一種適于PCR擴增的植物基因組快速提取新方法

1、農業(yè)生物技術學報，2010年，第18卷，第2期，第394399頁Journal of Agricultural Biotechnology, 2010, Vol.18, No.2,394399技術創(chuàng)新Updated Technology一種適于PCR 擴增的植物基因組快速提取新方法李筱婷1陳卓君1許文濤1,2*元延芳2王一南2黃昆侖1,21中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院, 北京, 100083; 2農業(yè)部轉基因生物使用安全檢驗監(jiān)督測試中心, 北京, 100083*通訊作者, xuwentao1111摘要在傳統的堿裂解法提取基因組的基礎上建立了一種新的基因組提取方法，這種方法對傳統堿裂解制備

2、基因組的方法進行優(yōu)化，并且調整了中和劑的用量，引入異丙醇沉淀步驟對基因組進行純化。實驗證明這種方法擴大了堿裂解法制備基因組的適用范圍，可直接從植物種子中快速提取出用于PCR (polymerasechain reaction 模板的基因組，對于600bp 以下的目的基因的檢測效果顯著，可以發(fā)現待測組分含量大于1%的樣品。整個基因組提取時間控制在21min ，大大縮短了基因組提取時間，并且避免了酚/仿等對人體有害藥品的使用。關鍵詞DNA 提取, 堿裂/醇沉法, 中和, PCRA New Simple and Rapid Plant DNA Extraction Method for PCR An

3、alysisLi Xiaoting 1Chen Zhuojun 1Xu Wentao 1,2*Yuan Yanfang 2Wang Yinan 2Huang Kunlun 1,21College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing, 100083; 2The Supervision, Inspection and Testing Center of Genetically Modified Orginisms Food Safety, Ministry of Ag

4、riculture, Beijing, 100083*Corresponding author, xuwentao1111DOI:10.3969/j.issn.16747968.2010.02.031Abstract A new DNA extraction method was established based on the traditional alkaline lysis method. In com-parison with the former method, the conditions of the extraction reaction were optimized. Th

5、e volume of neutral-ization solution was adjusted and the isopropanol precipitation step was added for the purification of DNA. The re-sult showed that the applicability of the new NaOH-based method was extended. DNA quickly extracted by this method could be directly used as temples to amplify fragm

6、ents of the length of which were less than 600bp. If the content is more than 1%,samples could be specificly amplified. The whole process could be finished in 21min-utes, which largely shortened the extraction time. And the new method also avoided the use of toxic reagents such as tris-phenol. Keywo

7、rdsDNA extraction, Alkaline lysis/isopropanolprecipitation method, Neutralization, PCRDOI:10.3969/j.issn.16747968.2010.02.031基金項目：本研究由國家高技術研究發(fā)展計劃(863項目(2006AA10Z440、國家自然基金(No.30800770和轉基因生物重大專項(2008ZX08012001 共同資助收稿日期：20090413接受日期：20090507基于PCR 反應的分子檢測具有速度快、靈敏度高、對模板要求較低等特點，是目前應用最為廣泛的轉基因食品檢測方法。傳統的基因組

8、模板制備方法如CTAB 法、SDS 法，多是采用表面活性物質裂解樣品細胞，從而使基因組釋放出來，再經過一系列的抽提、分離，將樣品中的雜質一一除去，最終得到純凈完整的DNA 分子。這些方法的優(yōu)點是得到的基因組純度高、完整性好，在分子生物學研究上具有廣泛的應用，但是其缺點也是顯而易見的即使經過改進，整個基因組提取過程仍需要約2h ，且存在反復離心、沉淀的步驟，消耗大量的人力和時間(George,2004; Chen and Ronald, 1999 ，無法滿足快速檢測的需要。并且所用到的試劑中Tris 飽和酚、異戊醇等存在一定毒性，對檢測人員不利。目前國內外開發(fā)了多種商品化的DNA 提取純化試劑盒

9、，其分離原理有的利用核酸的分子量差異，有的利用特異性膜與DNA 結合達到分離、回收的目的，如離子交換柱、磁珠等。這些試劑盒針對不同的材料來源設計了不同的提取方法，操作簡單、高效，DNA 質量較高，但價格昂貴，提取量少(易慶平等, 2007 。堿裂解法(Klimyuket al., 1993 和高溫水煮法(Henry,1997 作為常見的快速簡便的提取基因組的方法，利用堿性、高溫等條件對植物組織進行處理，使其細胞膜溶解、蛋白變性，基因組游離出來，得到的基因組不需經過復雜的純化過程，即可直接用于PCR 反應。有資料介紹，利用堿裂解法提取基因組，每人每天可以提取超過5000個樣品(Rebeckaet

10、 al., 2003 。Manuel Porcar 等對裂解法加以改進，將以Tris-HCl 稀釋裂解后的基因組改為以3mol/LNaAc (pH=5.2 對裂解液進行中和，使堿裂解法的靈敏度大大提高(Manuelet al., 2007 。但是，在目前的文獻中，這種方法多被應用于幼嫩的根、葉等少數DNA 含量豐富的植物組織，對于樣品要求較為苛刻。本實驗采取堿裂/醇沉的方法，在Manuel Porcar 方法的基礎上加以改進，優(yōu)化中和液的用量，調整中和后體系的pH 值，最大程度的保留基因組并去除雜質，同時增加醇沉步驟，將獲得的基因組模板用異丙醇沉淀，進一步純化模板并對基因組進行濃縮，提高檢測的

11、靈敏度。整個實驗用提取過程時間為21min 。1結果與分析1.1堿裂/醇沉法與CTAB 法基因組提取效果比較以BT176玉米為實驗材料比較這兩種方法對植物基因組的提取結果，發(fā)現以CTAB 法提取的基因組片段完整，點樣孔無蛋白殘留，基因組無拖尾現象；而以堿裂/醇沉法提取的基因組呈彌散狀態(tài)，且點樣孔有少量蛋白殘留(圖1A 。對上述兩種方法進行PCR 擴增，電泳后發(fā)現PCR 產物無明顯差異(圖1B ?？梢?，堿裂/醇沉法雖然在一定程度上造成基因組的降解，但不影響基因組的PCR 擴增。1.2堿裂/醇沉法對多種植物基因組的提取結果經過瓊脂糖電泳后發(fā)現，以堿裂/醇沉法提取上述樣品得到的基因組并不令人滿意。大

12、部分樣品點樣空中有蛋白殘留，部分樣品殘留量較多。所有樣品的基因組普遍存在嚴重降解，但不同組織基因組降解情況不同，如玉米基因組條帶主要集中在1000bp 以下，部分組織甚至沒有得到電泳可見的基因組(圖2A 。圖1堿裂/醇沉法與CTAB 法提取基因組結果的比較注:A:兩種方法提取得到基因組狀態(tài); B:兩種方法提取的基因組以IVR226為引物進行PCR 擴增所得產物的電泳結果; 兩個圖中:1:DNA 模版由CTAB 法制備; 2:DNA 模版由堿裂/醇沉法制備; M:DL2000markerFigure 1Comparison of the DNA temples obtained by CTAB

13、method and alkaline lysis /isopropanol precipitation method Note:A:DNA temples obtained by the two method; B:The prod-ucts of PCR amplification with the two DNA temples; In the two figures:1:DNA temples obtained by CTAB method; 2:DNA temples obtained by alkaline lysis/isopropanolprecipitation method

14、; M:DL2000marker圖2不同植物樣品基因組模板的提取及PCR 結果注:A:不同植物樣品基因組的基因組提取結果; B:以上基因組為模板進行PCR 擴增的結果; 1:玉米; 2:花生; 3:大豆; 4:芹菜; 5:茼蒿; 6:油菜; 7:西紅柿; 8:胡蘿卜; 9:西蘭花; M:DL2000marker; 0:對照Figure 2DNA extraction from different plants and rRNA amplifi-cationNote:A:DNA extracted from different plant samples; B:PCR amplification

15、 result of the DNA temples above; 1:Maize; 2:Peanut; 3:Soybean; 4:Celery; 5:Crown daisy; 6:Rape; 7:Toma-to; 8:Carrot; 9:Broccoli; M:DL2000marker; 0:Control一種適于PCR 擴增的植物基因組快速提取新方法A New Simple and Rapid Plant DNA Extraction Method for PCR Analysis395農業(yè)生物技術學報Journal of Agricultural Biotechnology盡管如此，對提

16、取的基因組以葉綠體rRNA 180為引物進行PCR 擴增后，所有樣品均得到電泳可見的目的基因條帶，且擴增片段的亮度差異不大?？梢?，對于淀粉含量較多的樣品(如玉米 ，脂肪含量較多的樣品(如花生 ，蛋白含量較多的樣品(如大豆 ，以及各種新鮮的植物組織，以堿裂/醇沉法提取得到的基因組均可用于PCR 擴增。1.3中和劑體積對PCR 反應結果的影響以IVR226擴增玉米內標基因為例，發(fā)現中和劑用量與PCR 擴增得到目的基因條帶的亮度存在倒“U ”形關系：中和劑用量過少，不利于多糖和蛋白質的去除，導致PCR 反應所得目的基因模糊；而過高時溶液酸性過強，可能導致基因組的過度降解。經比較發(fā)現，當中和液:裂解液

17、=2:3時，所得基因組蛋白質含量最少，用于PCR 反應效果最好(圖3 。測定，此時基因組溶液的pH 值約為4.6。1.4醇沉對基因組提取結果的影響醇沉是核酸分子的提取和凈化中的常規(guī)步驟，其原理是根據核酸分子易溶于水而不溶于乙醇、異丙醇、聚乙二醇等有機溶劑的特點，向提取的基因組中加入一定體積的醇，可以將核酸分子沉淀出來，使之與醇溶性雜質分離，分離沉淀后加入少量的水溶解核酸沉淀，對核酸起到濃縮的作用。但是，在堿裂解提取基因組中，這一步卻往往被省略。然而，在對玉米基因組提取的實驗中發(fā)現，保持其他實驗步驟不變，僅僅減少異丙醇醇沉的步驟，得到的基因組電泳后看不到明顯條帶，而醇沉后的樣品有明顯的彌散條帶。

18、對以上兩組玉米基因組以IVR226為引物進行PCR 擴增，發(fā)現未經醇沉擴增后沒有得到目標基因條帶，經過醇沉后的樣品，PCR 反應后得到明顯的條帶。結果可見醇沉是此實驗中的一個關鍵步驟(圖4 ，不經過醇沉步驟得到的基因組電泳無法分辨，也不能用于PCR 反應。因此，在堿裂解法中添加醇沉步驟，是提取結果成功并穩(wěn)定的保證。1.5堿裂/醇沉法對不同長度目的基因的擴增效果從以上實驗中可以看到，由堿裂/醇沉法所得植物基因組因降解而呈現彌散狀態(tài)，基因組電泳條帶主要集中1000bp 以下，而以上實驗中所擴增的基因均為200bp 左右的植物內標基因，因此有較好的擴增效果。為了比較該方法對不同片段大小的基因的擴增效

19、果，實驗選擇了Bt176玉米中的三段基因作為擴增對象，相應的引物分別為Bt176(570bp ，圖3不同體積中和液對PCR 反應的影響注:16:樣品提取時加入中和液體積依次為1/6,1/3,1/2,2/3,3/4,1/1;每個體積做兩組平行; P:陽性對照; 0:空白對照; M:DL2000markerFigure 3Effect of various volumes of neutralization solution on PCR assayNote:16:The dosages of neutralization solution were 1/6,1/3,1/2,2/3,3/4,1/1

20、;Each dosage had a parallel design study; P:Positive control; 0:Blank control; M:DL2000markerBt176(100bp 和CAMV35S (195bp 。從電泳結果來看，堿裂/醇沉法提取的基因組盡管已經片段化，且Bt176(570bp 擴增結果中存在非特異性條帶，但是主條帶亮度明顯高于非特異性條帶，因此并不影響600bp 左右片段大小目的基因片段的擴增效果，且擴增效果比CTAB 法提取的基因組作為模板的擴增效果要稍好，這可能因為基因組片段化后減少了染色體空間折疊造成的位阻，使得引物與目的片段更容易結合。同

21、樣對于195bp 的CAMV35S 基因和100bp 的品系特異性片段也獲得了良好的擴增效果，也就是說對于堿裂/醇沉法提取的基因組對于600bp 以下的目的片段擴增效果比較理想，甚至比CTAB 法提取的基因組的擴增效果更好(圖5 。經過多次重復，堿裂/醇沉法提取的基因組提取效果和PCR 擴增效果也非常穩(wěn)定(圖略 。由此可以看出，圖4醇沉對PCR 反應的影響注:1:經過醇沉所得基因組的PCR 產物; 2:未經醇沉基因組的PCR 產物; M:DL2000marker; 0:空白對照Figure 4Effect of isopropanol precipitation on PCR assay No

22、te:1:PCR products of the DNA temple precipitated by iso-propanol; 2:PCR products of the DNA temple not precipitated by isopropanol; M:DL2000marker; 0:Blank control396一種適于PCR 擴增的植物基因組快速提取新方法A New Simple and Rapid Plant DNA Extraction Method for PCR Analysis本實驗優(yōu)化的堿裂/醇沉法比其他快速提取法能夠提取出更高質量的基因組，并且基因組中因為成分

23、大大減少也減輕了堿裂法對于PCR 反應的抑制效果。由于目前轉基因成分定性檢測的目的擴增片斷基本都小于600bp ，所以堿裂/醇沉法完全可以滿足轉基因產品快速檢測的需要。1.6堿裂/醇沉法的靈敏度將研磨后的玉米樣品與大豆樣品按質量比10%、1%、0.1%混合后，采用堿裂/醇沉法提取基因組，經過以玉米內標基因IVR226為引物的PCR 擴增后，以純玉米樣品提取基因組擴增產物為陽性對照，純大豆樣品擴增產物為陰性對照，發(fā)現當玉米的含量小于等于1%時，PCR 擴增后可以得到肉眼可辯的目的基因條帶，繼續(xù)增加大豆的含量，則超過該方法的分辨范圍，無法的到目標條帶，堿裂/醇沉法可圖5以堿裂/醇沉法擴增不同片段大

24、小的目的基因的結果注:13:以引物Bt176(570bp 擴增的結果; 1:以堿裂醇沉法提取基因組為模板; 2:以CTAB 法提取基因組為模板; 3:陰性對照; 46:以引物CAMV35S (195bp 擴增的結果; 4:以堿裂醇沉法提取基因組為模板; 5:以CTAB 法提取基因組為模板; 6:陰性對照; 79:以引物Bt176(100bp 擴增的結果; 7:以堿裂醇沉法提取基因組為模板; 8:以CTAB 法提取基因組為模板; 9:陰性對照; M:DL2000markerFigure 5PCR amplification of the DNA temple obtained by alka-l

25、ine lysis /isopropanol precipitation method for the target frag-ments with different lengthNote:13:PCR amplification result with the primers of Bt176(570bp; 1:DNA temples obtained by CTAB method; 2:DNA temples obtained by alkaline lysis/isopropanolprecipitation method; 3:Negative control; 46:PCR amp

26、lification result with the primers of CAMV35S (195bp; 4:DNA temples obtained by CTAB method; 5:DNA temples obtained by alkaline lysis /iso-propanol precipitation method; 6:Negative control; 79:PCR amplification result with the primers of Bt176(100bp; 7:DNA temples obtained by CTAB method; 8:DNA temp

27、les obtained by alkaline lysis/isopropanolprecipitation method; 9:Negative con-trol; M:DL2000marker以分辨含量大于1%的樣品(圖6 。2討論經過以上的實驗發(fā)現，與Manuel Porcar 的方法相比，堿裂/醇沉法明顯擴大樣品的適用范圍，得到令人滿意的實驗結果。PCR 反應結果顯示，堿裂/醇沉提取的基因組雖然存在降解，但適用于600bp 以下目的基因的擴增，擴增效果甚至好于傳統CTAB 法提取的基因組模版，而且反應靈敏度高，可用于在復雜的食物體系中發(fā)現含量在1%以上的樣品。但是堿裂解法提取的基因組

28、不宜長期保存，實驗中發(fā)現基因組保存超過3d ，PCR 擴增效果明顯下降；超過7d ，則擴增后無法得到目的基因。因此，提取基因組后及時進行PCR 擴增是實驗成功的重要保證。為了證明堿裂/醇沉法的普適性，在實驗材料的選擇上，考慮到植物的可食器官主要有根、莖、葉、花、果實、種子，選擇的植物樣品不僅來自不同種屬，而且包含了以上六種器官，并且所選擇的樣品成分差異明顯多糖、蛋白質、脂肪等含量豐富的樣品都有所涉及。用堿裂/醇沉法制備以上來源和組成差異明顯的植物樣本，均得到很好的效果，因此證明了堿裂/醇沉法的普適性。本實驗中中和劑3mol/LNaAc (pH=5.2 的作用是：一方面，裂解液為高pH 值的Na

29、OH 溶液，因此向樣品中加入裂解液后，富含淀粉的植物組織在高pH 的條件下因淀粉糊化而呈現粘稠狀態(tài)，即使長時間高速離心也無法得到上清液，嚴重影響植物基因組的提取，加入中和液后可以破壞淀粉糊化狀態(tài)，便于離心分離；另一方面，中性鹽溶液(如NaAc 、NaCl 等圖6堿裂醇沉法靈敏度檢測注:1:純玉米樣品; 24:玉米含量10%、1%、0.1%的玉米大豆混合樣品; 5:純大豆樣品; 6:空白對照; M:DL2000marker Figure 6Sensitivity of alkaline lysis /isopropanol precipitated methodNote:1:Maize; 24:

30、Mixtures of maize and soybean, the con-tents of maize were 10%, 1%and 0.1%; 5:Soybean; 6:Blank control; M:DL2000marker397農業(yè)生物技術學報Journal of Agricultural Biotechnology具有沉淀多糖、蛋白質的作用(Dellaportaet al., 1983; Fang et al., 1992 ，可以有效去除雜質，凈化基因組。經過中和的基因組由于含有大量鹽離子，離子強度較大，且基因組濃度較小，直接用于PCR 反應可能導致結果呈現假陰性。引入醇沉步驟

31、，可以對基因組進行洗滌，進一步去除醇溶性雜質，降低離子強度，同時也起到濃縮作用，增加了方法的靈敏度。堿裂/醇沉法使用的試劑均為分子生物學實驗室的常見試劑，試劑成本低、毒性小、安全性好，對條件要求寬松，且方法簡便，尤其適用于新鮮樣品的快速檢測。但是，由于得到的基因組仍存在雜質，醇沉后的基因組不易吹干，對基因組的溶解可能造成一定困難，溶解時用槍頭將沉淀搗碎混勻即可。3材料與方法3.1材料糧谷類：BT176轉基因玉米(Zea mays 、大豆(Glycine max 為實驗室儲備，花生(Arachis hypogaea 購自中國農業(yè)大學家屬區(qū)菜市場，用粉碎機粉碎后過60目篩子備用；莖類：茼蒿(Chr

32、ysanthemum coro narium 、芹菜(Apium gravelens 取莖部分，液氮研磨后備用；葉類：油菜(Brassica campestris ，取新鮮葉子加液氮研磨后備用；根類：胡蘿卜(Daucus carota ，去皮后取式適量樣品，加液氮研磨后備用；花類：西蘭花(Brassica capitata var. italica ，去除莖部，僅保留花，加液氮研磨后備用；果實類：番茄(Lycopersiconesculentum ，去除果蒂，取果肉加液氮研磨后備用。除糧谷類外，其他樣品均購自中國農業(yè)大學家屬區(qū)菜市場。醋酸鈉，3mol/LpH =5.2；氫氧化鈉，0.5mol/

33、L；乙醇，70；異丙醇，100。以上均采用分析純試劑配制。10×PCR Buffer ：100mmol/LTris-HC1，500mmol/LKCl ，15mmol/LMgCl 2；dNTPs 混合液，各2.5mmol/L；TaKaRa Taq TM DNA 聚合酶5U/L，大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖，上海Yito 企業(yè)有限公司；DL2000DNA marker 300ng/5L，大連寶生物工程有限公司；rTaq DNA 聚合酶、dNTP 、DNA Marker DL 2000購于Sigma 公司。本實驗所用引物均由上海生工合成。3.2DNA 提取方法堿裂/醇沉法：稱取0.05g

34、 樣品于1.5mL Ep-pendorf 管中，加入500L 0.5mol/LNaOH 溶液，用槍頭小心攪拌使其充分混勻，沸水浴加熱1min 。取出后加入3mol/LNaAc (pH=5.2 333L 中和，顛倒混勻，離心(12000r/min10min 。將上清轉移到新的1.5mL Eppendorf 管中，加入與上清等體積的異丙醇，混勻后離心(12000r/min10min 。棄去上清，沉淀加70%無水乙醇洗滌后吹干，加50L 水溶解，用于PCR 反應(樣品及中和液用量可根據不同樣品進行調整, 如果加入NaAc 離心后上清太多, 可將上清分兩部分醇沉, 最后合并沉淀 。CTAB 法：稱取0

35、.05g 樣品與1.5mL Eppendorf 管中，加入700L CTAB 緩沖液(100mmol/LTris-HCl (pH8.0, 1.4mol/LNaCl, 20mmol/LEDTA, 20g/LCTAB ，混合均勻后放入65水浴中保溫1h ，期間每10min 振蕩離心管一次。然后轉移上清，加入與上清等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1混合液，顛倒混勻，12000r/min離心10min 。轉移上清，加入等體積的氯仿:異戊醇混合液，顛倒混勻，12000r/min離心10min 。轉移上清，加入2/3倍體積的異丙醇，1/10體積的醋酸鈉溶液，輕柔地顛倒混勻。冰浴30min 。1200

36、0r/min離心10min ，棄去上清，用一定體積70%的乙醇懸浮沉淀，12000r/min離心2min 。倒掉乙醇，干燥DNA 沉淀。加入50L 水，充分溶解，最后加入5L RNA 酶，消化30min, 得到的基因組可用于電泳及PCR 擴增(許文濤等, 2005 。3.3PCR 反應PCR 反應在30L 體系中進行，體系組成包括10×PCR buffer 3L ，2.5mmol/LdNTP 2.4L ，上、下游引物各1.5L ，Taq DNA 聚合酶0.4L ，提取的DNA 1L, 用水補足30L 。擴增程序為94預變性5min ，94變性30s ，58退火30s ，72延伸30s

37、 ，共35個循環(huán)，最后72延伸10min 。本實驗所用PCR 擴增引物見表1。3.4瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳緩沖液為1×TAE ，GOLDVIEW 染色，凝膠成像儀拍照。參考文獻Chen D.H., and Ronald P.C., 1999, A rapid DNA miniprepara-tion method suitable for AFLP and other PCR applications, Plant Molecular Biology Reporte, 17:53-57Dellaporta S.L.

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39、this study 基因 Gene IVR 引物名稱 Primer IVR226 引物序列(5'3' Primer sequence ( 5'3' 長度(bp 片段(bp 溫度( 參考文獻 Size (bp Segment Tm ( Reference 226 180 570 100 195 58 58 58 58 58 399 F: 5'CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTCAC3' 25 R: 5'GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC3' 25 20 21 21 23 21 19 21 許芳等, 200

40、8 GB/T 19495.42004 農業(yè)部 869 號 公告 82007 許文濤等, 2005 許芳等, 2008 Chloroplast Chloroplast rRNA180 F: 5'CGAAATCGGTAGACGCTACG3' rRNA BT176 BT176 CAMV35S BT176570 BT176100 CAMV35S195 R: 5'TTCCATTGAGCTTCTGCACCT3' F: 5'AAGCACGGTCAACTTCCGTAC3' R: 5'TCGACTTTATAGGAAGGGAGAGG3' F: 5&#

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