慢病毒載體介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因在小鼠T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)

1、慢病毒載體介導(dǎo)綠色熒光蛋白基因在小鼠T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)    【摘要】 本研究構(gòu)建含綠色熒光蛋白基因的慢病毒載體三質(zhì)粒系統(tǒng)，并觀察其在小鼠T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況。應(yīng)用亞克隆技術(shù)將多聚嘌呤通道（PPT）元件、泛醌啟動子（PUB）和綠色熒光蛋白基因（GFP）連接至pLO134載體，構(gòu)建成pTK153載體。之后應(yīng)用磷酸鈣沉淀法將慢病毒載體三質(zhì)粒系統(tǒng)（包括包裝質(zhì)粒NRF、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTK153和包膜蛋白質(zhì)粒VSV?G）共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，12小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，72小時(shí)收集病毒上清并感染小鼠T淋巴細(xì)胞，在熒光顯微鏡下和應(yīng)用流式細(xì)胞儀（FA

2、CS）觀察感染情況。結(jié)果表明：慢病毒載體的三質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞12小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白表達(dá)，F(xiàn)ACS分析轉(zhuǎn)染效率為（63.04±7.24）%，病毒滴度測定為（3.09±0.61）×106 U/ml。感染小鼠T淋巴細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察到GFP的表達(dá)，F(xiàn)ACS分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為（37.98±6.26）%。結(jié)論：成功構(gòu)建了含綠色熒光蛋白基因的慢病毒載體，對小鼠T淋巴細(xì)胞有較高的感染效率。    【關(guān)鍵詞】 慢病毒載體 T淋巴細(xì)胞 綠色熒光蛋白基因    Ex

3、pression of Green Fluorescent Protein Gene in Mouse T Lymphocytes Mediated by Lentiviral Vector    Abstract    This study was purposed to constructe the three?plasmid system of the lentiviral vector carrying the green fluorescent protein (GFP) gene and to inve

4、stigate the expression of GFP in T lymphocytes of the mouse. The polypurine tract (PPT) element, ubiquinone promoter (PUB) and GFP were ligated to plasmid pLO134 using subcloning technology to construct plasmid pTK153. Human kideny 293T cells were co?transfected with the three?plasmid system contain

5、ing packaging plasmid NRF, plasmid pTK153 and envelope plasmid VSV?G by using calcium phosphate DNA precipation and the expression of GFP was observed under fluorescence microscope after 12 hours. The viral particles were collected after transfection 72 hours, were frozen at -80 and were used to inf

6、ect mouse T lymphocytes at multiplicity of infection (m.o.i .) of 3. The expression of GFP in mouse T lymphocytes was observed by fluorescence microscopy and fluorescence?activated cell sorting (FACS). The results showed that the transfection efficacy was 63.04±7.24% in 293T cells analysed by F

7、ACS and the viral titer was (3.09±0.61)×106 U/ml. The expression of GFP was also evident in mouse T lymphocytes and the transduction efficacy was (37.98±6.26)%. It is concluded that the three?plasmid system of lentiviral vector containing GFP gene is successfully constructed and the t

8、ransduction efficacy is high in mouse T lymphocytes.    Key words    lentiviral vector; mouse T lymphocytes; green fluorescent protein gene    J Exp Hematol 2007; 15(1):125-128    逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（retroviral vector， RV）系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于臨

9、床前及臨床的基因轉(zhuǎn)移研究，雖然對其復(fù)制以及轉(zhuǎn)導(dǎo)外源目的基因至細(xì)胞的相關(guān)機(jī)理研究得較為深入，但是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期細(xì)胞，因而其應(yīng)用于臨床基因治療受到了一定的限制1。圍繞這一問題，近年來人們把目光投向了來源于包括人類免疫缺陷病毒?1（human immunodeficiency virus?1， HIV?1）在內(nèi)的慢病毒載體（lentiviral vector， LV）。LV最大的特點(diǎn)是可以感染非分裂期細(xì)胞如神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、造血干細(xì)胞、胰島細(xì)胞、肌肉細(xì)胞等2。我們構(gòu)建了以HIV?1為基礎(chǔ)的LV三質(zhì)粒系統(tǒng)，并以綠色熒光蛋白基因（green fluorescent protein g

10、ene， GFP）作為標(biāo)志基因，觀察其在小鼠T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)情況。    LV三質(zhì)粒系統(tǒng)的構(gòu)建及鑒定    用限制性內(nèi)切酶BamH和Bgl分別從pTK131、pTK145及pTK54切下PPT元件、PUB啟動子及GFP基因，用T4DNA連接酶依次將PPT元件、PUB啟動子及GFP基因連接至由BamH酶切并經(jīng)牛小腸堿性磷酸酶去除5'?P的載體pLO134上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5，同時(shí)設(shè)立空白對照。37過夜培養(yǎng)，次日從連接板挑取6-8個克隆進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，用Promega公司質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒后

11、，分別用限制性內(nèi)切酶EcoR、Sac和Age Xba鑒定連接產(chǎn)物的正反向。包裝質(zhì)粒NRF、包膜蛋白質(zhì)粒VSV?G、pTK131、pTK145及pTK54均為本科徐開林教授構(gòu)建。    慢病毒載體包裝細(xì)胞系的建立    應(yīng)用Ivitrogen 公司無內(nèi)毒素的質(zhì)粒中量提取試劑盒提取pTK153、NRF及VSV?G用于轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)選擇生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞按13傳代，24小時(shí)后細(xì)胞生長達(dá)60%-70%匯合時(shí)采用磷酸鈣沉淀法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTK153 15 g、NRF 10 g、VSV?G 5 g、CaC

12、l2 125 l，補(bǔ)加消毒的雙蒸水至500 l，在渦旋混合器上邊振蕩邊加入500 l 2×BES，室溫放置30分鐘。將轉(zhuǎn)染液加到培養(yǎng)板中，輕輕混勻，3% CO2、37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3小時(shí)后，加入血清使其終濃度為10%，12小時(shí)后更換完全培養(yǎng)基，5% CO2、37培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況及FACS測定GFP陽性率。    病毒滴度測定    在6孔板中分別接種2×105的293T細(xì)胞，將所收集的上清按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6進(jìn)行系列稀釋，將

13、1 ml 稀釋后的病毒液分別加入到相應(yīng)的孔中，48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察各孔中GFP的熒光表達(dá)情況，計(jì)數(shù)表達(dá)GFP的細(xì)胞個數(shù)，乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即得到病毒滴度。    病毒顆粒感染小鼠T淋巴細(xì)胞    取BALB/c小鼠脾細(xì)胞，在RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)3天后，用臺盼藍(lán)染色法測定活細(xì)胞數(shù)，然后按2×106/ml細(xì)胞與包裝好的慢病毒顆粒按m.o.i 13感染病毒顆粒，共同培養(yǎng)，24小時(shí)后重復(fù)感染1次。48小時(shí)后在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況或通過FACS計(jì)數(shù)GFP表達(dá)陽性率。 

14、0;  結(jié)    果    載體構(gòu)建    從pTK131用BamH和Bgl切下154 bp的PPT元件，連接至pLO134的BamH后，經(jīng)EcoRI單酶切后，獲得的正向連接片段為170 bp、7745 bp，構(gòu)建成pTK134（PPT元件）；再連接從pTK145切下的1224 bp的PUB啟動子，用SacII單酶切鑒定，正向連接所得片段為560 bp、1212 bp和7367 bp，構(gòu)建出pTK151（PPT PUB）；最后連接從pTK54切下的780

15、bp的GFP基因，用AgeI和XbaI酶切鑒定，正向連接所得片段為800 bp和9125 bp，獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pTK153（PPT PUB GFP）。    慢病毒載體的包裝    用磷酸鈣沉淀法將構(gòu)建好的三質(zhì)粒pTK153、NRF及VSV?G轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，12小時(shí)在熒光顯微鏡下觀察到293T細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光（圖1），證實(shí)了GFP基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后熒光顯微鏡下再觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中熒光強(qiáng)度較12小時(shí)時(shí)有所增強(qiáng)，F(xiàn)ACS分析轉(zhuǎn)染效率為（63.04±7.24）%，從而建立了慢病毒載體系統(tǒng)的包裝細(xì)胞系。

16、    病毒滴度的測定    將轉(zhuǎn)染72小時(shí)后包裝細(xì)胞上清液再感染293T細(xì)胞，48小時(shí)后測定6孔板中慢病毒載體的滴度。在未進(jìn)行超速離心的情況下，病毒滴度測定結(jié)果為（3.09±0.61）×106 U/ml。與常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的滴度相近，說明慢病毒載體包裝后容易獲得較高的病毒滴度。    感染T細(xì)胞情況    感染小鼠T淋巴細(xì)胞48小時(shí)后，熒光顯微鏡下觀察到T淋巴細(xì)胞內(nèi)含有綠色熒光（圖2），證實(shí)GFP基因在其中的表

17、達(dá)，F(xiàn)ACS分析轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為（37.98±6.26）%，較本實(shí)驗(yàn)室同樣條件下逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染小鼠T淋巴細(xì)胞的效率（23.2±3.5）%為高（P0.01）。    討    論    作為基因治療中常用的靶細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞是處于非分裂期的細(xì)胞，在移植物抗宿主病等疾病中起到重要的作用。提高目的基因?qū)細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率對于對這類疾病實(shí)施基因治療具有重要的意義，這是目前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。尋找新型的載體是其中的方法之一。常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低，本實(shí)驗(yàn)室既

18、往應(yīng)用其轉(zhuǎn)導(dǎo)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為（23.2±3.5）%3，采用慢病毒載體后，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率達(dá)到（37.98±6.26）%，有較明顯的提高。慢病毒載體最大的特點(diǎn)是可以感染非分裂期細(xì)胞，這是由其自身結(jié)構(gòu)所決定的4。HIV?1為RNA雙鏈分子，其單鏈由9 749個核苷酸組成，共有9個基因，除包括與簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒相同的gag、pol和env 3個編碼病毒顆粒的基本結(jié)構(gòu)基因外，還有2個調(diào)節(jié)基因tat和rev及4個輔助基因vif、vpr、vpu和nef。在病毒復(fù)制的過程中，gag編碼的基質(zhì)蛋白、pol編碼的整合酶和vpr輔助蛋白形成整合前復(fù)合物，其本身具有核定位信號，有利于整合前復(fù)合物進(jìn)入靶

19、細(xì)胞核，而不完全依賴靶細(xì)胞的分裂狀態(tài)，此為慢病毒可感染非分裂細(xì)胞的主要機(jī)制5。    目前慢病毒多采用三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，包括包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，其中包裝質(zhì)粒在CMV啟動子的控制下，表達(dá)HIV?1復(fù)制所需的全部反式激活蛋白，但不產(chǎn)生病毒包膜蛋白及輔助蛋白vpu；包膜蛋白質(zhì)粒編碼水泡性口炎病毒G蛋白（VSV?G），應(yīng)用VSV?G包膜的假構(gòu)型慢病毒載體擴(kuò)大了載體的靶細(xì)胞嗜性范圍，而且增加了載體的穩(wěn)定性，允許通過高速離心對載體進(jìn)行濃縮，提高了滴度；轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中除含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的順式序列，還保留350 bp的gag和RRE，并在其中插入目的基

20、因。將載體系統(tǒng)分成三個質(zhì)粒最大的益處是使序列重疊的機(jī)會大大減少，減少載體重組過程中產(chǎn)生有復(fù)制能力野生型病毒的可能性。通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，超速離心后病毒滴度可達(dá)109 U/ml6。    在本實(shí)驗(yàn)中我們成功構(gòu)建了以PUB啟動子為內(nèi)部啟動子、GFP基因?yàn)闃?biāo)志基因的慢病毒載體的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)。三質(zhì)粒系統(tǒng)中的包裝質(zhì)粒NRF，內(nèi)含人巨細(xì)胞病毒早期啟動子和來自胰島素基因的Poly(A)位點(diǎn)；包膜蛋白質(zhì)粒編碼VSV?G。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中以GFP基因作為標(biāo)志基因，利用GFP基因作為標(biāo)志基因可以非常直觀、方便地觀察到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，縮短了實(shí)驗(yàn)流程。將此三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

21、后，熒光顯微鏡下觀察到了GFP的表達(dá)，建立了慢病毒載體的包裝細(xì)胞系。病毒滴度的測定在未進(jìn)行超速離心的情況下仍然達(dá)到106 U/ml，與常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體滴度相近，說明應(yīng)用慢病毒載體比較容易獲得較高的病毒滴度，這對于進(jìn)一步感染靶細(xì)胞獲得較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是至關(guān)重要的。    雖然我們試驗(yàn)中對T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有所提高，但是要將其大規(guī)模應(yīng)用還不能達(dá)到要求，分析其中原因可能與未進(jìn)行超速離心濃縮病毒顆粒獲得較高的病毒滴度以及未進(jìn)行G418篩選等有關(guān)系。但G418篩選過程操作費(fèi)時(shí)，工藝復(fù)雜，篩選過程中損失大量的T淋巴細(xì)胞是其缺陷，而加大病毒用量提高m.o.i.比率和重

22、復(fù)感染的方法可以提高基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，但勢必需要更多的病毒產(chǎn)出。有報(bào)道應(yīng)用流動感染的方法可以提高病毒感染效率達(dá)90%7，操作簡單、省時(shí)、病毒用量少、不需重復(fù)感染，對此我們將在以后的工作中作進(jìn)一步的嘗試。    【參考文獻(xiàn)】 1Lundstrom K. Gene therapy applications of viral vectors. Technol Cancer Res Treat, 2004; 3: 467-4772Kafri T, van?Praag H, Gage FH, et al. Lentiviral vectors: regulated gene express