MAL基因在人食管癌中表達顯著下調(diào)

1、    MAL基因在人食管癌中表達顯著下調(diào)        【摘要】目的研究MAL基因在人食管癌中的表達下調(diào)狀況。方法采用Northern雜交和RT-PCR方法檢測了MAL基因在41對配對的食管癌組織和相應(yīng)癌旁食管粘膜中的表達；應(yīng)用PCR和RT-PCR方法分析了MAL基因在3個食管癌細胞系EC109、EC8712和EC9706中的存在及其表達。結(jié)果MAL基因的表達水平在92.7%(38/41)食管癌組織中明顯低于同一患者的癌旁食管粘膜。同時，MAL基因在3個食管癌細胞系中未見表

2、達。PCR分析顯示，這3個食管癌細胞系中均存在被分析的MAL基因片段。結(jié)論MAL基因表達下調(diào)是食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的一個頻發(fā)事件。【主題詞】食管腫瘤MAL基因基因表達聚合酶鏈反應(yīng) MAL gene is down-regulated substantially in human esophageal cancerXU Zhixiong, WANG Mingrong, CAI Yan, et al. National Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences a

3、nd Peking Union Medical College, Beijing 100021【Abstract】ObjectiveTo investigate the status of expression of MAL gene in human esophageal cancer. MethodsExpression of MAL gene was analyzed by Northern blot and/or RT-PCR in 41 pairs of human esophageal cancer tissues and matched adjacent normal mucos

4、a, and three human esophageal cancer cell lines EC109, EC8712 and EC9706. MAL gene was analyzed by PCR in the three esophageal cancer cell lines.Results MAL gene expression was down-regulated substantially or barely detectable in 93%(38/41) of human esophageal cancer tissues while expressed at high

5、level in all matched adjacent normal esophageal mucosa. In all 3 human esophageal cancer cell lines, expression of MAL gene was not detectable. PCR analysis showed that the MAL gene fragment analyzed was intact in the three esophageal cancer cell lines.ConclusionDown-regulation of MAL gene expressio

6、n is of frequent occurrence in human esophageal cancer.【Subject words】Esophageal neoplasmsMAL geneGene expressionPolymerase chain reaction腫瘤的發(fā)生、發(fā)展涉及到一系列基因的結(jié)構(gòu)改變和(或)表達異常。當前的研究重點已逐漸轉(zhuǎn)向表達研究，即從質(zhì)（結(jié)構(gòu)）的改變轉(zhuǎn)向質(zhì)和量（表達）的改變1。腫瘤中表達下調(diào)基因分離是當前篩選候選抑癌基因的一種重要途徑。我們應(yīng)用一種改進的mRNA差異顯示技術(shù)，分離了30多個在3對配對食管癌組織中均表達下調(diào)的cDNA片段2。其中的一個cDNA

7、片段是人MAL基因的3末端。已有報道MAL基因與T細胞和尿路上皮分化相關(guān)3，4，但至今尚未發(fā)現(xiàn)MAL基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起作用。本研究顯示，MAL基因在92.7%(38/41)的人食管癌組織中表達顯著下調(diào)。材料與方法1.材料：13對和28對食管癌組織及相應(yīng)配對癌旁食管粘膜分別取自河南省安陽市腫瘤醫(yī)院和本院住院患者。EC109、EC8712和EC9706為我室建立的人食管鱗癌細胞系5，細胞常規(guī)培養(yǎng)5至70%80%飽和密度用于總RNA和基因組DNA提取?？俁NA應(yīng)用Trizol試劑(Gibco公司)提取后用無RNase的DNase處理?；蚪MDNA采用常規(guī)蛋白酶K-酚法提取。2.Northern

8、雜交：20 g總RNA經(jīng)1.2%變性瓊脂糖凝膠電泳分離后吸印至Zeta-Probe尼龍膜(Bio-Rad)。應(yīng)用Prime-a-Gene系統(tǒng)(Promega公司)制備MAL（-28至+500核苷酸）探針。按照尼龍膜使用說明書進行預雜交、雜交和洗膜，-75放射自顯影2050小時。-actin雜交帶作為加樣對照。3.RT-PCR分析：3 g總RNA用Superscript (Gibco公司)合成cDNA第一鏈。RT-PCR條件：30 l反應(yīng)體系含cDNA 1 l，1×PCR緩沖液，1.5 mmol/L MgCl2，200 mol/L dNTPs, MAL和a-tubulin引物各0.5

9、mol/L，Taq酶1.5U(Gibco公司)。94預變性3分鐘，9430秒，6030秒，7240秒，共30個循環(huán)后，72延伸5分鐘。RT-PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠(含0.1 mg/ml溴化乙錠)電泳檢測。MAL和a-tubulin的PCR產(chǎn)物大小分別為166 bp和410 bp。引物序列：MAL基因：上游：5-AAGAT-CCTCTGCTGACCCCT-3；下游：5-ACCATGGACCTC-TGGAAAGA-3。a-tubulin：上游：5-CTCATCACAGG-CAAGGAAGGAT-3；下游：5-TTAAGGTTAGTGTAG-GTTGGGC-3。4.PCR分析3個人食管癌細胞

10、系中的MAL基因：30 l PCR反應(yīng)體系含基因組DNA 200 ng，其余條件與RT-PCR相同。結(jié)果Northern雜交結(jié)果顯示，MAL基因在14/15食管癌組織中表達顯著下調(diào)(1)。其中，在14例食管癌組織中未見其表達，而癌旁食管粘膜均高表達。1例的MAL基因表達下調(diào)不明顯。T：食管癌組織；N：癌旁食管粘膜1Northern雜交檢測MAL基因在人配對食管癌組織中的表達RT-PCR結(jié)果表明，MAL基因在33/35食管癌組織中的表達明顯低于相應(yīng)的癌旁食管粘膜(2)。未見表達和微弱表達的食管癌組織分別為21例和12例，而所有癌旁食管粘膜均高表達。同時，MAL基因在3個食管癌細胞系EC109、E

11、C8712和EC9706中也未見表達，而PCR分析顯示在這3個食管癌細胞系中都存在166 bp的MAL基因片段。T：食管癌組織；N：癌旁食管粘膜；-：無模板DNA的陰性對照；M：?X174/Hae 分子量標志物2RT-PCR檢測MAL基因在人配對食管癌組織和細胞系中的表達同時應(yīng)用RT-PCR和Northern雜交檢測了其中9對食管癌組織的MAL基因表達，Northern雜交與RT-PCR分析的結(jié)果相符。RT-PCR結(jié)果顯示，MAL基因在5/9例食管癌組織中未見表達，在另外4/9例微弱表達；而Northern雜交則均未檢測到其表達。上述結(jié)果可能是由于PCR擴增技術(shù)靈敏度較高的緣故。討論MAL基因

12、由Alonso3等于1987年分離得到，定位于2q13，含4個外顯子，其cDNA全長為1 051 bp。MAL基因具有4種不同的剪接方式6。在人食管粘膜中，MAL基因主要以1.1 kb轉(zhuǎn)錄本存在（1）。近來的研究表明，MAL、BENE、Plasmolipin和EST克隆H09290同屬于一個大的基因家族。結(jié)構(gòu)分析顯示，它們均為四折跨膜蛋白質(zhì)，是不溶于去垢劑的富含糖脂和膽固醇的膜微結(jié)構(gòu)域成分7-9。MAL基因家族成員在多種組織如胃腸道、肺和腎等廣泛表達，而且不同種屬之間有同源蛋白質(zhì)，提示它們在細胞中具有重要的功能，但MAL基因的生物學功能至今尚不清楚。最初Alonso等3發(fā)現(xiàn)MAL基因僅在T細胞

13、分化的中、后期表達，推測它與T細胞分化相關(guān)。而Liebert等4觀察到MAL基因在分化的尿路上皮細胞中表達上調(diào)，故認為其表達與尿路上皮分化相關(guān)。最近的研究表明，MAL基因可能是高爾基體和遠端質(zhì)膜之間囊泡轉(zhuǎn)運和蛋白質(zhì)分選的一個功能成分8，9。轉(zhuǎn)染MAL基因后SF21昆蟲細胞形成與哺乳動物細胞類似的囊泡結(jié)構(gòu)10。我們應(yīng)用Northern雜交和RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)MAL基因在92.7%（38/41）食管癌組織中表達顯著下調(diào)，且在3個食管癌細胞系未見表達。這顯示，MAL基因表達下調(diào)是食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的一個頻發(fā)事件。另外，MAL基因家族成員BENE在食管癌組織中也表達下調(diào)；以MAL探針進行Nor

14、thern雜交還發(fā)現(xiàn)3.1 kb和6.0 kb兩個未知的轉(zhuǎn)錄本，他們在食管癌組織中也未見表達（結(jié)果未顯示）。據(jù)此我們推測，MAL基因家族的其他成員也可能參與食管癌發(fā)生和(或)發(fā)展。由于MAL基因涉及到細胞分化、細胞內(nèi)運輸以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等重要過程，有必要深入研究其生物學功能及其基因表達調(diào)節(jié)機制。PCR分析顯示，在食管癌細胞系EC109、EC8712和EC9706中都存在被分析的MAL基因片段。MAL基因表達下調(diào)的機制尚不明確，可能涉及到其啟動子區(qū)甲基化、編碼序列突變或其上游調(diào)控基因的功能異常。本課題受863重大項目基金(編號Z19-02-01-03)、九五攻關(guān)項目基金(編號96-906-01-

15、22)和攀登項目(編號 18)資助作者單位：100021 北京，中國醫(yī)學科學院中國協(xié)和醫(yī)科大學腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點試驗室參考文獻1Sager R. Expression genetics in cancer: shifting the focus from DNA to RNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94: 952-955.2許智雄，王明榮，蔡巖，等.人食管癌表達下調(diào)基因的分離和表達分析.見：孫方臻，主編.中國科協(xié)第三屆青年學術(shù)年會論文集.北京：中國科學技術(shù)出版社，1998.226-228.3Alonso MA, Weissman SM. cDN

16、A cloning and sequence of MAL, a hydrophobic protein associated with human T-cell differentiation. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84: 1997-2001.4Liebert M, Hubbel A, Chung M, et al. Expression of MAL is associated with urothelial differentiation in vitro: identification by differential display revers

17、e-transcriptase polymerase chain reaction. Differentiation, 1997, 61: 177-185.5王秀琴，肖楓，王明榮，等.兩個人食管癌細胞系的建立及染色體分析.中華腫瘤雜志，1998, 20: 5-8.6Rancano C, Rubio T, Alonso MA. Alternative splicing of human T-cell-specific MAL mRNA and its correlation with the exon/intron organization of the gene. Genomics, 1994

18、, 21: 447-450.7Pérez P, Puertollano R, Alonso MA. Structural and biochemical similarities reveal a family of proteins related to the MAL proteolipid, a component of detergent-insoluble membrane microdomains. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 232: 618-621.8Magyar JP, Ebensperger C, Schaeren-Wiem

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