防己黃芪湯對復(fù)合造模肝纖維化小鼠肝線粒體過氧化損傷的影響

1、··506TraditionalChineseDrugResearchClinicalPharmacology,2010September,Vol21No5防己黃芪湯對復(fù)合造模肝纖維化小鼠肝線粒體過氧化損傷的影響馮勁立1，沈海蓉1，李想2，王新華1（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)）第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州510405摘要：目的研究防己黃芪湯對內(nèi)毒素脂多糖（LPS）與二甲基亞硝胺（DMN）聯(lián)合造模的肝纖維化小鼠肝線粒體以ELISA法檢測用藥后肝纖維化小鼠肝線粒體三磷酸腺苷酶（ATPase）、丙二醛（M過氧化損傷的影響。方法）以及超氧化物歧化

2、酶（SOD）的變化，觀察防己黃芪湯對肝纖維化小鼠肝組織線粒體過氧化損傷的影響。結(jié)果DA防己黃芪湯能有效降低肝纖維化小鼠肝線粒體中MDA水平，并提高ATPase及SOD的含量，其效果呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)論防己黃芪湯能有效清除肝纖維化小鼠體內(nèi)的氧自由基水平，從而減輕肝纖維化過程中的過氧化損傷。關(guān)鍵詞：防己黃芪湯；脂多糖；二甲基亞硝胺；肝纖維化；肝線粒體；過氧化損傷中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A文章編號：1003-9783（2010）05-0506-03EffectofFangjiHuangqiDecoctiononLiverMitochondrialPer-oxidativeInjuryin

3、HepaticFibrosisMiceInducedbyLipopolysaccharideandNitrosodimethylamineFENGJingli1，SHENHairong1，LIXiang2，WANGXinhua1（1.TropicalMedicalInstituteofGuangzhouUniversityofChineseMedicine，Guangzhou510405，China；2.FirstClinicalMedicalSchoolofGuangzhouUniversityofChi）neseMedicine，Guangzhou510405，ChinaAbstract:

4、ObjectiveTostudytheeffectofFangjiHuangqiDecoctiononthelivermitochondrialper-oxidativeinjuryToevaluate（LPS）andNitrosodimethylamine（DMN）inhepaticfibrosismiceinducedbylipopolysaccharide.MethodstheeffectofFangjiHuangqiDecoctiononthelivermitochondrialper-oxidativeinjuryinhepaticfibrosismice，weu）toassayth

5、econtentsofmicemitochondrialadenosinetriphostilizedenzyme-linkedimmunospecificassay（ELISA，malondialdehyde（MAD）andsuperoxidedismutase（SOD）aftermedication.ResultsFangjiphatase（ATPase）HuangqiDecoctioncouldeffectivelyreduceMDAlevel，andincreasethecontentsofATPaseandSODinlivermitochondriaofliverfibrosismi

6、ce，andtheactionwasinadose-dependentmanner.ConclusionFangjiHuangqiDecoctioncanremoveoxygenfreeradicalsinliverinjurymice，thusreducingtheper-oxidativeinjury.Keywords：FangjiHuangqiDecoction；Lipopolysaccharide；Nitrosodimethylamine；Liverfibrosis；Livermitochondria；Per-oxidativeInjury大量臨床及實驗研究表明，急慢性肝病的發(fā)生發(fā)展中

7、均可兼見腸源性內(nèi)毒素血癥，研究更發(fā)現(xiàn)由內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細胞因子及介質(zhì)或促纖維化因子往往對促進肝纖維化的發(fā)展具有重要作用1-3。但目前對于內(nèi)毒素與肝纖維化相關(guān)研究并不多見。本實驗以內(nèi)毒素脂多糖（LPS）肝纖維化模型與二甲基亞硝胺（DMN）肝纖維化模型相結(jié)合，形成復(fù)合型肝纖維化模型，一方面能改善LPS造模的不穩(wěn)定性，另一方面能使肝纖維收稿日期：2010-03-02化小鼠體內(nèi)內(nèi)毒素達到一個較為平穩(wěn)的水平，從而能較好模擬肝纖維化伴發(fā)內(nèi)毒素血癥時的內(nèi)環(huán)境，并以此為為研究平臺，觀察防己黃芪湯對肝纖維化過程中過氧化損傷的保護作用，從而探討防己黃芪湯抗肝纖維化的可行性。1材料與方法1.1動物清潔級NIH小鼠70只

8、，雄性，體重18作者簡介：馮勁立（1981-），男，博士研究生，主要從事中醫(yī)藥抗病毒研究。Email:irisfjl。中藥新藥與臨床藥理2010年9月第21卷第5期20g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，粵監(jiān)證字2008-0002。1.2藥物與試劑二甲基亞硝胺（DMN），天津市化學(xué)試劑研究所（以生理鹽水配成1.4mg/mL溶液，4保存）；內(nèi)毒素脂多糖（LPS），BIOSHARP，以生理鹽水配成0.01mg/mL溶液，4保存；防己黃芪湯為金匱要略原方，由防己、黃芪、白術(shù)、甘草、生姜及大棗組成。中藥均購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥房，煎煮并濃縮為每毫升含生藥5g的藥液，備用。秋水仙堿，廣東光華化學(xué)廠有限公司

9、，批號：20081106；線粒體提取試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所，批號：090326；Bradforb蛋白定量試劑盒，天根生化科技有限公司，批號：E7548；MDA檢測試劑盒（批號：090623）、ATPase檢測試劑盒（批號：090911）、SOD檢測試劑盒（批號：090516），南京建成生物工程研究所。1.3儀器UV-7504分光光度計，廈門東星電子儀器廠生產(chǎn)。1.4分組、造模及給藥取70只NIH小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后，隨機分成空白組，DMN組，DMN+LPS組，秋水仙堿組，防己黃芪湯高、中、低劑量組。除空白組外，各組小鼠腹腔注射DMN10mL/kg，每隔4d一次，共5次，空白組給予等量生理

10、鹽水。此外，除空白組和DMN組外，其他5組在最后一次給予DMN的同時，腹注LPS10mL/kg，空白組與DMN組給予以等量生理鹽水。各組均于造模當天開始給藥，防己黃芪湯高、中、低劑量組的劑量分別為56.25，11.25，2.25g/kg，每天1次；秋水仙堿組給予0.1mg/kg，每天2次。空白組、DMN組及LPS+DMN組給予等量蒸餾水，共21d。肝組織采集及線粒體提?。焊鹘M小鼠于最后1次腹腔注射造模藥物12h后處死，取肝臟，提取肝線粒體，并以BCA法檢測線粒體濃度。1.5檢測指標及方法小鼠肝線粒體MDA、ATPase以及SOD采用ELISA法檢測，具體方法按試劑盒說明書操作。1.6統(tǒng)計學(xué)方法

11、用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，采用t檢驗。2結(jié)果2.1防己黃芪湯對肝纖維化小鼠肝線粒體MDA的影響與空白組及DMN組相比，LPS+DMN組小鼠肝線粒體MDA含量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。防己黃芪湯各劑量對肝纖維化小鼠肝線粒體MDA均有明顯的抑制作用，與LPS+DMN組比·507·較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），且有一定的量效關(guān)系，見表1。表1防己黃芪湯對肝纖維化小鼠肝線粒體MDA的影響±s，n=10）組別劑量/g·kg-1·d-1MDA/nmol·mL-1空白組-2.292

12、77;0.123DMN組-2.712±0.047*DMN+LPS組-2.821±0.046*秋水仙堿組0.2×10-32.789±0.029防己黃芪湯組56.252.591±0.023防己黃芪湯組11.252.709±0.037防己黃芪湯組2.252.784±0.032注：與空白組比較，*P<0.05，*P<0.01；與DMN+LPS組比較，P<0.05，P<0.01。2.2防己黃芪湯對肝纖維化小鼠肝線粒體ATPase的影響與空白組及DMN組相比，LPS+DMN組小鼠肝線粒體ATPase含量明顯降低，

13、差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而各劑量防己黃芪湯能明顯提高肝纖維化小鼠肝線粒體ATPase水平，與LPS+DMN組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），見表2。表2防己黃芪湯對肝纖維化小鼠肝線粒體ATPase的影響±s，n=10）組別劑量/g·kg-1·d-1ATPase/nmol·mL-1空白組-0.921±0.027DMN組-0.807±0.016*DMN+LPS組-0.795±0.009*秋水仙堿組0.2×10-30.803±0.010防己黃芪湯組56.25

14、0.852±0.011防己黃芪湯組11.250.812±0.011防己黃芪湯組2.250.801±0.008注：與空白組比較，*P<0.05，*P<0.01；與DMN+LPS組比較，P<0.05，P<0.01。2.3防己黃芪湯對肝損傷小鼠肝線粒體SOD的影響與DMN組相比，LPS+DMN組小鼠肝線粒體SOD含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。而高劑量與中劑量防己黃芪湯對肝纖維化小鼠肝線粒體SOD均有明顯的促進作用，與LPS+DMN組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），而小劑量防己黃芪湯對S

15、OD則無明顯作用，見表3。3討論肝纖維化是由各種病因所致的細胞外基質(zhì)extracellularmatrixc，ECM）在肝內(nèi)過度沉積所產(chǎn)生的疾病，是各種急慢性肝病向肝硬化發(fā)展的所必經(jīng)病理過程，其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)化均受多種因素的影響。（··508TraditionalChineseDrugResearchClinicalPharmacology,2010September,Vol21No5表3防己黃芪湯對肝纖維化小鼠肝線粒體SOD的影響±s，n=10）組別··劑量/gkg-1d-1-0.2×10-356.2511.252.25·

16、SOD/nmolmL-127.983±0.67224.434±0.73623.478±0.56723.799±0.42525.900±0.69424.080±0.68023.485±0.456*防己黃芪湯的主要藥物已被證明具有抗肝纖維化的作用5-9。本研究運用LPS與DMN聯(lián)合建立肝纖維化小鼠模型，研究防己黃芪湯對肝纖維化過程中所出現(xiàn)的過氧化損傷的影響，從而進一步探討其抗肝纖維化的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，防己黃芪湯能有效抑制肝纖維化過程中所出現(xiàn)的過氧化損傷，這為我們深入研究防己黃芪湯抗肝纖維化的作用及機理提供了依據(jù)與基礎(chǔ)，同時也為

17、抗肝纖維化藥物的開發(fā)與研究提供了一個新的思路。參考文獻：1朱菊人，范建高.肝病與內(nèi)毒素血癥J.（）：39-40.72張馨，余衛(wèi)平.內(nèi)毒素損傷肝臟機制的研究進展J.中國感染與化療雜志；2002，22（3）：163-166.3牛近春，牛春紅，趙元昌，等.內(nèi)毒素促進肝纖維化與肝硬化形成機制的探討J.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)，2002，33（1）：10-12.4史紅陽，許君望，任曉俠.木黃酮對培養(yǎng)肝星狀細胞增殖及脂質(zhì)過氧化的影響J.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，28（11）：2066-2071.5程鵬，劉索俠.黃芪抗肝纖維化的作用與轉(zhuǎn)化生長因子J.臨床軍醫(yī)雜志，2000，22（4）：307.6吳國棟，羅瑞德.漢防

18、己甲素阻抑大鼠肝纖維化的實驗研究J.中（4）：228-230.西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2002，127賈道全，張正，羅成福，等.甘草甜素逆轉(zhuǎn)肝纖維化及早期肝硬（3）：193-196.化的作用探討J.中華肝臟病雜志，2002，108耿濤，謝梅林，孫曉飛.生姜油對急性肝損傷的保護作用研究J.中成藥，2007，29（8）：1123-1126.9顧有方，李衛(wèi)民，李升和，等.大棗多糖對小鼠四氯化碳誘發(fā)肝損傷防護作用的實驗研究J.105-107.中國中醫(yī)藥科技，2006，13（）：2山東醫(yī)藥，1993，33空白組DMN組DMN+LPS組秋水仙堿組防己黃芪湯組防己黃芪湯組防己黃芪湯組注：與空白組比較，*P<0.05，*P<0.01；與DMN+LPS組比較，P<0.05，P<0.01。內(nèi)毒素是存在于革蘭氏陰性桿菌細胞壁的脂多糖，在細胞死亡細胞壁瓦解時釋放或活菌以發(fā)泡形式將其釋出。國內(nèi)大量臨床資料表明，各種肝病均伴有不同程度的腸源性內(nèi)毒素血癥（gutdirivedendotoxemia，），如急性病毒性肝炎的GET發(fā)病率為39%64GET%，慢性肝病的GET發(fā)病率為50%，而肝硬化時更高達79%，這是由于肝病過程中，肝臟的屏障功能減弱，導(dǎo)致腸道革蘭氏陰性桿菌代謝所釋放的LPS得不到清除，進入體循環(huán)所產(chǎn)生的1。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素除了能直接損傷肝細胞外，更