薄層色譜法分離菠菜葉片中色素的研究

1、第23卷第2期2000年4月 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)JournalofAgriculturalUniversityofHebei Vol.23No.2Apr.2000文章編號(hào):1000-1573(2000)02-0101-04薄層色譜法分離菠菜葉片中色素的研究果秀敏,翟彤宇,牛延鋒(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)部,河北保定 071001)X摘要:菠菜葉片中富含多種色素成分,為了對(duì)其進(jìn)行分離鑒定,利用薄層色譜法著重研究了提取液、展開(kāi)劑等因素對(duì)色素分離的影響,選擇了石油醚(6090e)-無(wú)水乙醇(3B2,V/V)的混合溶液作提取液,石油醚(6090e)-丙酮-苯(2B1.5B2,V/V)的混合溶液作展開(kāi)劑的最佳條件

2、,單向一次性層析得到的7個(gè)斑點(diǎn)清晰、集中,簡(jiǎn)便快捷,性能優(yōu)異。層析后結(jié)合薄層掃描對(duì)其結(jié)果進(jìn)行了鑒定分析,取得了滿(mǎn)意的效果。關(guān)鍵詞:薄層色譜;葉綠素;類(lèi)胡蘿卜素;菠菜;薄層掃描中圖分類(lèi)號(hào):O65216 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:AStudyofseperatingpigmentsfromspinaciausingthinlayerchromatographyGUOXiu-min,ZHAITong-yu,NIUYan-feng(DepartmentofBasicCourses,AgriclturalUniversityofHebei,Baoding 071001,China)Abstract:Thespinac

3、iaisrichinavarietyofpigments.Inordertoseparateandidentifyit,thinlay-erchromatographywasusedtostudyhowsuchfactorsasextractant,developpingagent,etcinflu-encethepigmentsseperating.Theexperimentselectedthemixturesolutionofpetroleumether(6090e)andalcohol(3B2,V/V)asestractant,andthemixturesolutionofpetrol

4、eumether(6090e)andacetoneandbenzene(2B1.5B2,V/V)asdeveloppingagent,utilizedthebestconditionsofthesesolutions.Theseperatingresultwassevenspots.Theywerecentralizedandclear.Theexper-imentwaseasyandquick,andtheresultwasofhighquality.Afterseperating,theresultwasident-ifiedandanalysedbythin-layerscanning.

5、Itwasprovedthattheresultsweresatisfactory.Keywords:thin-layerchromatography;chlorophyl;carotenoids;spinacia;thin-layerscanning薄層色譜法具有操作簡(jiǎn)便、快速、分離效果好、適于微量分析等特點(diǎn),已應(yīng)用于小麥、藻類(lèi)、枸杞子等多種植物葉綠體色素的分離13,但利用薄層色譜法單向一次性分離鑒定菠菜葉綠素及類(lèi)胡蘿卜素的報(bào)道很少,而對(duì)其影響因素的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文研究了色素的量、展開(kāi)劑、展開(kāi)時(shí)間和距離等因素對(duì)薄層層析的影響,應(yīng)用于菠菜葉片中色素的分離鑒定,斑點(diǎn)集中而清晰,簡(jiǎn)便快速(展開(kāi)只

6、需1015min),取得滿(mǎn)意效果。1 材料與方法1.1 樣品制備稱(chēng)取一定量的新鮮菠菜葉片(Spinaciaoleracea.L),剪碎,置于研缽中,按1B1.5加入石油醚(6090e)-無(wú)水乙醇(3B2,V/V)混合溶液,適當(dāng)研磨提取,將提取液轉(zhuǎn)入分液漏斗,分2次加入等體積蒸餾水洗去水溶性物質(zhì)及乙醇,將含色素的石油醚層于暗處濃縮備用。1.2 制板稱(chēng)取硅膠G60型(青島海洋化工廠(chǎng),薄層層析用),加入適量蒸餾水調(diào)成糊狀,用薄板涂布器制成薄層厚X收稿日期:1999-09-09(),102 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第23卷0.25mm供分析用的薄板,涼干0.5h,110e活化1h,備用。1.3 展開(kāi)展開(kāi)劑為石

7、油醚(6090e)-丙酮一苯(2B1.5B2,V/V)混合液。將點(diǎn)樣后的薄板置于層析缸內(nèi),浸入到展開(kāi)劑中0.5cm,于暗處室溫展開(kāi)1015min,標(biāo)出斑點(diǎn)位置,計(jì)算各斑點(diǎn)Rf值。1.4 光譜測(cè)定待溶劑揮發(fā)后,用日本島津CS-930型薄層色譜掃描儀,對(duì)各斑點(diǎn)在370700nm掃描可見(jiàn)光譜。2 結(jié)果與討論2.1 菠菜中色素的薄層分離與鑒定利用前述方法單向一次性薄板層析菠菜提取液,分離出7個(gè)集中而清晰的斑點(diǎn)(圖1);測(cè)定各色素的Rf值,并在370700nm處掃描出各點(diǎn)對(duì)應(yīng)吸收光譜(圖2),根據(jù)Rf值及光譜學(xué)特征吸收,與文獻(xiàn)報(bào)道值º»¼½比較,分析不同色素結(jié)構(gòu)差

8、異,確定各色斑依次為¹B-胡蘿卜素、去鎂葉綠素a、葉綠素a、葉綠素b、葉¾¿黃素、紫黃質(zhì)、新黃質(zhì)(表1)。圖1 菠菜葉片中色素層析圖Fig.1 Profileofchromatographyofpigmentsfromspinacia圖2 各色素的吸收光譜圖Fig.2 Absorptionspectrogramofeverypigment圖注:1.B-胡蘿卜素 2.去鎂葉綠素a 3.葉綠素a 4.葉綠素b 5.葉黃素 6.紫黃質(zhì) 7.新黃質(zhì) 8.點(diǎn)樣點(diǎn)由表1可見(jiàn),14點(diǎn)的顏色、色譜行為和光譜學(xué)特征與文獻(xiàn)報(bào)道值吻合,因此其相應(yīng)色素組成可以確定;而5、6、7三個(gè)黃色斑

9、點(diǎn)的主要吸收峰與文獻(xiàn)報(bào)道值不完全一致,但均具有類(lèi)胡蘿卜素的特征吸收(Kmax=450nm),說(shuō)明系葉黃素類(lèi);由于高等植物中葉黃素主要成分紫黃質(zhì)(堇黃質(zhì)、紫玉米黃素)和新黃質(zhì)(新葉黃素、新玉米黃素)的末端基團(tuán)不同,因此具有不同的色譜行為,新黃質(zhì)含有3個(gè)羥基,與硅膠G中硅醇結(jié)合較緊,展開(kāi)速度較慢,紫黃質(zhì)含有雙羥基及雙環(huán)氧,其展開(kāi)速度應(yīng)慢于僅含雙羥基的葉黃素而快于新黃質(zhì),故推斷5、6、7點(diǎn)為葉黃素、紫黃質(zhì)及新黃質(zhì)。至于與文獻(xiàn)吸收峰的差異,可能與溶劑的影響有關(guān),據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,不同溶劑中同一色素吸收峰存有差異,本方法采用薄層掃描儀直接測(cè)定溶劑揮發(fā)后的各斑點(diǎn),避免了傳統(tǒng)測(cè)定方法中的溶劑干擾,因此結(jié)果更為準(zhǔn)確

10、可靠。3第2期 果秀敏等:薄層色譜法分離菠菜葉片中色素的研究表1 菠菜葉片中色素分離鑒定結(jié)果Toble1 Theseparationandidentificationresultofspinacia.spigments103序號(hào)Order1234567顏色Colour桔黃暗灰藍(lán)綠草綠黃色黃色黃色色素名稱(chēng)NamesofpigmentB-胡蘿卜素去鎂葉綠素a葉綠素a葉綠素b葉黃素紫黃質(zhì)新黃質(zhì)Rf值Rfvalue0196018301700163015201380119主要吸收蜂/nmMainabsorptionpeaks測(cè)定值文獻(xiàn)值3DeterminationvalueReferencevalue4

11、55405,540,612,662451(正己烷)450(石油醚)408,534,614,664(乙醚)430,618,664(乙醚)457,550,595,646(乙醚)457,484(氯仿)450,481(氯仿)448,478(氯仿)430,620,664460,550,595,648450,595452,59045215902.2 影響薄層層析的因素2.2.1 色素量的影響 10g鮮菠菜葉,分別以1B1,1B1.5,1B2,1B3比例加入提取液,同法提取,展開(kāi);結(jié)果以1B1.5提取所顯示的斑點(diǎn)多而清晰,效果最好。2.2.2 展開(kāi)劑的影響 展開(kāi)劑的選擇是達(dá)到良好分離的重要條件之一。根據(jù)文獻(xiàn)

12、報(bào)道選用了一般公認(rèn)為最好的石油醚-丙酮-苯溶劑系統(tǒng),對(duì)其配比和極性差異進(jìn)行了試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)溶劑的極性對(duì)色素的比移值影響很大,比移值隨著溶劑極性增加而增大,出現(xiàn)斑點(diǎn)的數(shù)量亦有不同(圖3)。當(dāng)展開(kāi)劑體積比為2B0.5B2時(shí),由于極性較小,除胡蘿卜素推到溶劑前沿外,其它各點(diǎn)均未超過(guò)板高的1/2,且葉綠素a與葉綠素b互相掩蓋未能分開(kāi),第6、7黃點(diǎn)也未出現(xiàn);配比為2B1.0B2時(shí),比移值增大,但仍只可分出4個(gè)點(diǎn);隨著溶劑極性增加,比移值逐漸增大,分離效果增加,最為理想的配比為2B1.5B2,可使7種色素清晰分開(kāi)且分布適中;配比2B1.7B2也可達(dá)到較好分離效果,只是Rf值較大,葉綠素a與葉綠素b分離較晚;配

13、比為2B2B2時(shí),雖仍可分出7個(gè)色斑,但各點(diǎn)已超過(guò)板高的1/2,過(guò)于集中。圖3 展開(kāi)劑配比對(duì)Rf的影響21213 展開(kāi)時(shí)間和距離 展開(kāi)1015min,展開(kāi)距離為610Fig.3 Theinfluenceofunfoldedcm左右時(shí),色素已完全分離、斑點(diǎn)清晰而集中,在此范圍內(nèi)展開(kāi)reagent.sdistributiononRf時(shí)間及距離對(duì)比移值無(wú)明顯影響;若展開(kāi)距離過(guò)長(zhǎng),則展開(kāi)時(shí)間11胡蘿卜素;21去鎂葉綠素a;31葉綠素a;41葉綠素b;51葉黃素;61紫黃質(zhì);71新黃質(zhì)相應(yīng)延長(zhǎng),不僅費(fèi)時(shí)而且色素的斑點(diǎn)逐漸發(fā)生擴(kuò)散、顏色漸淡。因此,認(rèn)為展開(kāi)時(shí)間1015min和展開(kāi)距離610cm可達(dá)到分離效

14、果,簡(jiǎn)便快速。21214 其它影響因素 提取液的影響,本法重點(diǎn)觀(guān)察溶劑的極性及配比對(duì)層析的影響。對(duì)石油醚、丙酮、95%乙醇、無(wú)水乙醇等幾種溶劑的配比試驗(yàn)結(jié)果表明,以石油醚)無(wú)水乙醇(3B2,V/V)為提取液效果最好,可分離出7個(gè)清晰的色斑,而石油醚)95%乙醇(2B1,V/V)及石油醚)無(wú)水乙醇(2B1,V/V)的提取液,只可分離出4或5個(gè)點(diǎn)。樣品處理方法的影響,由于鮮葉中含有多種酶,是否對(duì)層析有影響尚未見(jiàn)報(bào)。本試驗(yàn)將鮮葉與干葉(95e烘箱干燥5min以中止酶活性)同法層析,結(jié)果確有差異:干葉經(jīng)層析分離出8個(gè)色素斑點(diǎn)Rf8,01104 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)第23卷物質(zhì)的極性較大,其顏色及光譜吸收峰

15、(410,495,612,675nm)與去鎂葉綠素a很接近,但其Rf值差異較大,推測(cè)可能是去鎂葉綠素b,或者是干燥除酶過(guò)程中,色素產(chǎn)生分解或結(jié)構(gòu)變化所致,其具體成分及機(jī)制尚待進(jìn)一步證實(shí)。薄層色譜單向一次性地分離菠菜中的色素,其突出優(yōu)點(diǎn)是分離效果好、簡(jiǎn)便快速,在短短1015min內(nèi),即可一次性地將葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素展開(kāi)分離,斑點(diǎn)清晰而集中,優(yōu)于柱層析和紙層析,因而當(dāng)實(shí)際定性分析時(shí),在層析后,根據(jù)層析圖譜或Rf值計(jì)算,就可以初步判斷所含色素種類(lèi);另外,結(jié)合薄層掃描還可進(jìn)一步定性或作定量分析。參考文獻(xiàn):1 楊模坤,黃良月.葉綠素的研究Ò:葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的薄層層析J.植物生理學(xué)通訊,19

16、64(6):4-812 潘俊海,張憲孔.藻類(lèi)葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的快速薄板層析法J.植物生理學(xué)通訊,1990(3):51-5313 彭光華,李忠,張聲華.薄層色譜法分離鑒定枸杞子中的類(lèi)胡蘿卜素J.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),1998(1):76-781(編輯:郭桂仙)(上接100頁(yè))種子與接種盒內(nèi)壁相碰。由此當(dāng)排出的多粒種子與接種盒內(nèi)壁碰撞時(shí),互相分散。(2)種子向心傾向的運(yùn)動(dòng)在排種輪轉(zhuǎn)速較低時(shí),種子的離心力較小,型孔中的種子在重力的徑向分力作用下,產(chǎn)生向心運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)。它不與接種盒內(nèi)壁相碰,也不會(huì)滑落至大孔前壁,而是以不同的先后順序,順次直接排出型孔。3.4 投種口尺寸對(duì)排種性能的影響由于小麥種子的不規(guī)則性,流動(dòng)時(shí)產(chǎn)生翻轉(zhuǎn),落地時(shí)產(chǎn)生彈跳,因此很難實(shí)現(xiàn)對(duì)小麥種子的粒距和穴距要求。依據(jù)5要點(diǎn)63,4規(guī)定,要求小麥種子在5cm苗幅范圍內(nèi)均勻分布,滿(mǎn)足小麥生長(zhǎng)的農(nóng)藝要求。投種口尺寸的增大,型孔中的多粒小麥種子經(jīng)過(guò)接種盒的碰撞或按先后不同的順序順次排出,避免了因小麥種子同時(shí)排出,在田間成撮或成堆排放現(xiàn)象,影響排種均勻性能。同時(shí)由于小麥種子的提前釋放,使種子有足夠的時(shí)間滑出型孔,避免型孔中的種子擠傷或被排種輪帶走現(xiàn)象。4 小結(jié)1)在護(hù)種區(qū)內(nèi),種子有兩種運(yùn)動(dòng)趨勢(shì),一種是向心運(yùn)動(dòng),一種是離心運(yùn)動(dòng)趨勢(shì),且與殼體內(nèi)壁相碰撞。2)增