軍突起，使得中藥有效成分的提取分離和測定技術(shù)日趨先進(jìn)。目前，$%&!在中藥有效成分的分析方面發(fā)揮著不可替代的作用，(，而近年來快速發(fā)展的!"技術(shù)則是液相

15、色譜的有力補(bǔ)充，因?yàn)?"有多種分離模式，切換方便，且分析成本低，很適合于復(fù)雜樣品的分離分析。在基因測序、蛋白質(zhì)分析和手性藥物分離方面，!"已經(jīng)顯示了強(qiáng)大的優(yōu)勢。在中藥分析中也已經(jīng)有大量的文獻(xiàn)報道)，所 涉 及 的 方 法 有 毛 細(xì) 管 區(qū) 帶 電 泳（!*" ）!+、 膠 束 電 動 毛 細(xì) 管 色 譜（,"-!）.!/、微乳電動色譜（,""-!）/，/0、非水毛細(xì)管電泳（12!"）/3、毛細(xì)管電色譜（!"!）/4等，分析對象包括中草藥中的各類物質(zhì)（包括酸性、堿性和中性的物質(zhì)），如有機(jī)酸、生物堿、黃酮及其甙類、香

16、豆素類、氨基酸類、蛋白質(zhì)類及皂甙等成分的分析。利用!"的快速分離特征，還可以研究植物生長環(huán)境如空間失重件對中藥質(zhì)量的影響/5。研究結(jié)果表明，不同的模式可用于同一類有效成分的分析，但選擇性不同/+；!"不僅是$%&!很好的補(bǔ)充，而且在很多方面優(yōu)于$%&!，比如，!"所采用的毛細(xì)管柱易于清洗、易于平衡，且成本低/.。然而，就中藥有效成分分析而言，!"在重復(fù)性和檢測靈敏度方面尚不及 $%&!。原因是!"中影響電滲流的因素較多，人們對高電場作用下熔融石英毛細(xì)管內(nèi)表面的物理化學(xué)性質(zhì)還缺乏充分的認(rèn)識，而大部分中藥組分極其復(fù)雜某些組分

17、可能與毛細(xì)管內(nèi)壁發(fā)生相互作用，導(dǎo)致進(jìn)樣分析過程中毛細(xì)管內(nèi)表面性質(zhì)的變化，從而造成電滲流的不重復(fù)。采用相對遷移值和疊加對比法可以在一定程度上克服重復(fù)性差的問題0(。另一方面，目前大部分!"配備紫外吸收（67）或二極管陣列檢測器（828）進(jìn)行柱上檢測，由于光程（毛細(xì)管內(nèi)徑一般為3(!)("9）較短，進(jìn)樣量有限（/(:&左右），故難以測樣品中的微量成分，特別是當(dāng)這些微量成分是中藥的有效成分時，就難以準(zhǔn)確判定樣品的質(zhì)量。因此，深入研究熔融石英管內(nèi)表面的物理化學(xué)性質(zhì)，開發(fā)新的涂層技術(shù)、制備電滲流穩(wěn)定或精確可控的毛細(xì)管，開發(fā)成本低、靈敏度高且通用性好的檢測器，無疑是中藥現(xiàn)代化過

18、程中!"研究的重要內(nèi)容。目前改善!"檢測靈敏度主要有三個途徑。一是采用電噴霧質(zhì)譜（"<=,;）、激光誘導(dǎo)熒光（&<>）或電化學(xué)檢測等高靈敏度檢測器。但前二者成本高，普及有困難，而且"<=,;對緩沖鹽的應(yīng)用有較苛刻的要求，&<>則需要對很多無熒光特性的物質(zhì)進(jìn)行柱前或柱后的標(biāo)記；電化學(xué)檢測器的通用性較差，電極的耐用性和重復(fù)性尚不能令人意。二是研究柱上濃縮或樣品堆積技術(shù)。對某些樣品成分，適當(dāng)?shù)臐饪s可以使檢測靈敏度提高上百到上千倍，這是很有意義的研究。三是進(jìn)行分析前樣品預(yù)處理。采用包括超臨界流體萃取、膜提取分離

19、、超聲提取、微波萃取、酶法、半仿生提取法、破碎提取法、空氣爆破法、液泛法、大孔樹脂吸附分離以及雙水相萃取等高效提取工藝0)，0，比如高速逆流色譜對中藥有效成分的提取就非常有效0/!04。最近，分子印跡聚合物（,<%）用于中藥有效成分的固相萃?。?%"）顯示了誘人的結(jié)果，徐筱杰教授的研究組05用;%"直接提取了銀杏葉中的黃酮。最近他們以抗表皮生長因子受體抑制劑（中藥有效成分）為模板分子合成了具有特選擇性的 ,<%，以此填充;%"小柱，從中藥中萃取了有關(guān)活性成分0+；進(jìn)而他們以此類 ,<%作親和色譜固定相，采用液相色譜=質(zhì)譜在線聯(lián)用技術(shù)（&!=,;）選擇性分離和鑒定了中藥