乳鐵蛋白與骨質(zhì)疏松癥

1、乳鐵蛋白與骨質(zhì)疏松癥天然產(chǎn)物研究與開發(fā)NatProdResDev,2007,19:566-568,507文章編號:1001-6880(2007)Suppl-0566-04乳鐵蛋白與骨質(zhì)疏松癥康萍,印遇龍h中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所,長沙4101252中國科學院研究生院,北京100049摘要:本文主要闡述T?L鐵蛋白對造骨細胞,破骨細胞及半胱氨酸蛋白酶的作用,由于其對造骨細胞有促進作用及對破骨細胞和半胱氨酸蛋白酶(如K,L)的抑制作用,因此乳鐵蛋白是治療骨質(zhì)疏松癥的一種潛在的治療手段.關(guān)鍵詞:乳鐵蛋白;骨質(zhì)疏松癥中圖分類號:R285文獻標識碼:ALactoferrinandOsteoporo

2、sisKANGPing._.YINYu.1ongInstituteofSubtropicalAgriculture,theChineseAcademyofScience,Changsha410125,China;GraduateUniversityofChineseAcademyofSciences,Beiing100049,ChinaAbstract:Thisarticlemainlytalkabouttheeffectoflactoferrinontheosteoblasts,oteoclastsandeaspase,becauseitcansimulatetheosteoblastsan

3、dinhibittheosteoclastsandeaspase,thus,itisprobablyapotentialmedicinefortherapyosteoporosis.一Keywords:laetoferrin;osteoporosis骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)是一種骨量減少,骨組織微結(jié)構(gòu)破壞,骨強度降低,骨脆性增加而易骨折的全身性疾病.在老年人中,骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率較高,目前對其的治療作用也僅限于恢復(fù)骨的質(zhì)量,且在最好的情況下,能將由其引起的骨折發(fā)生率降到50%-1J.骨的生長受許多激素和生長因子的調(diào)控,而其形成是由成骨細胞,破骨細胞及骨吸收細胞等相互復(fù)雜作用

4、的結(jié)果.目前在骨吸收抑制方面的治療用藥有雌激素,降鈣素,雙膦酸鹽類等,在促進骨形成方面的治療用藥有維生素D及其活性代謝物,氟化物,甲狀旁腺激素,他汀類藥物,鍶鹽及中藥等,但乳鐵蛋白對其的治療作用國內(nèi)還未見報道.Cornish(2004)通過體內(nèi)和體外試驗表明乳鐵蛋白不論在骨的生長期還是成熟期都對骨的生長有促進作用,進而認為乳鐵蛋白是治療骨質(zhì)疏松癥的一種潛在的治療手段.1乳鐵蛋白的分子結(jié)構(gòu)乳鐵蛋白(Lactoferrin,LF)1960年首先由Groves收稿13期:2007-0413接受13期:2007-06-20基金項目:國家自然科學基金(3C/0C581)通訊作者Te1:86-731-46

5、19706;Emall:yyulonghotmail.corn從牛乳中分離獲得.因與鐵結(jié)合而呈紅色,故稱之為紅蛋白.乳鐵蛋白在人類初乳中含量最高,牛乳中的含量比人乳中少得多,狗乳中則不含.此外,它還廣泛存在于乳汁,唾液,淚液等外分泌液或血漿和中性粒細胞中.LF是一種具有多種生物學功能的蛋白質(zhì),它不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運,而且具有殺菌,抗氧化,抗癌,調(diào)節(jié)免疫等許多特殊的生理生化功能.LF是由轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)演變而來的,分子量約為80kD的鐵結(jié)合性糖蛋白,其多肽鏈上結(jié)合有兩條糖鏈,其組成包括甘露糖,半乳糖,N一乙酰半乳糖胺,唾液酸及巖藻酸等.人和牛LF的一級結(jié)構(gòu)具有高度的相似性,二者同源

6、性高達69%.LF的二級結(jié)構(gòu)是由一螺旋和一折疊交替排列組成.Grossmann(1992)發(fā)現(xiàn)人LF的立體結(jié)構(gòu)包括兩個同源的葉N葉和c葉(兩者各占一半),其中N葉由l一333個氨基酸殘基組成,C葉由335692個氨基酸殘基組成,兩者在334344處由三個一螺旋連接,每個葉又包括兩個結(jié)構(gòu)域,每個結(jié)構(gòu)域在其域間裂隙的內(nèi)表面有一個鐵離子(Fe)結(jié)合位點,每個Fe又與四個蛋白質(zhì)配體,即兩個酪氨酸,一個精氨酸和一個組氨酸,以及一個陰離子(在體內(nèi)通常是碳酸鹽)配位,每個LF可以結(jié)合兩個Fe和兩康萍等:乳鐵蛋白與骨質(zhì)疏松癥567個co2_3.2乳鐵蛋白對造骨細胞的影響Cornish等(2004)在體外試驗中

7、已經(jīng)表明,乳鐵蛋白可刺激骨形成細胞及造骨細胞的有絲分裂,分化及存活,此外,在小鼠頭顱的局部注射乳鐵蛋白可增加體內(nèi)新的骨細胞的形成;此外,結(jié)合經(jīng)原始或細胞系培養(yǎng)的人類或鼠的造骨細胞樣細胞,還發(fā)現(xiàn)在生理濃度條件下(1100ixg/mL),乳鐵蛋白會產(chǎn)生依賴其劑量而增加的大量胸苷,并且最高的產(chǎn)生量超過對照組的5倍;乳鐵蛋白增加了造骨細胞的分化,使造骨細胞的死亡減少了50%一70%,同樣的,乳鐵蛋白還促進原始的軟骨細胞的分化.在鼠骨髓細胞的培養(yǎng)中,破骨細胞的數(shù)量依乳鐵蛋白劑量的增加而減小,并在100Ixg/mL的濃度下可被乳鐵蛋白完全捕獲,此過程伴隨著細胞核因子KB配體的受體激活因子表達量的減少.此外

8、通過給成年鼠的頭顱連續(xù)注射5天的乳鐵蛋白.應(yīng)用熒光標記表明,4mg的乳鐵蛋白就可使新骨細胞的形成增加4倍引.Cornish(2004)已經(jīng)表明牛和人類的乳鐵蛋白是骨組織生長中的合成因子.在體外,乳鐵蛋白(其生理濃度在0.1Ixg/mL以上)刺激了骨形成細胞,軟骨細胞和造骨細胞的分化,并且這樣大的影響力超過了其它對骨生長的影響因素,如IGF一1和TGF-/3等J.乳鐵蛋白也是一種有效的造骨細胞存活因子.在對TUNEL和DNA的序列分析中,表明乳鐵蛋白減少了70%以上造骨細胞的死亡.在體內(nèi),給成年鼠局部注射乳鐵蛋白可導(dǎo)致頭顱骨骼的生長,且在僅注射5次情況下,就顯著增加了骨面積.在100Ixg/mL

9、的濃度下,乳鐵蛋白可顯著增加骨結(jié)節(jié)形成的數(shù)量和面積.乳鐵蛋白可促進骨質(zhì)的沉積和骨的礦物化.且鐵的飽和度似乎對成骨質(zhì)的行為無明顯影響.Lorget(2002)已經(jīng)表明,在兔的混合骨細胞的培養(yǎng)中,牛乳鐵蛋白能降低骨吸收的活性引.目前乳鐵蛋白的受體有低密度脂蛋白受體結(jié)合蛋白LRP1和LRP2【6圳,他們是吞噬受體LRP家族的多配體成員.最近的研究表明LRP1同時兼有信號受體和吞噬受體的功能1】.Cornish等(2005)報道乳鐵蛋白對造骨細胞樣細胞的有絲分裂的刺激是通過LRP1介導(dǎo)的,并應(yīng)用激光共焦點掃描顯微鏡,發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白似乎被原始的造骨細胞所吞噬.然而.LRP1的吞噬和信號功能是相互獨立的,因

10、為乳鐵蛋白能在吞噬作用被抑制的情況下激活有絲分裂的信號引.3乳鐵蛋白對破骨細胞的影響Cornish(2004)報道乳鐵蛋白可劑量依賴性的降低破骨細胞的形成,此外,乳鐵蛋白對破骨細胞有重大影響,當乳鐵蛋白的濃度在鼠骨髓培養(yǎng)系統(tǒng)中大于1Ixg/mL時,就會降低破骨細胞的增殖.然而.在頭顱組織的培養(yǎng)中,乳鐵蛋白沒有改變這種作用.表明乳鐵蛋白并不影響成熟破骨細胞的作用引.4乳鐵蛋白對半胱氨酸蛋白酶的抑制作用半胱氨酸蛋白酶是廣泛存在于植物,細菌,病毒,原生動物和哺乳動物組織中的一類重要蛋白酶,人體中的半胱氨酸蛋白酶主要包括組織蛋白酶B,c,K,H,L和s等,以及屬于鈣離子激活神經(jīng)蛋白酶家族的I型和II型

11、鈣離子激活神經(jīng)蛋白酶.近年來發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶K,L是破骨細胞中高度表達的酶,其主要在破骨細胞中選擇性,特異性地表達,參與骨質(zhì)的再吸收代謝(骨吸收)調(diào)節(jié),從而與骨質(zhì)疏松癥等骨質(zhì)減少性疾病有關(guān)J.有研究報道,在半胱氨酸蛋白酶中,主要是組織蛋白酶B,N,L和S能通過降解骨膠原參與骨的吸收過程J.Gowen等(1999)通過免疫組化發(fā)現(xiàn),正常關(guān)節(jié)中骨與軟骨交界處破骨細胞的胞內(nèi)半胱氨酸蛋白酶K,B特別豐富,說明其明顯參與鈣化軟骨吸收和軟骨內(nèi)進一步鈣化引.研究表明組織蛋白酶K,L主要是通過調(diào)節(jié)骨纖維膠質(zhì)降解促進骨吸收ll引.骨吸收主要由破骨細胞調(diào)節(jié),破骨細胞分泌的組織蛋白酶K,L的前體蛋白在骨吸收腔隙中被激

12、活,參與骨質(zhì)的代謝.骨質(zhì)中的細胞外有機物質(zhì)主要是I和II型纖維膠質(zhì),其中I型膠質(zhì)約占90%,骨吸收過程的一個重要環(huán)節(jié)是纖維膠質(zhì)的分解代謝,研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶K通過作用于I和II型纖維膠質(zhì)的N端三股螺旋處而降解骨纖維膠質(zhì)J.Ohashi等(2003)發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白對半胱氨酸蛋白酶有強烈的抑制作用.尤其對半胱氨酸蛋白酶L的抑制作用最強,并且這種抑制作用是非競爭性的l2.研究表明,乳鐵蛋白C末端的17個堿基序列與半胱氨酸蛋白酶抑制劑通常的活性部位有60%的一致性和90%的同源性l23J.568天然產(chǎn)物研究與開發(fā)V01.19因此,乳鐵蛋白被認為是半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族中的一員.在1OM水平下,乳鐵蛋

13、白可完全抑制木瓜蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶L,在1O.M水平抑制半胱氨酸蛋白酶B和S,但蛋白酶C除外.不論有沒有Fe離子,乳鐵蛋白都對這些半胱氨酸蛋白酶有相同的抑制作用,因此乳鐵蛋白具有鐵載體與半胱氨酸蛋白酶抑制劑雙重作用,從而可能通過抑制半胱氨酸蛋白酶而間接影響骨的生長.5展望綜合起來,這些數(shù)據(jù)說明乳鐵蛋白在體內(nèi)可促進骨的合成,原因在于其促進造骨細胞的分化與抑制死亡及對破骨細胞和半胱氨酸蛋白酶(如K,L)的抑制作用.因此可以斷定乳鐵蛋白對骨的生長有生理作用,可作為潛在的治療骨質(zhì)疏松癥的藥物,但國內(nèi)目前對乳鐵蛋白的生產(chǎn)還處于空白,因此限制了其的應(yīng)用.參考文獻1CranneyA,GuyaG,Grif

14、fithL,eta/.111eoste0porosismeth-odologygroupandtheosteoporosisresearchadvisorygroup,metaanalysesoftherapiesforpostmenopausalosteoporosis.IX:summaryofmeta-analysesoftherapiesforpostmenopaus-alosteoporesis.EndrineReviews,2002,23:570-578.2CornishJ.Lactoferrinpromotesbonegrowth.Biometa/s,2004.17:331-333

15、.3GrossmannJG,NeuM,PantosE,eta1.X-raysolutionscat-tefingrevealsconformationalchangesuponironuptakeinlactoferrin,serumandOVO-transferrins.JularBiology,1992.225:811-819.4CornishJ,GallonKE,NaotD,eta1.Lactoferrinisapotentregulatorofbonecellactivityandincreasesboneformationinvivo.Endocrinology,2004,145:4

16、366-4374.5LorgetF,CloughJ,OliveiraM,eta1.Lactoferrinreducesinvivoosteoclastdifferentiationandresorbingactivity.Biochem-icaland日ResearchCommunications,2002,296:261-266.6WillnowTE,GoldsteinJL,OrthK,eta1.Lowdensityllpopro-teinreceptor-relatedproteinandgp330bindsimilarligands,includingplasminogenactivat

17、or-inhibitorcomplexesandlact-oferrin.aninhibitorofchylomicronremnantclearance.JBio-icolCtry,1992,267:26172-26180.7MeilingerM,HaumerM,SzakmaryKA,eta1.Removaloflactoferfinfromplasmaismediatedbybindingtolowdensityllpoproteinreceptor-relatedprotein/alpha2-macroglobullnreceptorandtransporttoendosomes.FEB

18、SLetters,1995,360:7O_74.8JIZS.MahleyRW.LactoferrinbindingtoheparansulfateproteoglycansandtheLDLreceptor-relatedprotein.Furtherevidencesupportingtheimportanceofdirectbindingofrem-nantlipoproteinstoHSPG.ArteriosclerosisandThrombosis,1994,14:2025-2031.9VashB,PhungN,ZeinS,eta1.Threecomplement-typere-pea

19、tsofthelow-densitylipoproteinreceptor-relatedproteindefineacommonbindingsiteforRAP,PAI-landlactoferrin.Blood,1998,92:3277-3285.10StricklandDK,GoniasSL,ArgravesWS.DiverserolesfortheLDLreceptorfamily.TrendsEndocrinologyMetabolism.2002.13:66_74.11He=J,GotthardtM,WillIl0wTE.Cellularsignalingbylipo?prote

20、inreceptors.CurrentOpinionin2Dgy,2000,11:161.166.12UY,CamJ,BuG.Lowdensitylipoproteinreceptorfamily:endocytosisandsignaltransduction.MolecularNeurobiology,2001,23:5367.13CornishJ,GreyAB,NaotD,eta1.Lactoferrinandbone:anoverviewofrecentprogress.AustralianJournalofDairyTechn,2oo5,60:53-57.14BossardMJ,To

21、maszekTA,ThompsonSK,eto2.ProteolytieactivityofhumanosteoclastcathepsinK.Expression,pufifi-cation,activation,andsubstrateidentification.JBiologicalChemistry,1996,271:12517-12524.15KakegavaH,NikavaT,TagamiK,eta/.Participationofca?thepsinLonboneresorption.FEBSLetters,1993,321:247-250.16RoseAM.SandraFW.

22、SusceptibilityoftheCartilageColla-gensTypes.IXandtoDegradationbytheCysteinePro-teinases,CathepsinBandL.FEBSLetters,1990,269:189-193.17CronelisJF,VanN,VincentE.SelectiveInhibitionofCyste-ineProteinases(suchasCathepsinBandL)byZ-Phe-AlaCH2F.Biochemica/andBiophysicalResearchCommunica-tions,1991,178:178-

23、184.18GowenM,LaznerF,DoddsR,eta1.CathepsinKknockoutmicedeveloposteopetrosisduetoadeficitinmatrixdegrada-tionbutnotdeminerallzation.JBoneMineralRes,1999,14:1654.1663.19YamazaT,GotoT,KamiyaT,eta1.StudyofimmunoelectronmicroscopiclocalizationofcathepsinKinosteoclastsandotherboneceUsinthemousefemur.Bone,

24、1998,23:499-509.(下轉(zhuǎn)第507頁)廖森泰等:桑枝總黃酮的提取工藝研究507g與實測值非常接近,同時也進一步驗證了數(shù)學回歸模型合適性.為實際操作簡便起見,將優(yōu)化的工藝條件調(diào)整為:溫度80,時間3.5h,乙醇濃度60%,料液比1:40,經(jīng)驗證桑枝總黃酮含量為6.23mg/g,與理論值也非常接近.討陀二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計是將回歸正交設(shè)計與旋轉(zhuǎn)設(shè)計組合起來的一種方法,它在理論上同時具有正交.陛和旋轉(zhuǎn)性.該試驗布點分散均勻,試驗次數(shù)少,消除了回歸系數(shù)的相關(guān)性,可直接找出預(yù)測值相對較優(yōu)的區(qū)域,克服了多因子,多水平試驗的弱點,而且一次試驗可獲得較多的信息,降低了試驗成本,縮短了研究周期.

25、它以回歸方程作為函數(shù)估算的工具,將多因子試驗中,因素與試驗結(jié)果的關(guān)系用多項式擬合,把因子與試驗結(jié)果的關(guān)系函數(shù)化,因此,可對函數(shù)的面進行分析,研究因子與試驗結(jié)果之間,因子與因子之間的相互關(guān)系,并進行優(yōu)化.它克服了正交試驗只能給出最佳因素水平組合,而無法找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和試驗結(jié)果的最優(yōu)值的缺陷.目前對植物中黃酮的提取條件研究多采用正交設(shè)計法,但正交設(shè)計只能處理離散的水平值,在實際應(yīng)用中不免會有諸多局限性.本研究將二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計應(yīng)用于桑枝總黃酮的提取中,優(yōu)化出其最佳提取溶劑濃度,提取時間和料液比等條件,為桑枝的藥用開發(fā)打下基礎(chǔ).參考文獻1ChinaPharmacopoeiaCo

26、mmittee(中華人民共和國藥典委員會).ChinesePharmacopoeia(中華人民共和國藥典).Beijing:ChemicalIndustryPress,2005.210.2NewMedicalCollegeofJiangshu(江蘇新醫(yī)學院).ADictionaryofChineseTraditionalMedicine(中藥大辭典).Shanghai:ShanghaiScientific&TechnicalPublishers,1900.1996.3LiuMY(劉明月),MuY(牟英),KsF(李善福),et口z.Studyonantiirdlammatoryactivityofthe95%ethanolextractsofRamulmori.JShanxiCollTradChinMed(山西中醫(yī)學院),2003,4(2):1314.4Jiazs(賈之慎),TangMC(唐孟成),ZhuXR(朱祥瑞).StudyOileffectofscavengingsuperoxidefreeradicalonmulberrrflavonoids.JZhejngagricUn/v(浙江農(nóng)業(yè)大學學報),1996,22:519-523.5LiuSX(劉善瓶),JiaYY(賈元印).S