微生物的計數(shù)與活性污泥中生物相的觀察

1、微生物的計數(shù)與活性污泥中生物相的觀察一、實驗原理利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是一種常用的微生物計方法。此 法的優(yōu)點是直觀、快速。此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總 菌計數(shù)法。由于計數(shù)室的容積是一定的（0.1mm3）,當(dāng)含有細菌的溶液滴在 槽里時，通過水的表面張力擴散到計數(shù)室里，細菌也被分散到不同的格里， 通過計算不同的格里的細菌數(shù)， 最后就可以計算出， 溶液里所含的細菌數(shù)量?；钚晕勰嘀械纳锵啾容^好照樣，以細菌和原生動物為主，還有真菌、 后生動物等。在正常的成熟污泥中，細菌大多集中于菌膠團絮絨體中，游離 細菌較少，此時，污泥絮絨體可具有一定狀、 稠密、擴光率強、 沉強性能好。

2、原生動物常作為污水凈化指標；當(dāng)固著型纖毛蟲占優(yōu)勢時，一般認為污水處 理池運轉(zhuǎn)失常；當(dāng)后生動物輪蟲等大量出現(xiàn)時，意味著污泥極度衰老。所以 可以通過觀察原生動物，來評價活性污泥的狀況，而且原生動物也較微生物 要大，容易觀察。二、實驗器材活性污泥樣品、菌種：濃縮酵母菌液儀器：顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片三、實驗步驟1. 檢查與清洗血球計數(shù)板：在正式計數(shù)之前，如果沾有雜質(zhì)或菌體要用 95% 乙醇輕輕擦洗計數(shù)板的計數(shù)室，然后蒸餾水徹底清洗血球計數(shù)板，放在 顯微鏡下觀察，調(diào)整好顯微鏡找到計數(shù)板刻度，檢查有沒有損壞。2. 加樣：先將蓋玻片放在計數(shù)室上，用吸管滴一滴已稀釋好的菌液于蓋玻 片邊緣即是旁邊的板槽里，

3、讓菌液自行滲入，多余的菌液用濾紙吸去； 稍等片刻，待酵母細胞全部沉降到計數(shù)室底部，再進行計數(shù)。3. 計數(shù)：先在低倍鏡下找到計數(shù)板的大格位置，然后將其移到視野中間， 然后轉(zhuǎn)到高倍鏡，適當(dāng)調(diào)節(jié)光亮度，不能太亮，也不能太暗，然后將計 數(shù)室要計數(shù)的格子移到視野中進行計數(shù)?？梢韵扔檬謾C拍下，在手機里 進行點數(shù)，另一個人就可以繼續(xù)移動計數(shù)板到另一計數(shù)區(qū)域，這樣就可以更快、更輕松地完成計數(shù)。4. 計數(shù)：本實驗用的是25*16 型的計數(shù)板，所以應(yīng)該要選擇左上，右上， 左下，右下，中間五個中格計數(shù)，如果有菌體落在雙線上時，只計算一邊，對應(yīng)的另一邊不算，對每個樣品重復(fù)計數(shù)3次，取其平均值，按下列公式計算每毫升菌液

4、中所含酵母菌的細胞數(shù)。80小格內(nèi)酵母菌細胞數(shù)酵母菌的細胞數(shù) 二80小格內(nèi)酵母菌細胞數(shù) 40010000 稀釋倍數(shù)805. 活性污泥的觀察：將載玻片與蓋玻片清洗干凈，然后擦干。直接用吸管 吸取少量的活性污泥，滴一滴到載玻片中央，然后輕輕將蓋玻片蓋下， 削除氣泡，多余的水用紙吸干，要盡量將污泥散開，形成薄薄的一層， 這樣才有利用觀察。轉(zhuǎn)到40倍的物鏡，調(diào)整好亮度后即可以觀察。四、實驗結(jié)果酵母菌細胞數(shù)的測定計算次數(shù)各大格中細胞數(shù)大格中細胞總數(shù)稀釋倍數(shù)總細困數(shù)（個 /mL）左上右上左下右下中間第一次2934302628147201.47X108第二次2837302529146201.46X108第三次

5、3036282730149201.49X108平均值2936292629149201.49X108線蟲輪蟲紅頭飄體蟲水雄蟲鐘蟲聚縮蟲獨縮蟲斜管蟲變形蟲累枝蟲五、思考題1. 說明用血球計數(shù)板計數(shù)的誤差主要來自哪些方面？應(yīng)如何盡量減少誤差,力求準確?誤差主要來自于:原溶液誤差：稀釋倍數(shù)：稀釋的大致范圍是每個中格中的細菌數(shù) 1050個是比較理想的情況！如果太多，細菌可能會重疊，相互之間有影響；濃度太低，則 容易受到其他因素的干擾。儀器誤差：計數(shù)板是否清潔干燥，計數(shù)板、蓋玻片、微量吸管及刻度吸管的 規(guī)格應(yīng)符合要求或經(jīng)過校正，計數(shù)法最后的計數(shù)都是按照原定的板數(shù)據(jù)， 再加上 菌數(shù)來計算的，如果儀器本身出現(xiàn)

6、問題而不準確會造成很大的誤差。操作誤差：在滴溶液時操作不規(guī)范，溶液量滴得過多或過少都會對滲透的菌 數(shù)造成影響的，個人經(jīng)驗所得滴兩滴是最適合的， 如果滴一滴則溶液太少了，連 槽都還沒填滿，不容易擴散到計數(shù)室里。一定不能多加，否則計數(shù)室內(nèi)溶液量肯 定會超過計數(shù)所限制的0.1mm,每個小格里都有可能出現(xiàn)上下層的細菌數(shù)， 若出 現(xiàn)部分細菌看不清，無論怎么調(diào)都總有一部分細菌看清，則證明所加的量已經(jīng)超 標了，出現(xiàn)了分層，此時應(yīng)該清洗計數(shù)板，重新加液。2. 試述血球計數(shù)板的計數(shù)原理。 為什么用兩種不同規(guī)格的計數(shù)板計數(shù)同一樣 品，結(jié)果是一樣的？ 血球計數(shù)板是一種專門用于計算較大單細胞微生物的一種儀器， 由一塊

7、比普 通載玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四條下凹的槽， 構(gòu)成三個平臺。 中間的平 臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半， 每半邊上面刻有一個方格網(wǎng)。 方格網(wǎng)上 刻有 9 個大方格， 其中只有中間的一個大方格為計數(shù)室。 這一大方格的長和寬各 為1mm深度為0.1mm其容積為O.lmn3。在血球計數(shù)板上，一個大格分 400個 小格，每小格面積是 1/400 mm2。16X 25型：大方格內(nèi)分為16中格，每一中格又分為25小格； 25X16型：大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造， 它們都有一個共同的特點， 即每一大方格都 是由 16X 25=25X 16=400

8、個小方格組成。所以每個小格的面積都是 1/400 mm216X25 型的計數(shù)板 ：取四角： 1、4、13、16 四個中方格（ 100個小方格） 計數(shù)，依下列公式計算：酵母細胞個數(shù)/ 1mL=100個小方格細胞總數(shù)/100 X 400X 10000X稀釋倍數(shù) 25X 16型的計數(shù)板：計數(shù)四個角和中央的五個中方格（80個小方格）的細 胞數(shù)，依下列公式計算：酵母細胞個數(shù)/ 1mL= 80個小方格細胞總數(shù)/80 X 400X 10000X稀釋倍數(shù) 由公式可以知， 實質(zhì)計的是平均到每個小格的細菌數(shù)， 而兩種型號的小格面 積都是一樣的，所以計算出來的結(jié)果，排除掉誤差因素，理念 上應(yīng)該是一樣的3. 根據(jù)實驗

9、觀察結(jié)果，試對活性污泥的質(zhì)量及運行情況作初步評介。 實驗觀察到，活性污泥中出現(xiàn)了大量的飄體蟲，中量的輪蟲、累枝蟲、獨縮 蟲和聚縮蟲，還有少量鐘蟲、雄蟲、線蟲、變形蟲和斜管蟲。出現(xiàn)輪蟲代表污泥處理效果好，但如果大量出現(xiàn)則表明污泥已經(jīng)極度衰老， 出現(xiàn)污泥鼓脹。大量的飄體蟲， 中量的輪蟲、獨縮蟲和聚縮蟲的出現(xiàn)都表明流動性污泥質(zhì)量 好，運行情況和出水效果好。4. 請說說平板菌落計數(shù)法和比濁法的實驗原理和實驗步驟平板計數(shù)法：將行測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，其中的微生物充分分散成單個細胞， 取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由每個單眼細胞生長繁殖而形成 肉眼可見的菌落，即一個菌落應(yīng)代表原樣品中的一個細胞。

10、（1）將樣品菌液稀釋一系列的濃度梯度（2）將每個濃度的菌液涂布到三個平板上，然后培養(yǎng)一定時間（3）根據(jù)公式cfu二M N 5計算每個平板的菌落數(shù)，然后算每組濃度 三個平板的cfu平均值。cfu 每毫升中菌落形成單位；M同一稀釋度3次重復(fù)的平均菌落數(shù)；N稀釋倍數(shù)。通過涂布的溶液難以完全分散成單個細胞， 有些菌落可能是來自1個以上的 細胞，而且無法沒到死細胞的數(shù)量，所以所測數(shù)值偏小，而且操作麻煩，耗時耗 材，但可以測到活細胞的數(shù)量；比濁法：細菌分布在溶液里，會對所照射的光進行吸收或反射、散射。所以 當(dāng)用分光去照射溶液時，所能透過的分光會因為菌液濃度的不同而不同，此時細菌懸液的濃度與光密度（0D值成

11、正比，當(dāng)與由已知菌落數(shù)的標準溶液所測的標 準曲線計算，就可以得出相應(yīng)的菌落數(shù)。（1） 根據(jù)已知菌液濃度的標準液稀釋成一系列濃度梯度的標準菌液，定容 到一定的體積；（2）將樣品菌液稀釋一定的濃度，定容一定的體積；（3）測標準菌液和樣品菌液的Abs,然后根據(jù)由標準菌液所得的標準曲線 算出樣品菌液的濃度。由于溶液里還有其物質(zhì)會對紫外光有作用，例如細胞的殘體、其他溶液物質(zhì)、 雜質(zhì)等等，所以所測數(shù)值會偏高，但方法簡單，易操作，每個樣品只要很短時間 就可以測出來?？偨Y(jié):微生物實驗的核心就如老師第一節(jié)課所說的： 消毒滅菌、無菌操作、 純種培 養(yǎng)。這三環(huán)是環(huán)環(huán)相扣的，貫穿整個微生物實驗。從第一個實驗： 培養(yǎng)基

12、的制備與空氣中微生物的檢測， 就要嚴格按照這三大 核心來進行實驗了， 而第二個實驗： 細菌的革蘭氏染色與顯微觀察， 雖然沒有以 上步驟，但那是因為這只是實驗中的一個環(huán)節(jié)被我們單獨出來了， 它所需要的菌 種也都是要經(jīng)過以上的步驟的， 最后一個實驗： 微生物的計數(shù)與活性污泥中生物 相的觀察， 也是如此，總之只要是微生物實驗就要涉及到微生物， 涉及到微生物 就必須要經(jīng)歷過三大步驟， 水中大腸菌群的檢測法和土壤中四類微生物的分離純 化，就要嚴格執(zhí)行這三個步驟了，因為其他微生物的污染要嚴重影響實驗結(jié)果， 甚至導(dǎo)致實驗失敗。對于準確性， 也嚴格測量所需要的試劑和樣品的， 微生物就沒有像監(jiān)測之類 的那么嚴格了， 除非是做定量的分析， 可能就要比較嚴格了。 或許這也是我喜歡 做微生物實驗之一微生物實驗到此就完滿結(jié)束了， 雖然所做的實驗并不是很多， 但也學(xué)到不少 東西，而且老師的教學(xué)方式也是第一次遇到，實驗并不是一點點按老師那樣做， 而是要看自己的預(yù)習(xí)還有能力去完成， 對比起來這樣才更像實驗， 而且教學(xué)效果 比起大一大二的那些所謂實驗要好很多，相比于工程班的效果也要好點。有次提前到實驗室看到工班的同學(xué)還在