第10章動(dòng)物染色體工程

1、第第1010章章 動(dòng)物染色體工程動(dòng)物染色體工程 染色體工程染色體工程(chromosome engineering)是按照人們的是按照人們的需要對(duì)生物的染色體進(jìn)行需要對(duì)生物的染色體進(jìn)行操作操作, 添加、削弱或替代染添加、削弱或替代染色體，從而達(dá)到定向育種色體，從而達(dá)到定向育種或創(chuàng)造人工新物種的目的?；騽?chuàng)造人工新物種的目的。Animal Chromosome Engineering 認(rèn)識(shí)染色體與染色體組認(rèn)識(shí)染色體與染色體組 什么是染色體工程什么是染色體工程 動(dòng)物染色體工程的主要內(nèi)容動(dòng)物染色體工程的主要內(nèi)容 染色體組工程染色體組工程 個(gè)別染色體工程個(gè)別染色體工程 人工染色體人工染色體一、認(rèn)識(shí)染色體

2、一、認(rèn)識(shí)染色體1. 染色體的組成染色體的組成與與DNA、基因之間的、基因之間的關(guān)系關(guān)系2. 染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)與分類(lèi)與分類(lèi)3. 染色體染色體DNA的的3種種功能元件功能元件4. 染色體組染色體組1、真核細(xì)胞染色體的組成、真核細(xì)胞染色體的組成組蛋白：組蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4；非組蛋白：非組蛋白：HMG、DNA結(jié)合結(jié)合蛋白蛋白DNA：不重復(fù)序列；中度重復(fù)不重復(fù)序列；中度重復(fù)序列；高度重復(fù)序列序列；高度重復(fù)序列少量的少量的RNA；2 2、染色體的主要結(jié)構(gòu)染色體的主要結(jié)構(gòu)著絲粒著絲粒(centromere) 主 縊 痕 主 縊 痕 ( P r i m a r y cons

3、triction) 次縊痕次縊痕(secondary constriction)動(dòng)粒動(dòng)粒(kinetochore)核仁組織區(qū)核仁組織區(qū)(nucleolar organizing region, NOR)隨體隨體(satellite)端粒端粒(telomere)根據(jù)著絲點(diǎn)的位置而定，可將中期染色體分為四種：中著絲粒染色根據(jù)著絲點(diǎn)的位置而定，可將中期染色體分為四種：中著絲粒染色體、亞中著絲粒染色體、端著絲粒染色體、近端著絲粒染色體。體、亞中著絲粒染色體、端著絲粒染色體、近端著絲粒染色體。 染色體的超微結(jié)構(gòu)染色體的超微結(jié)構(gòu)v核小體是染色體包核小體是染色體包裝的基本單位；裝的基本單位；v染色體包裝的螺

4、線染色體包裝的螺線管模型：管模型：核小體的結(jié)構(gòu)核小體的結(jié)構(gòu) 每一個(gè)核小體核每一個(gè)核小體核心包含有心包含有146bp DNA和和8個(gè)組蛋個(gè)組蛋白分子（白分子（2H2A，2H2B，2H3，2H4）；）；DNA在在每個(gè)組蛋白核心每個(gè)組蛋白核心外纏繞約外纏繞約2圈圈染色體的串珠狀形式與螺線管結(jié)構(gòu)染色體的串珠狀形式與螺線管結(jié)構(gòu) 146bpDNA的核的核小體核心由小體核心由54bp間隔間隔DNA連成一連成一條串珠狀結(jié)構(gòu)；條串珠狀結(jié)構(gòu)； 核小體螺旋形纏繞核小體螺旋形纏繞形成螺線管結(jié)構(gòu)，形成螺線管結(jié)構(gòu)，每一周螺旋含每一周螺旋含6個(gè)個(gè)核小體，因此，核小體，因此，DNA長(zhǎng)度縮短了長(zhǎng)度縮短了6倍。倍。從DNA到染色

5、體的包裝壓縮 DNA鏈鏈 核小體核小體 螺線管螺線管 染色單體染色單體 超螺旋超螺旋壓縮比例：壓縮比例：76405 = 8400（1：7）（1：6）（1：40）（1：5）DNA PackagingGene Expression3 3、染色體、染色體DNADNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定遺傳的功能序列結(jié)構(gòu)穩(wěn)定遺傳的功能序列ARS (autonomous replicating sequence)CEN (centromeric sequence) The centromere is a specialized region of the chromosome that plays a critical role

6、in ensuring the correct distribution of duplicated chromosomes to daughter cells during mitosis TEL (telomeric sequence) The sequences at the ends of eukaryotic chromosomes, called telomeres, play critical roles in chromosome replication and maintenance. DNADNA穩(wěn)定遺傳的三種功能位點(diǎn)穩(wěn)定遺傳的三種功能位點(diǎn)4、染色體組、染色體組 染色體組染

7、色體組 染色體組型染色體組型 染色體倍性染色體倍性體細(xì)胞中的一組非同源染色體，它們?cè)谛螒B(tài)和功能上各不相同，但體細(xì)胞中的一組非同源染色體，它們?cè)谛螒B(tài)和功能上各不相同，但是，攜帶著控制一種生物生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳和變異的全部信息，這樣是，攜帶著控制一種生物生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳和變異的全部信息，這樣的一組染色體，叫做一個(gè)的一組染色體，叫做一個(gè)染色體組染色體組。 染色體組型染色體組型是指一個(gè)體細(xì)胞中全部染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)特征。是指一個(gè)體細(xì)胞中全部染色體的數(shù)目、大小和形態(tài)特征。 染色體倍性染色體倍性是指細(xì)胞中包含的染色體組數(shù)或基數(shù)。是指細(xì)胞中包含的染色體組數(shù)或基數(shù)。 Human mitotic chromos

8、omes and karyotypeChromosome painting=multicolor FISH染色體組用符號(hào)染色體組用符號(hào)“X”表示表示 生物體的體細(xì)胞染色體數(shù)用生物體的體細(xì)胞染色體數(shù)用2n表示，無(wú)論是二倍體還是多表示，無(wú)論是二倍體還是多倍體，倍體，2n只表示體細(xì)胞的染色體數(shù)，并不表示其倍性如：只表示體細(xì)胞的染色體數(shù)，并不表示其倍性如：玉米體細(xì)胞染色體數(shù)玉米體細(xì)胞染色體數(shù)2n=20，普通小麥體細(xì)胞染色體數(shù)普通小麥體細(xì)胞染色體數(shù)2n=42，要正確表示倍性應(yīng)寫(xiě)成：要正確表示倍性應(yīng)寫(xiě)成：玉米玉米2n=2X=20，普通小麥普通小麥2n=6X=42。符號(hào)符號(hào)“n”和和“X”的區(qū)別與聯(lián)系的區(qū)別

9、與聯(lián)系單倍體與一倍體含義相同嗎？單倍體與一倍體含義相同嗎？Animal Chromosome Engineering 認(rèn)識(shí)染色體與染色體組認(rèn)識(shí)染色體與染色體組 什么是染色體工程什么是染色體工程 動(dòng)物染色體工程的主要內(nèi)容動(dòng)物染色體工程的主要內(nèi)容 染色體組工程染色體組工程 個(gè)別染色體工程個(gè)別染色體工程 人工染色體人工染色體騾騾 子子母馬和公驢的后代母馬和公驢的后代為什么騾子不能繁殖后代？為什么騾子不能繁殖后代？ 馬的染色體數(shù)是馬的染色體數(shù)是64條，驢的染色體數(shù)是條，驢的染色體數(shù)是62條，馬的卵子染色體數(shù)是條，馬的卵子染色體數(shù)是32條，驢的精子條，驢的精子染色體數(shù)是染色體數(shù)是31條，通過(guò)精卵結(jié)合發(fā)育

10、成的條，通過(guò)精卵結(jié)合發(fā)育成的新個(gè)體新個(gè)體騾子的染色體數(shù)是騾子的染色體數(shù)是63條。條。 騾子的染色體聯(lián)繪紊亂因此騾子的生殖細(xì)騾子的染色體聯(lián)繪紊亂因此騾子的生殖細(xì)胞不能分化發(fā)育成完整的個(gè)體。胞不能分化發(fā)育成完整的個(gè)體。 生育的概率極低生育的概率極低 騾子性成熟以后，再形成精子或卵子時(shí)，每條染色騾子性成熟以后，再形成精子或卵子時(shí)，每條染色體都沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的同源染色體進(jìn)行配對(duì)，這樣每一體都沒(méi)有相對(duì)應(yīng)的同源染色體進(jìn)行配對(duì)，這樣每一條染色體分到哪個(gè)配子里是隨機(jī)的，在這些配子中，條染色體分到哪個(gè)配子里是隨機(jī)的，在這些配子中，只有配子里的染色體完全來(lái)自于馬的，或來(lái)自于驢只有配子里的染色體完全來(lái)自于馬的，或來(lái)自于

11、驢的，這樣的配子才有生育能力。的，這樣的配子才有生育能力。 獅虎獸（獅虎獸（liger） 雄獅和雌虎交配產(chǎn)生的后代。雄獅和雌虎交配產(chǎn)生的后代。獅虎獸的體型比獅或虎都要獅虎獸的體型比獅或虎都要大，又同時(shí)具備兩者之間的大，又同時(shí)具備兩者之間的外貌特征；獅子與老虎相戀、外貌特征；獅子與老虎相戀、懷孕的概率極低，即使在人懷孕的概率極低，即使在人工飼養(yǎng)的環(huán)境下，虎、獅受工飼養(yǎng)的環(huán)境下，虎、獅受孕的機(jī)會(huì)也僅為孕的機(jī)會(huì)也僅為1至至2。幼獸由于先天不足等原因，幼獸由于先天不足等原因，成活率僅為五十萬(wàn)分之一左成活率僅為五十萬(wàn)分之一左右。據(jù)資料顯示，目前世界右。據(jù)資料顯示，目前世界上存活的獅虎獸只有上存活的獅虎獸

12、只有20只左只左右。右。 獅虎獸（獅虎獸（liger） 獅虎獸獅虎獸獅獅虎虎虎獅獸虎獅獸動(dòng)物染色體工程動(dòng)物染色體工程p染色體倍性改造染色體倍性改造p結(jié)構(gòu)改造結(jié)構(gòu)改造p人工染色體的利用人工染色體的利用10.1.1 動(dòng)物的多倍體育種動(dòng)物的多倍體育種多倍體（多倍體（polyploidy）:是指體細(xì)胞中含有三個(gè)是指體細(xì)胞中含有三個(gè)或三個(gè)以上染色體組的個(gè)體或三個(gè)以上染色體組的個(gè)體多倍體產(chǎn)生機(jī)制：多倍體產(chǎn)生機(jī)制：通過(guò)卵細(xì)胞第二極體的保通過(guò)卵細(xì)胞第二極體的保留或受精卵早期有絲分裂的抑制而實(shí)現(xiàn)留或受精卵早期有絲分裂的抑制而實(shí)現(xiàn)10.1 10.1 動(dòng)物染色體倍性改造動(dòng)物染色體倍性改造定義：染色體倍性改造工程是指

13、有目的、定義：染色體倍性改造工程是指有目的、有計(jì)劃地增加或減少一組或幾組同源或有計(jì)劃地增加或減少一組或幾組同源或異源染色體，以創(chuàng)造動(dòng)植物新品種的一異源染色體，以創(chuàng)造動(dòng)植物新品種的一項(xiàng)染色體工程技術(shù)。項(xiàng)染色體工程技術(shù)。主要包括多倍體育種和單倍體育種。主要包括多倍體育種和單倍體育種。整倍變化：整倍變化：多倍體：多倍體：細(xì)胞中含有三個(gè)或更多染色體組的個(gè)體單倍體：?jiǎn)伪扼w：細(xì)胞中含有正常體細(xì)胞的一半染色體數(shù)非整倍體變化：非整倍體變化：染色體減少：?jiǎn)误w染色體減少：?jiǎn)误w（減1條）、缺體缺體（減1對(duì)）染色體增加：三體染色體增加：三體（加1條）、四體四體（加1對(duì)）染色體代換：同種代換、異種代換染色體代換：同種代

14、換、異種代換n染色體數(shù)變異染色體數(shù)變異 一是體細(xì)胞內(nèi)以染色體組為基數(shù)進(jìn)行的整倍性變一是體細(xì)胞內(nèi)以染色體組為基數(shù)進(jìn)行的整倍性變化，以整倍體染色體數(shù)目變化產(chǎn)生的變異會(huì)產(chǎn)生化，以整倍體染色體數(shù)目變化產(chǎn)生的變異會(huì)產(chǎn)生多倍體和單倍體；多倍體和單倍體； 另一種是染色體組內(nèi)的個(gè)別染色體數(shù)目有所增減，另一種是染色體組內(nèi)的個(gè)別染色體數(shù)目有所增減，使細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)目不是基數(shù)的的完整倍數(shù)，使細(xì)胞內(nèi)的染色體數(shù)目不是基數(shù)的的完整倍數(shù)，因此被稱(chēng)為非整倍體。因此被稱(chēng)為非整倍體。染色體結(jié)構(gòu)變異染色體結(jié)構(gòu)變異易位：一個(gè)染色體上某一區(qū)段跟另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換缺失：染色體的某一區(qū)段及帶有的基因一起丟失倒位：染色體上某

15、一區(qū)段連同它帶有的基因順序發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)重復(fù)：一個(gè)染色體上增加了相同的某個(gè)區(qū)段。n染色體結(jié)構(gòu)變異 染色體易位染色體易位：一個(gè)染色體上某一區(qū)段與另一非同源染色體上的區(qū)段發(fā)生互換。 染色體缺失染色體缺失：染色體的某一區(qū)段及其帶有的基因一起丟失 染色體倒位染色體倒位：染色體上某一區(qū)段連同它帶有的基因順序發(fā)生180度倒轉(zhuǎn)。 染色體重復(fù)染色體重復(fù)：一個(gè)染色體上增加了相同的某個(gè)區(qū)段。缺失缺失：缺失一個(gè)片段。 重復(fù)重復(fù)：某一片斷重復(fù)出現(xiàn)。倒位：片段斷裂，倒轉(zhuǎn)倒位：片段斷裂，倒轉(zhuǎn)180180度，重新連接。度，重新連接。易位：片段斷裂，移到易位：片段斷裂，移到另一條染色體臂上。另一條染色體臂上。10.1.1

16、動(dòng)物的多倍體育種動(dòng)物的多倍體育種 1染色體加倍技術(shù)染色體加倍技術(shù)(人工誘導(dǎo)人工誘導(dǎo)) 1).化學(xué)誘導(dǎo)法化學(xué)誘導(dǎo)法 有些化學(xué)物質(zhì)也可以用來(lái)阻止第二極體的排出或受精卵的有絲分裂而產(chǎn)生三倍體或四倍體。 a.細(xì)胞松馳素B：能抑制肌動(dòng)蛋白聚合成微絲，從而抑制細(xì)胞質(zhì)分裂。 b.秋水仙堿：可以抑制細(xì)胞分裂中紡綞絲的形成，因而抑制有絲分裂。其它藥物：N2O 、CHCIF2和聚乙二醇等。缺點(diǎn)：化學(xué)藥品一般比較昂貴、且具有毒性，影響處理后的胚胎發(fā)育，同時(shí)加上化學(xué)藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的多倍體往往是在育種上沒(méi)有價(jià)值的鑲嵌體，所以化學(xué)方法在實(shí)際中的應(yīng)用不及物理方法。2) 生物學(xué)方法 生物學(xué)上主要通過(guò)雜交尤其是種間雜交獲得異源多

17、倍體。 Rasch等（1965）年首次證明了三倍體脊椎動(dòng)物可以通過(guò)雜交產(chǎn)生，他們將雌核發(fā)育的二倍體帆鱂（Poecilia formosa）與P.Vittate雜交，得到三倍體后裔。 例如用雌性草魚(yú)（2n48）與雄性三角魴（2n48）雜交可以獲得子一代染色體數(shù)目為72的草魴雜種三倍體。 異育銀鯽與興國(guó)紅鯉雜交獲得的復(fù)合四倍體，通過(guò)細(xì)胞方法證明其產(chǎn)生的原因是受精卵發(fā)生了兩性融合。 這種不同科、屬、種之間的遠(yuǎn)源雜交，會(huì)導(dǎo)致第二極體不排出，而產(chǎn)生多倍體。動(dòng)物通過(guò)雜交方法動(dòng)物通過(guò)雜交方法尤其是種間雜交獲尤其是種間雜交獲得異源多倍體。種得異源多倍體。種間雜交導(dǎo)致第二極間雜交導(dǎo)致第二極體不排出。體不排出。草

18、魚(yú)草魚(yú) 三角魴三角魴 (2n=48) ( 2n =48)(2n=48) ( 2n =48) 草魴雜種草魴雜種(3n=72)(3n=72) 包括溫度激變（溫度休克法）、機(jī)械創(chuàng)傷、電離輻射、離心、水靜壓法和高鹽高堿法等。 溫度休克法：冷休克法（05）和熱休克法（30）。 定義：用略高于或略低于致死溫度的冷或熱休克來(lái)誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。 關(guān)鍵：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二極體的排出。要達(dá)到這一點(diǎn)，必須考慮溫度處理的開(kāi)始時(shí)間（TA）、處理持續(xù)時(shí)間（D）和處理溫度（T）這三個(gè)因素。 3). 物理學(xué)方法 目前對(duì)魚(yú)類(lèi)使用溫度休克法誘導(dǎo)三倍體的工作報(bào)道較多。一般來(lái)說(shuō)，冷水性魚(yú)類(lèi)如鮭科種類(lèi)應(yīng)用熱休克

19、法好，而溫水性魚(yú)類(lèi)用冷休克效果較好。 優(yōu)點(diǎn)：廉價(jià)、易操作，是誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞多倍體化的常用手段，也有利于大規(guī)模生產(chǎn)使用。 水靜壓法：采用較高的水靜壓（65kg/cm2）抑制第二極體的放出或第一次卵裂來(lái)產(chǎn)生多倍體。 優(yōu)點(diǎn)：誘導(dǎo)率高（一般在90100）、處理時(shí)間短（35min），對(duì)受精卵損傷小、成活率高。 缺點(diǎn)：需要專(zhuān)門(mén)的設(shè)備水壓機(jī)，成本較高，其樣品室容量有限，處理卵的量有限，所以不適于大規(guī)模生產(chǎn)的。 Assembly of microtubules Assembly in vitro影響微管穩(wěn)定的因素影響微管穩(wěn)定的因素2多倍體的倍性鑒定多倍體的倍性鑒定（1）直接法）直接法 1）染色體計(jì)數(shù)：）染色體計(jì)

20、數(shù)：是鑒定多倍體的一個(gè)準(zhǔn)確的直接方法，是鑒定多倍體的一個(gè)準(zhǔn)確的直接方法，但比較費(fèi)時(shí)。但比較費(fèi)時(shí)。 2）DNA含量測(cè)定含量測(cè)定：細(xì)胞：細(xì)胞DNA含量測(cè)定是倍性鑒定的另含量測(cè)定是倍性鑒定的另一個(gè)有效的直接方法。一個(gè)有效的直接方法。（2）間接法）間接法 1）體積測(cè)量）體積測(cè)量 2）蛋白質(zhì)電泳）蛋白質(zhì)電泳 3）生化分析）生化分析I 核體積測(cè)量：核體積測(cè)量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與四倍體的核體積之比為1:1.74。核體積測(cè)量法省時(shí)、簡(jiǎn)單，在生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)就能進(jìn)行而廣為人們采用，但缺乏準(zhǔn)確性，亦測(cè)不出嵌合體，往往需要校正；I生化分析：生化分析：如在關(guān)東系銀鯽中，三倍體紅血球的丙酮酸激酶的含

21、量含著高于二倍體。I 染色體計(jì)數(shù)：染色體計(jì)數(shù)：是鑒定多倍性倍性的一種最為準(zhǔn)確、直接方法，但缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)；I DNA含量測(cè)定：含量測(cè)定：流式細(xì)胞儀。是較為先進(jìn)常用的方法，其測(cè)定快速準(zhǔn)確，并能測(cè)出嵌合體，但需要特殊的儀器設(shè)備。I 采用何種方法均有利有弊有利有弊，進(jìn)行鑒定主要依賴(lài)于所測(cè)樣本的發(fā)育時(shí)期、實(shí)驗(yàn)要求和所具備的儀器設(shè)備條件。流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 Flow CytometryFlow cytometry uses an electronic instrument that passes particles or cells one by one through a laser and past

22、sensors that measure physical and chemical characteristics of those particles or cells.3、優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)a.優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 多倍體育種技術(shù)方法簡(jiǎn)單、見(jiàn)效快，有潛在的理論和應(yīng)用價(jià)值。 許多誘導(dǎo)的多倍體動(dòng)物如兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)等都具有良好的生存力和生長(zhǎng)率。 種間雜種生長(zhǎng)快，可以同時(shí)具有兩個(gè)不同的種的優(yōu)良特性。 利用三倍體不育的特性，將生殖腺發(fā)育消耗的能量用于動(dòng)物生長(zhǎng)，可以避免因繁殖季節(jié)及肉質(zhì)下降而延誤上市時(shí)間或影響商品價(jià)值，縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本，這在鮑魚(yú)、昆蟲(chóng)等方面已有應(yīng)用。 某些多倍體動(dòng)物肉質(zhì)量、

23、含氧量、抗病性等經(jīng)濟(jì)性狀較二倍體好。 準(zhǔn)確的處理時(shí)間；誘導(dǎo)率、成活率及孵化率的提高；準(zhǔn)確可靠的倍性鑒定方法的確定。b b. . 缺點(diǎn)缺點(diǎn)3.3.人工誘導(dǎo)多倍體的意義人工誘導(dǎo)多倍體的意義多倍體多倍體(polyploidy): 多倍體動(dòng)物如兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)都具有多倍體動(dòng)物如兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)都具有良好的生存力和生長(zhǎng)率良好的生存力和生長(zhǎng)率水產(chǎn)養(yǎng)殖水產(chǎn)養(yǎng)殖增強(qiáng)抗病能力、提高生長(zhǎng)速度增強(qiáng)抗病能力、提高生長(zhǎng)速度n特點(diǎn)n多倍體與二倍體相比，最顯著的特點(diǎn)是形態(tài)上的巨大性。n糖類(lèi)、蛋白質(zhì)及其它產(chǎn)物的含量也有所提高。n由于多倍體動(dòng)物具有生長(zhǎng)速度快、成活率高及抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，所以可通過(guò)人工誘導(dǎo)多倍體來(lái)改善生物的

24、經(jīng)濟(jì)性狀。三倍體三倍體 triploid人工誘導(dǎo)三倍體的方法人工誘導(dǎo)三倍體的方法p直接途徑，直接途徑，即用物理或化學(xué)的方法對(duì)受精卵即用物理或化學(xué)的方法對(duì)受精卵進(jìn)行處理，阻礙第二極體外排。進(jìn)行處理，阻礙第二極體外排。p間接途徑，間接途徑，即首先誘導(dǎo)獲得四倍體，待四倍即首先誘導(dǎo)獲得四倍體，待四倍體個(gè)體性成熟后再與二倍體個(gè)體自然交配，體個(gè)體性成熟后再與二倍體個(gè)體自然交配，獲得三倍體。獲得三倍體。魚(yú)類(lèi)三倍體育種的意義魚(yú)類(lèi)三倍體育種的意義 p三倍體是非偶數(shù)染色體組，故阻礙了生殖細(xì)胞三倍體是非偶數(shù)染色體組，故阻礙了生殖細(xì)胞正常的減數(shù)分裂，結(jié)果導(dǎo)致性腺不能發(fā)育。不正常的減數(shù)分裂，結(jié)果導(dǎo)致性腺不能發(fā)育。不育的

25、三倍體經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)因?yàn)闆](méi)有性成熟階段性腺育的三倍體經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)因?yàn)闆](méi)有性成熟階段性腺發(fā)育的能量損耗，所以有以下優(yōu)點(diǎn)：發(fā)育的能量損耗，所以有以下優(yōu)點(diǎn)：避免了性腺發(fā)育階段和產(chǎn)卵季節(jié)魚(yú)肉質(zhì)量下降避免了性腺發(fā)育階段和產(chǎn)卵季節(jié)魚(yú)肉質(zhì)量下降并延長(zhǎng)了上市時(shí)間并延長(zhǎng)了上市時(shí)間避免了性腺發(fā)育階段的生長(zhǎng)停滯和死亡率增加避免了性腺發(fā)育階段的生長(zhǎng)停滯和死亡率增加縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本并可養(yǎng)成大縮短了養(yǎng)殖周期，減少了養(yǎng)殖成本并可養(yǎng)成大型個(gè)體型個(gè)體利用三倍體魚(yú)類(lèi)不育性的優(yōu)點(diǎn)，利用三倍體魚(yú)類(lèi)不育性的優(yōu)點(diǎn)，人們可以達(dá)到這樣的目的：人們可以達(dá)到這樣的目的： 獲得生長(zhǎng)速度較快的三倍體品種，提高魚(yú)獲得生長(zhǎng)速度較快的三倍體品種，提高

26、魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益類(lèi)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益 控制養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的過(guò)度繁殖和防止對(duì)天然資控制養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的過(guò)度繁殖和防止對(duì)天然資源的干擾源的干擾湘云鯽湘云鯽由湖南師由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉筠院士培育院劉筠院士培育 Triploid Grass Carp三倍體草魚(yú)三倍體草魚(yú)3動(dòng)物多倍體育種的意義動(dòng)物多倍體育種的意義1 1）多數(shù)具有良好的生長(zhǎng)率）多數(shù)具有良好的生長(zhǎng)率2 2）低等動(dòng)物的種間雜交優(yōu)勢(shì)非常明顯）低等動(dòng)物的種間雜交優(yōu)勢(shì)非常明顯3 3）巨大性）巨大性4 4）育性低）育性低( (四倍體可育四倍體可育) )10.1.2 動(dòng)物的單倍體育種動(dòng)物的單倍體育種n（一）、（一）、人工人工單性生殖單性生殖n

27、（二）、（二）、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法n（三）、（三）、雌核發(fā)育的雌核發(fā)育的鑒定鑒定（一）、（一）、人工人工單性生殖單性生殖 1.雌核發(fā)育雌核發(fā)育：（gynogenesis）是單性生殖的一種，指卵子依靠自己的細(xì)胞核發(fā)育成個(gè)體的生殖行為。 同種或異種精子進(jìn)入卵內(nèi)只起刺激卵子發(fā)育的作用，不形成雄性原核和提供遺傳物質(zhì)，其子代的遺傳物質(zhì)完全來(lái)自雌核，只具有母本的性狀。自然界中自然界中一些無(wú)脊椎動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)等存在。 人工誘導(dǎo)人工誘導(dǎo)：雌核發(fā)育是指用經(jīng)過(guò)紫外線、X射線或射線等處理后的失活精子來(lái)“受精”，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱、高壓等物理處理，以抑制第二極體的排出，使卵子發(fā)育為正常的二倍

28、體動(dòng)物。 凡雌核發(fā)育雌核發(fā)育的個(gè)體，都具有純母系的單倍體染色體組，依賴(lài)于卵子染色體組的二倍體化。 1911年，赫特威氏赫特威氏就第一個(gè)成功地人工消除了精子染色體活性，并發(fā)現(xiàn)了“赫特威氏效應(yīng)”。 赫特威氏效應(yīng)赫特威氏效應(yīng)指只有在適當(dāng)?shù)母咻椛鋭┝肯?，才能?dǎo)致精子染色體完全失活，屆時(shí)精子雖能穿入卵內(nèi)，卻只能起到激活卵球啟動(dòng)發(fā)育的作用。抑制第二極體外排抑制第二極體外排抑制第一次卵裂抑制第一次卵裂精子遺傳物質(zhì)失活精子遺傳物質(zhì)失活 Haploid embryos are generated by mock-fertilizing eggs with UV-irradiated sperm (which c

29、annot contribute genetically), and can survive a few days. Haploids can be rescued by suppressing formation of the polar body with pressure treatment shortly after fertilization. 抑制第二抑制第二極體外排極體外排朱朱 洗洗 細(xì)胞學(xué)家。浙江臨海人。細(xì)胞學(xué)家。浙江臨海人。19311931年獲法國(guó)國(guó)家博士學(xué)年獲法國(guó)國(guó)家博士學(xué)位。中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)生物研究所研究員、所長(zhǎng)。長(zhǎng)位。中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)生物研究所研究員、所長(zhǎng)。長(zhǎng)期從事兩棲類(lèi)、

30、魚(yú)類(lèi)、家蠶等動(dòng)物卵子成熟、受精期從事兩棲類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、家蠶等動(dòng)物卵子成熟、受精等研究等研究 。19611961年使人工雌核發(fā)育的雌蟾蜍與雄蟾蜍交配，繁年使人工雌核發(fā)育的雌蟾蜍與雄蟾蜍交配，繁殖出殖出沒(méi)有外祖父的蟾蜍沒(méi)有外祖父的蟾蜍，證明了單性生殖的高等動(dòng)，證明了單性生殖的高等動(dòng)物仍保有傳代的能力。物仍保有傳代的能力。2.2.雄核發(fā)育：雄核發(fā)育：用經(jīng)過(guò)紫外線、用經(jīng)過(guò)紫外線、X X線或線處理的線或線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間施以卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育成完全為父本性狀精子染色體

31、加倍，而發(fā)育成完全為父本性狀的二倍體。的二倍體。定義：定義：遺傳失活的卵子與精子結(jié)合，發(fā)育成遺傳失活的卵子與精子結(jié)合，發(fā)育成只有父本染色體個(gè)體的一種特殊生殖方式。只有父本染色體個(gè)體的一種特殊生殖方式。 一、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法一、人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法F物理方法：物理方法：采用射線包括射線、X射線（效果較好）和紫外線（效果較差）等處理精子使精子的遺傳物質(zhì)失活。 F 化學(xué)方法：化學(xué)方法：采用化學(xué)物質(zhì)如甲苯胺藍(lán)、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色體遺傳活性的方法。F 顯微手術(shù)法：顯微手術(shù)法：采用顯微操作的方法直接去除受精卵中雄性原核的方法。1.1.精子遺傳物質(zhì)的失活精子遺傳物質(zhì)的失活F阻止第一次

32、有絲分裂或第二極體的外排；F利用溫度、壓力或化學(xué)方法，如冷休克、熱休克、流體靜水壓、細(xì)胞松馳素B、聚乙二醇處理等。2. 2. 雌核染色體數(shù)目減少的阻止雌核染色體數(shù)目減少的阻止u首先將兩個(gè)不同品系的近交系進(jìn)行雜交。u交配后，在精核與卵核尚未融合之前，從母鼠子宮內(nèi)沖取受精卵，并用極細(xì)的吸管將精核去掉。u在細(xì)胞松馳素B的處理下使雌核加倍，形成二倍體細(xì)胞。u二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)到囊胚期后，移植到養(yǎng)母的子宮內(nèi)，使胚胎繼續(xù)發(fā)育，直至出生。二、雌核發(fā)育的鑒別二、雌核發(fā)育的鑒別n 鑒別雌核發(fā)育的個(gè)體，通常以顏色顏色、形態(tài)形態(tài)以及生化生化等方面的指標(biāo)為依據(jù)。也可以通過(guò)細(xì)胞學(xué)的研究細(xì)胞學(xué)的研究，如若是雌核發(fā)育，其

33、囊胚細(xì)胞中只出現(xiàn)一套來(lái)自雌核的染色體，否則雌核和雄核染色體各占一半，得到的是雜交種。 n 用遺傳標(biāo)志遺傳標(biāo)志的方法來(lái)鑒別雄核發(fā)育的二倍體化，即由第一次有絲分裂的阻礙，還是由保留極體而來(lái)。假如二倍體源自第一次有絲分裂的抑制，雜合雌性個(gè)體的子代應(yīng)該都是純合型；而如果是通過(guò)阻止第二極體的外排產(chǎn)生的雌核發(fā)育個(gè)體，則子代的情況取決于著絲點(diǎn)與基因間的距離。在著絲點(diǎn)與基因距離遠(yuǎn)離時(shí)，將明顯增加雜合型子代的比例。三、雌核發(fā)育的意義三、雌核發(fā)育的意義n 為生產(chǎn)單性種群生產(chǎn)單性種群提供了可能。n 能迅速地產(chǎn)生同源型二倍體同源型二倍體。n 提供某些致死突變致死突變種的生物品質(zhì)。n 在農(nóng)牧漁業(yè)生產(chǎn)中，可人工控制性別繁

34、殖人工控制性別繁殖。n 廣泛地用于進(jìn)行基因基因-著絲點(diǎn)的定位研究著絲點(diǎn)的定位研究。n 可利用產(chǎn)生新的純系來(lái)篩選除去有害的等位基因篩選除去有害的等位基因。四、人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育四、人工誘導(dǎo)雄核發(fā)育n 雄核發(fā)育雄核發(fā)育（androgenesis）是指因經(jīng)過(guò)紫外線、X射線或射線處理的卵子與正常的精子受精，再在適當(dāng)時(shí)間施以冷、熱或高壓等物理處理，使進(jìn)入卵子內(nèi)的精子染色體加倍，而發(fā)育為完全為父本性狀的二倍體。n 雄核發(fā)育的個(gè)體的生存率非常低生存率非常低，這是由于精子基因型的純合性、卵子由于照射的損傷和阻止第一次卵裂處理的損傷等原因造成的。 n 但是仍舊在遺傳學(xué)基礎(chǔ)理論和育種中都有一定的價(jià)值有一定的價(jià)值，利

35、用雄核生殖的精子可用于冷凍基因庫(kù)，保存種質(zhì)資源，對(duì)基因世代克隆系的建立，不同種間核質(zhì)的雜種的產(chǎn)生和YY雄性引起的性別控制等也有特殊的意義。第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)第三節(jié)染色體顯微操作技術(shù)n染色體分離染色體分離一一染色體微切割染色體微切割1.1.原理：原理：由于熒光染料Hoechst 只對(duì)A-T特異性染色，而染料Chromomycin只對(duì)G-C特異性染色。染色體上DNA的堿基序列是不同的，因此這些特異性染料和不同染色體上DNA結(jié)合的量和比例是不同的。結(jié)合這些染料后，再經(jīng)激光照射，染色體就會(huì)呈現(xiàn)不同的熒光帶。將特定染色體發(fā)出的熒光波長(zhǎng)輸入計(jì)算機(jī)，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制就可將發(fā)出同一波長(zhǎng)的染色體收集在一起，

36、從而實(shí)現(xiàn)染色體的分離。一、一、 染色體分離染色體分離細(xì)胞分裂同步處理染色體的熒光色素染色染色體分離2.2.染色體分離的染色體分離的具體步驟具體步驟 微細(xì)玻璃針切割法：微細(xì)玻璃針切割法：采用特細(xì)的玻璃針（尖端直徑約為0.17m）在倒置顯微鏡下對(duì)目的基因所在染色體區(qū)段進(jìn)行切割與分離。 顯微激光切割法：顯微激光切割法：將染色體標(biāo)本在底部貼有特殊薄膜的培養(yǎng)皿上制作，利用激光共聚焦掃描顯微系統(tǒng)，依靠高能量激光照射非選擇細(xì)胞或染色體，使其受熱蒸發(fā)，最后只留下目的染色體。二、二、 染色體微切割染色體微切割第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)第四節(jié)染色體轉(zhuǎn)移技術(shù)n微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法一一染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移

37、法染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法n將同特定基因表達(dá)有關(guān)的染色體或染色體片段轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，使該基因得以表達(dá)，并能在細(xì)胞分裂中一代又一代地傳遞下去。該技術(shù)稱(chēng)為染色體轉(zhuǎn)移（或染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)）。微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Microcell mediated gene transfer，MMGT）染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法（Chromosome mediated gene transfer，CMGT）一、微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移法n 微細(xì)胞微細(xì)胞（或（或微核體微核體）：）：是指含有一條或幾條染色體，外有一薄層細(xì)胞質(zhì)和一個(gè)完整質(zhì)膜的核質(zhì)體。n 供體：供體：微細(xì)胞n 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)化供體基因的表達(dá)、對(duì)受體細(xì)胞影響小、微核染色體穩(wěn)定 微

38、細(xì)胞制備 微細(xì)胞融合1. 微細(xì)胞的制備用化學(xué)藥劑和（如秋水仙素秋水仙素）阻斷供體細(xì)胞的有絲分裂，使染色體停滯在有絲分裂中期，從而在染色體周?chē)饾u形成核膜而成為眾多的微核。然后在細(xì)胞細(xì)胞松弛素松弛素B的作用下使微核逐漸突出細(xì)胞膜外。最后經(jīng)過(guò)離心離心獲得含有一個(gè)微核、四周有一薄層細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜界限的微細(xì)胞。2. 微細(xì)胞的融合q制備的微細(xì)胞只能存活幾個(gè)小時(shí)，但經(jīng)融合可使其成為能夠存活的整體細(xì)胞。q常采用PEG作為細(xì)胞融合劑。q最好選用帶有營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)志營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)志的受體細(xì)胞。q由于微細(xì)胞的染色體含有互補(bǔ)的原養(yǎng)型基因，微細(xì)胞與受體細(xì)胞形成的雜合細(xì)胞即可在特定的選擇性選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)基中生長(zhǎng)而被篩選出來(lái)。n

39、染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法：染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法：是指分離得到相應(yīng)的染色體后轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的一種技術(shù)。n 基本步驟：基本步驟：誘發(fā)細(xì)胞同步分裂；阻斷細(xì)胞分裂于中期；破碎細(xì)胞；離心收集中期染色體；通過(guò)適當(dāng)?shù)姆诸?lèi)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。二、染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移法 細(xì)胞同步化與染色體的分離 染色體的轉(zhuǎn)移 受體細(xì)胞的分離與鑒定染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的過(guò)程染色體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的過(guò)程1. 1. 細(xì)胞同步化與染色體的分離細(xì)胞同步化與染色體的分離q用秋水仙素及合適的酶處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞q離心收集中期相細(xì)胞沉淀q洗滌數(shù)次q在中性緩沖液中培育q用注射針噴射細(xì)胞，使染色體釋放q離心收集染色體沉淀q蔗糖梯度離心或用流式細(xì)胞測(cè)量?jī)x分離單條染色體2. 2.

40、染色體的轉(zhuǎn)移染色體的轉(zhuǎn)移染色體可以通過(guò)細(xì)胞的吞噬作用細(xì)胞的吞噬作用而進(jìn)入受體細(xì)胞。一般先采用磷酸鈣和染色體一起沉淀，再用二甲基亞砜處理受體細(xì)胞，或采用卵磷脂與膽固醇制成的脂質(zhì)體將染色體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。n分離：利用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選n鑒定：染色體組型分析同工酶分析其他方法3. 3. 導(dǎo)入基因的受體細(xì)胞的分離與鑒定導(dǎo)入基因的受體細(xì)胞的分離與鑒定第五節(jié)人工染色體第五節(jié)人工染色體n染色體要確保在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定，必須要能夠自我復(fù)制和向子細(xì)胞中平均分配。它需要3個(gè)關(guān)鍵序列個(gè)關(guān)鍵序列，包括自主復(fù)制自主復(fù)制DNA序列序列（autonomously replicating sequence，ARS）、著絲粒

41、著絲粒DNA序列序列（centromere DNA sequence，CEN）和端粒端粒DNA序列序列（ telomere DNA sequence, TEL）。 將3個(gè)關(guān)鍵序列用分子生物學(xué)方法拼接起來(lái)就得到人造微人造微小染色體小染色體（artificial minichromosome），在大片段DNA分子的克隆、基因組分析、基因功能鑒定、基因治療以及研究染色體結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系等研究中得到了廣泛的應(yīng)用，具有極為重要的價(jià)值。目前，正在研究或應(yīng)用的有：n 酵母人工染色體酵母人工染色體（yeast artificial chromosome,YAC）n 細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體（bacteria

42、l artificial chromosome,BAC）n 哺乳動(dòng)物人工染色體哺乳動(dòng)物人工染色體（mammalian artificial chromosome） 基于ARS、CEN、TEL是線性染色體穩(wěn)定的功能序列，人們利用這些序列構(gòu)建載體，重組后的DNA以線性狀態(tài)存在，這樣不僅穩(wěn)定，而且大大提高了插入外源基因的能力，并且可以像天然染色體一樣在寄主細(xì)胞中穩(wěn)定復(fù)制和遺傳，稱(chēng)為人工染色體人工染色體。如利用從酵母染色體上分離的ARS、CEN、TEL序列構(gòu)建載體，然后用這種載體構(gòu)建的染色體即稱(chēng)為酵母人工染色體。 【復(fù)習(xí)思考題】【復(fù)習(xí)思考題】l經(jīng)常采用的人工誘導(dǎo)多倍體形成的手段有哪些？l要達(dá)到實(shí)驗(yàn)條件

43、下二倍體雌核發(fā)育目的需要解決哪些問(wèn)題？l選擇、判斷題：1911年，人工條件下， 第一個(gè)在適當(dāng)?shù)母咻椛鋭┝肯鲁晒Φ厝斯は司尤旧w活性，導(dǎo)致精子染色體完全失活。A. 赫特威氏B. 沃克C. 克拉克D. 摩爾根多倍體的鑒定不宜采取的方法是 。A. 核體積測(cè)量B. 染色體計(jì)數(shù)C. 血平板計(jì)數(shù) D. 利用血液成分、酶的含量等進(jìn)行生化分析 溫度休克法包括冷休克法（05度）和熱休克法（30度左右）兩種，即用略高于或略低于最適溫度的冷或熱休克來(lái)誘導(dǎo)三倍體或四倍體的方法。 一 測(cè)定細(xì)胞核體積對(duì)細(xì)胞多倍體進(jìn)行測(cè)定屬于直接法。 10.3 人工染色體人工染色體 人工染色體人工染色體酵母人工染色體酵母人工染色體細(xì)菌人工染色體細(xì)菌人工染色體哺乳類(lèi)人工染色體哺乳類(lèi)人工染色體人工染色體的應(yīng)用人工染色體的應(yīng)用人工染色體人工染色體 染色體要確保在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定性，必須要能夠自染色體要確保在細(xì)胞分裂中保持穩(wěn)定性，必須要能夠自我復(fù)制和向子細(xì)胞中平均分配，需要我復(fù)制和向子細(xì)胞中平均分配，需要3個(gè)關(guān)鍵序列：個(gè)關(guān)鍵序列： 1.自主復(fù)制自主復(fù)制DNA序列（序列（ARS） 是是DNA復(fù)制的起點(diǎn)，確保染色體能夠開(kāi)始自我復(fù)制。復(fù)制的起點(diǎn)，確保染色體能夠開(kāi)始自我復(fù)制。 2.著絲粒著絲粒DNA序列（序列（CEN） 確保染色體在細(xì)胞分裂時(shí)能平均分配到子細(xì)胞中。確保染色體在細(xì)胞分裂時(shí)能平均分配到子細(xì)胞中。