XPD基因多態(tài)性與輻射致染色體損傷關(guān)系(一)

1、XPD基因多態(tài)性與輻射致染色體損傷關(guān)系(一)【摘要】 目的 探討人類著色性干皮病基因D(XPD基因)751位點(diǎn)、312位點(diǎn)多態(tài)性與電離輻射損傷效應(yīng)之間的相關(guān)性，為篩檢電離輻射高危人群提供生物學(xué)指標(biāo)。方法 應(yīng)用病例對照研究方法，以唐山市所有從事射線工作的人員為對象，選擇有染色體異常的放射人員182人為病例組，以無輻射損傷182人為對照組，進(jìn)行11配對。染色體分析采用微量全血培養(yǎng)法，XPD基因751，312位點(diǎn)基因型檢測采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片斷長度多態(tài)性(PCRRFLP)分析。結(jié)果 XPD 751位點(diǎn)野生型AA與突變基因型(包括突變雜合子AC和突變純合子CC)在病例組與對照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2、，病例組野生基因型頻率高于對照組(OR=190，95% CI=110328，P005)。結(jié)論 XPD 751位點(diǎn)基因多態(tài)性與輻射致染色體損傷有關(guān)聯(lián)，751位點(diǎn)野生基因型AA是輻射致染色體損傷的危險(xiǎn)因素。 【關(guān)鍵詞】 電離輻射隨著射線與輻射技術(shù)應(yīng)用的愈來愈廣，職業(yè)接觸人數(shù)不斷增加，電離輻射及其對機(jī)體的損傷引起人們廣泛關(guān)注。輻射可導(dǎo)致具有嚴(yán)密超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA發(fā)生鏈斷裂，斷片游離，使染色體發(fā)生各種畸變。輻射導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)除與暴露射線的種類、劑量、受照方式、輻射品質(zhì)等因素有關(guān)外，還與機(jī)體對損傷的修復(fù)功能密切相關(guān)。研究報(bào)道，健康人群中輻射敏感性的顯著不同，其根源可能在于DNA修復(fù)酶的基因多態(tài)性1，2

3、。本研究采用11病例對照研究方法，分析2組人群的人類著色性干皮病基因(XPD)等位基因分布頻率，探討XPD基因多態(tài)性與輻射損傷易感性的關(guān)系，為尋找個(gè)體對電離輻射易感的分子標(biāo)志物提供依據(jù)。1 對象與方法11 對象 以唐山市所有從事射線工作的人員為對象(即利用射線裝置從事醫(yī)學(xué)檢查、治療、工業(yè)探傷、食品處理等領(lǐng)域的工作人員1457人)，在全面健康體檢的基礎(chǔ)上，選擇有染色體異常的放射人員182人為病例組，同時(shí)以年齡相差不超過5歲、同性別、同民族、同工作單位、同工種、累積工齡相差不超過1年，累積受照劑量相同且無輻射損傷的放射人員為暴露對照組，進(jìn)行11配對。12 現(xiàn)場調(diào)查 采用統(tǒng)一的調(diào)查表，對研究對象進(jìn)行

4、面對面調(diào)查。內(nèi)容包括基本情況、疾病史、接觸有毒有害物質(zhì)情況、吸煙情況及生活習(xí)慣等。根據(jù)放射人員登記表詳細(xì)摘錄工種、工齡、累積受照劑量及職業(yè)變動(dòng)史?，F(xiàn)場采集靜脈血5ml，取05ml加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)抗凝，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查。13 染色體分析 采用微量全血培養(yǎng)法，取靜脈血05ml,加入含有20%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)54h，收獲前46h加入秋水仙素，常規(guī)制片，姬姆薩染色，油鏡下觀察200個(gè)分散良好的中期分裂相，統(tǒng)計(jì)有畸變的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞畸變率。觀察的染色體畸變類型包括雙著絲粒染色體、斷片、微小體、環(huán)狀染色體。觀察的細(xì)胞中染色體出現(xiàn)任何一種畸變記為異常，一個(gè)細(xì)胞

5、中出現(xiàn)1條或1條以上染色體畸變均記為1個(gè)畸變細(xì)胞。14 XPD基因檢測 鹽析法提取DNA。采用聚合酶鏈反應(yīng)限制性片斷長度多態(tài)性(PCRPFLP)方法分析XPD基因751、312位點(diǎn)基因型分布情況。PCR引物序列分別為5TCAAACATCCTGTCCCTACT3和5CTGCGATTAAAGGCTGTGGA3，5TGACCGGTGCCAGGGCAACC3和5GGACACGGCTCTGCATAACC3。反應(yīng)體系為25l，含01g模板DNA、10mol/L上下游引物，25mmol/L dNTPs，25mmol/L MgCl2,10U TaqDNA聚合酶及10Buffer。反應(yīng)條件：751位點(diǎn)為94預(yù)變

6、性3min、94變性1min、58退火30s，72延伸30s為一個(gè)循環(huán)，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，結(jié)束后于72延伸5min；312位點(diǎn)為94預(yù)變性30min、94變性1min、60變性1min、72延伸50s為一個(gè)循環(huán)，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，結(jié)束后于72延伸6min。各取PCR產(chǎn)物5l，加入限制性內(nèi)切酶Pst 或Sty 置37水浴消化4h。用25%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。XPD751位點(diǎn)基因型：野生型純合子(Lys/Lys)為234bp和110bp，雜合子(Lys/Gln)為234，171，110和63bp，突變型純合子(Gln/Gln)為171，110和63bp。XPD312位點(diǎn)基因型：野生型純合子

7、(Asp/Asp)為604bp，雜合子(Asp/Asn)為640，485，119bp，突變型純合子(Asn/Asn)為485，119bp。15 統(tǒng)計(jì)分析 用Excel建庫，SAS 612統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析；定量資料進(jìn)行11配對t檢驗(yàn)、非正態(tài)分布資料用配對符號秩和檢驗(yàn)、配對計(jì)數(shù)資料用11配對2檢驗(yàn)、多分類有序及無序資料采用行列表2檢驗(yàn)、HardyWeinberg遺傳平衡定律進(jìn)行2檢驗(yàn)3。2 結(jié)果21 一般情況 本研究選擇有染色體異常的182人，其中，男143人(786%)，女39人(214%)，平均年齡(37789)歲，范圍2258歲。文化程度初中及以下15人(824%)，高中及中專87人(478

8、0%)，大專及以上80人(4396%)。對照組與病例組性別及民族一一匹配，平均年齡(38186)歲，范圍2256歲。文化程度初中及以下13人(714%)，高中及中專89人(4890%)，大專以上80人(4396%)。病例組與對照組的年齡分布、文化程度差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=0629，P005；2=0028，P005)。22 研究人群HardyWeinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn) 對研究人群進(jìn)行HardyWeinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，HardyWeinberg平衡定律的擬合優(yōu)度均優(yōu)良，樣本人群具有良好的代表性，可以從基因型頻率來估計(jì)基因頻率(2=115，P005；2=0028，P005

9、)。23 染色體損傷影響因素分析 影響放射人員外周血淋巴細(xì)胞染色體損傷的主要因素有暴露射線的種類、累積受照劑量、受照方式、吸煙情況。231 研究對象的工種分布 暴露射線的種類與工種有關(guān)，病例182人中，從事X線診斷31人，X線投照29人，CT檢查38人，核醫(yī)學(xué)12人，(導(dǎo)管室、放療、介入治療)14人，加速器操作8人，測井4人，工業(yè)探傷14人，核儀表觀測32人。對照組的工種與病例一一匹配，工種相同。232 病例組與對照組累積放射工齡及累積受照劑量比較 累積放射工齡是職業(yè)環(huán)境中機(jī)體暴露于射線的重要因素，工齡的長短可直接影響累積受照劑量的大小，病例組平均工齡(1261898)年，范圍0233年。對照

10、組平均工齡(1375943)年，范圍0234年，2組間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=1088，P005)。累積受照劑量是輻射致染色體損傷的決定性因素，在隨機(jī)效應(yīng)中，效應(yīng)發(fā)生的頻度隨劑量增加而增加，而確定性效應(yīng)，在一定的閾劑量以上，劑量越大效應(yīng)越嚴(yán)重4。病例組累積受照劑量M=2476(QL=1262，QU=4590)mSv，對照組累積受照劑量M=2523，(QL=1337，QU=4497)mSv，2組間分布經(jīng)檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)。233 病例組和對照組吸煙情況比較 為排除吸煙的影響，對182對研究對象的吸煙情況進(jìn)行比較，經(jīng)比較2組的吸煙率(病例組192%，對照組187%)及吸煙指數(shù)差異

11、無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)。24 病例組與對照組XPD751，312位點(diǎn)基因型及等位基因分布比較 結(jié)果顯示，751(A/C)位點(diǎn)野生型AA與突變型(包括突變雜合子AC和突變純合子CC)基因在2組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)，病例組野生基因型AA頻率高于對照組；312(G/A)位點(diǎn)野生型GG與突變型(包括突變雜合子GA和突變純合子AA)基因在病例組與暴露對照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)，見表1，2。表1 病例組與對照組XPD751位點(diǎn)基因型分布比較（略）表2 病例組與對照組XPD312位點(diǎn)基因型分布比較（略）對XPD751，312位點(diǎn)等位基因攜帶率比較結(jié)果顯示，751A等位基因頻率病例

12、組高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)；312位點(diǎn)等位基因兩組間頻率分布比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)，見表3。表3 XPD等位基因攜帶比較（略）3 討論31 XPD751位點(diǎn)基因多態(tài)性與染色體損傷的關(guān)系 XPD751位點(diǎn)基因多態(tài)性以35931AC替代物為特性，導(dǎo)致編碼XPD751蛋白LysGln氨基酸的改變，不同區(qū)域的氨基酸變異可能影響不同蛋白質(zhì)的相互作用，從而導(dǎo)致不同表現(xiàn)型。目前對XPD基因751(A/C)突變的意義還不十分清楚，但研究表明，可能是減少了DNA修復(fù)能力，并增加了癌癥發(fā)生的易感性5。本次研究發(fā)現(xiàn)，XPD751位點(diǎn)野生型AA與突變型基因(包括突變雜合子AC和突變純合子C

13、C)在病例組與對照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=190，95%CI=110328，P005)，病例組野生基因型頻率高于對照組。751A等位基因頻率病例組(9231%)高于對照組(8654%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=142，95%CI=105193，P005)。結(jié)果表明，751AA基因型在輻射致染色體損傷過程中可能是一種危險(xiǎn)因素。這與Angelini6、Moller7、Lunn8等的研究結(jié)果一致，他們在研究中發(fā)現(xiàn)，Lys751Lys與降低的X射線導(dǎo)致的DNA損傷修復(fù)有關(guān)。32 XPD312位點(diǎn)基因多態(tài)性與輻射致染色體損傷的關(guān)系 以往序列比對的研究結(jié)果顯示，312位點(diǎn)是一個(gè)進(jìn)化上高度保守的位點(diǎn)，

14、提示其在維持XPD蛋白功能上起一定作用；而751位于XPD蛋白的N端，保守性差，但這2個(gè)基因表型的變化均可導(dǎo)致一些反映DNA修復(fù)能力的指標(biāo)的變化9。本研究未發(fā)現(xiàn)，XPD312位點(diǎn)與輻射致染色體損傷有關(guān)聯(lián)，病例組312(GA+AA)和312GG基因型與對照組比較，分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)。312A等位基因在病例組與對照組的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P005)。Goode等的研究報(bào)道，Asp312等位基因增加肺癌風(fēng)險(xiǎn)10。Butkiewicz等的研究結(jié)果，Asp312純合子增加非小細(xì)胞肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而且發(fā)現(xiàn)XPD312Asp和751Lys多態(tài)性在所研究的人群中呈連鎖不平衡11。有研究證實(shí)，X

15、PD312Asp等位基因的變異可減弱細(xì)胞的凋亡反應(yīng)，從而使致癌物損傷的細(xì)胞存活并增殖，引起腫瘤患病風(fēng)險(xiǎn)的增高12。Joanna等在對體外淋巴細(xì)胞輻射損傷及修復(fù)的研究中發(fā)現(xiàn)，XPD312Asn等位基因與降低的修復(fù)速率有關(guān)13。本次結(jié)果中，312位點(diǎn)總突變頻率為009，遠(yuǎn)低于歐美人群032042的頻率9，可能由于種族和環(huán)境因素所致，此位點(diǎn)基因多態(tài)性與輻射致染色體損傷之間是否存在聯(lián)系，還有待進(jìn)一步探討。本次研究結(jié)果顯示，XPD基因多態(tài)性對輻射至染色體損傷存在一定影響，提示XPD基因多態(tài)性是構(gòu)成個(gè)體輻射易感性的重要因素，這對職業(yè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域識別和篩檢輻射高危人群具有一定積極的意義?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Hall

16、 J,Angele S，Radiation，DNA damage and cancerJ.Mol Med Today,1999,60(5):157-164.2 Gatti RA.The inherited basis of human radiosensitivitJ.Acta Oncol,2001,40:702-711.3 黃代新，楊慶恩.卡方檢驗(yàn)和精確檢驗(yàn)在HWE檢驗(yàn)中的應(yīng)用J.法醫(yī)學(xué)雜志，2004，20(2)：116-119.4 金泰虞.職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)醫(yī)學(xué)M.5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：297.5 Benhamuo S,Sarasin A.ERCC2/XPD polymorph

17、isms and cancer riskJ.Mutagenesis,2002,17(6):463-469.6 Sabrina Angelini,Rajiv Kumar,Fabio Carbone,et al.Micronuclei in humans induced by exposure to low level of ionizing radiation:influence of polymorphisms in DNA repair genesJ.Mutation Research,2005,570(1):105-117.7 Moller P,Wallin H,Dybdahl M,et al.Psoriasis patients with basal cell carcinoma have more repairmediated DNA strandbreaks after UVC damage in lymphocytes than psoriasis without basal cell carcinomaJ.Cancer Letter,2000,151:187-1