DNA分子克隆技術(shù)

1、DNA 分子克隆技術(shù)（也稱基因克隆技術(shù)） ：在體外將 DNA 分子片段與載體 DNA 片段連接，轉(zhuǎn)入細胞獲 得大量拷貝的過程中 DNA分子克?。ɑ蚧蚩寺。?。其基本步驟包括：制備目的基因-將目的基因與載體用 限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組-導(dǎo)入宿主細胞-篩選、鑒定-擴增和表達。載體（vecors）在細胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA 分子片段。主要目的是獲得某一基因或 NDA 片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu) 與功能，隨著引入的 DNA 片段不同，有兩種 DNA 庫，一種是基因組文庫（ genomic lib

2、rary） ,另一種是 cDNA 庫。載體 所謂載體是指攜帶靶 DNA 片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。細菌質(zhì)粒 是一種細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，分子大小為1-20kb，對細菌的某些代謝活動和抗藥性表型具有一定的作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造拼接而成。最常用的質(zhì)粒是 pBR322 。基因庫的建造含有某種生物體全部基歷的隨機片段的重組 DNA 克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子，可以通 過標記探針與基因庫中的重組子雜交等方法而篩選出來，所得到的克隆經(jīng)過純化和擴增，可用于進一步的研。其主步驟包括：（ 1）構(gòu)建基因庫迅速的載體； （2）DNA 片段的制備；（ 3）

3、 DNA 片段與載體 DNA 的連接；（ 4）包裝和接種。cDNA 庫的建造是指克隆的 DNA 片段，是由逆轉(zhuǎn)錄酶自 mRNA 制備的 cDNA。 cDNA 庫包括某特定細胞的全部 cDNA 克 隆的文庫，不含內(nèi)含子。特異基因的篩選常用的方法有： （1）克隆篩選即探針篩選法； （2）抗體檢測法， 檢測其分泌蛋白質(zhì)來篩選目的基因；（3）放射免疫篩選法，查出分泌特異抗原的基因；（ 4 ）免疫沉淀法，進行特異基因的篩選。核酸序列測定DNA的堿基序列決定著基因的特性，DNA序列分析 （測序，sequencing是分子生物學(xué)重要的基本技術(shù)。無論從基因庫中篩選的癌基因或經(jīng) PCR 法擴增的基因，最終均需進

4、行核酸序列分析，可藉以了解基因的 精細結(jié)構(gòu)，獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜，分析基因的突變及對功能的影響，幫助人工俁成基因、設(shè)計引物， 以及研究腫瘤的分子發(fā)病機制等。測序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的。 目前最常用的方法有 Maxam-Gilbert 的化學(xué)降解少和 Sanger 的雙脫氧法等， 近年來已有 DNA 序列自動測 定儀問世?；瘜W(xué)降解法是在DNA的片段的5端標記核素，然后用專一性化學(xué)試劑將 DNA特異地降解，在 電泳和自顯影后， 可得到從標記端延伸的片段供測讀序列和進行比較。 一般能讀出 200-250 個核苷酸序列。 雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑，如： 2， 3

5、-雙脫氧核苷三磷酸 ddNTP（ 如 ddTTP 、 ddTTP 、 ddGTP 和 ddCTP 中的一種 ）摻入到 DNA 鏈中以終止鏈的延長， 與摻入 4種正常的 dNTP 的混合物分成四組進行反應(yīng)， 這樣可得到一組結(jié)尾長衙不一、不同專一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾的DNA 片段，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成的 DNA 核苷酸序列，根據(jù)堿基互補原則，可推算出模板 DNA 分子的序列。化學(xué)降解法只需一化學(xué)試劑，重復(fù)性好，容易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì) 量的 DNA 聚合酶，便隨著 M13 噬菌體載體的發(fā)明和運用，合成的引物容易獲得，測序技術(shù)不斷改進，故 此法已被廣

6、泛應(yīng)用?；撗醴ǖ淖詣蛹す鉄晒鉁y序儀，使測工作更快速和簡便，而且保證高度重復(fù)性。至 于 RNA 測序現(xiàn)大多采用將 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA 后同測序，然后反推 RNA 序列分子克隆技術(shù)通常特指基因克隆（gene cloning ）或DNA重組技術(shù)（recombinant DNA technology ）。基因克隆主要包括：連接外源基因和克隆載體，構(gòu)建重組DNA分子，將重組 DNA分子轉(zhuǎn)入受體細胞，使外源基因隨受體細胞分裂而得以復(fù)制、繁殖。一、基因克隆的基本方法一個典型的基因克隆實驗，主要有以下操作和結(jié)果：（1 ）包括有目的基因在內(nèi)的 DNA片斷插入另一個 DNA分子（克隆載體，通常是環(huán)狀的

7、），形成重組 DNA分 子。（2）重組DNA分子通過轉(zhuǎn)化或其他類似的方法被導(dǎo)入受體細胞。大腸桿菌是使用較多的受體細胞。（3） 在受體細胞中，克隆載體指導(dǎo)重組DNA分子復(fù)制，產(chǎn)生許多完全相同的拷貝。（4）當(dāng)受體細胞分裂時，重組 DNA分子的拷貝進入子細胞，克隆載體的復(fù)制將在子細胞中繼續(xù)。（5） 大量分裂的受體細胞形成克?。阂粋€細胞群體，其中每個細胞都含有許多重組DNA分子的拷貝。顯而易見，基因克隆是一個比較直觀而簡單的操作程序。它之所以具有非常重要的生物學(xué)意義，是因 為這一技術(shù)可以為我們提供一個純粹的基因標本。通常，一個基因總是和細胞里其他基因同在?；蚩寺?技術(shù)誕生之前，我們根本無法純化單個基

8、因，這意味著我們只能對基因群、而不是特定基因的結(jié)構(gòu)與功能 進行研究和開發(fā)利用。1、重組DNA分子的構(gòu)建構(gòu)建重組DNA分子是基因克隆實驗的第一步，亦即，把環(huán)狀的載體在指定部位切斷，然后把含目的基 因的DNA分子插入其中，再將兩者連接起來。 這一過程需要兩種 DNA操作酶：限制性內(nèi)切酶（restriction endonucleases ）和連接酶（ ligases ）。限制性內(nèi)切酶能夠識別 DNA分子上的特定核苷酸序列，并在該處特異性切斷 DNA分子。例如，PvU （細菌Proteus vulgaris 分離）只識別和切斷 6核苷酸序列CGATC；從相同細菌分離的 PvUI,卻只識別并 切斷CA

9、GCTG許多限制性內(nèi)切酶的識別位點是6個核苷酸，但是，也有識別 4個或5個、甚至8個核苷酸順序的限制性內(nèi)切酶。此外，有些限制性內(nèi)切酶的識別順序可能不是唯一的，例如，Hinf I 可以識別并切斷GAATC GATTC GAGT（和GACTC因此，通常也將 Hinf I的識別位點記為 GANTC N代表A、T、G和C中 的任意一種核苷酸。經(jīng)限制性內(nèi)切酶處理后的DNA分子斷端有兩種：平端和粘端，它們的性質(zhì)對基因克隆的實驗設(shè)計有重要影響。其中，具有不同識另U位點的限制性內(nèi)切酶可以產(chǎn)生相同的粘端。例如，BglII （AGATCT和BarHI（GGATC）產(chǎn)生與Sau3A相同的GATC粘端。顯然，經(jīng)上述三

10、種酶處理的DNA分子片斷之間均可以在相應(yīng)的斷端形成互補雙鏈。DNA分子片斷通過粘端形成的堿基互補并不能使之相互連接，后一過程需要連接酶的催化作用。所有 生物細胞中都產(chǎn)生連接酶，但是，基因克隆中最常用的是T4噬菌體的連接酶。連接酶催化相鄰核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。由于平端不能使DNA片斷保持相互接近的位置，因而，和粘端相比，連接酶對平端DNA分子之間連接反應(yīng)的催化效率較差。2、克隆載體及其主要功能載體是克隆基因的關(guān)鍵組分，載體使重組DNA分子能夠在受體細胞中復(fù)制。質(zhì)粒和噬菌體是兩種天然的DNA載體。目前，能在不同受體細胞中使用的載體有數(shù)百種，其中，可以在大腸桿菌中使用的載體數(shù)目 最多。質(zhì)粒pBR

11、322是一種典型的大腸桿菌克隆載體，它全長僅為4.3kb （通常，我們很難完整地分離和純化長度超過50kb的DNA大分子）。pBR322帶有兩種抗生素抗性基因：b -內(nèi)酰胺酶基因和四環(huán)素抗性基因， 前者修飾并消除氨芐青霉素對大腸桿菌的毒性。通常，目的基因插入載體質(zhì)粒將破壞四環(huán)素抗性功能。因 此，使用含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基，我們可以鑒別大腸桿菌的轉(zhuǎn)化細胞：帶有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化細 胞只能在含氨芐青霉素、不含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長；另一方面，原受體細胞不能在含有氨芐青霉素和四 環(huán)素的培養(yǎng)基上生長；而有載體質(zhì)粒但沒有目的基因的轉(zhuǎn)化細胞能在含有氨芐青霉素和四環(huán)素的培養(yǎng)基上 生長。另外，pBR322是

12、一種松弛型質(zhì)粒，在培養(yǎng)液中加入氯霉素可以使轉(zhuǎn)化細胞中的質(zhì)粒拷貝數(shù)由通常的 15 個增至 1000-3000 個，此間，大腸桿菌的染色體并不復(fù)制。實際上，現(xiàn)在經(jīng)常使用的許多質(zhì)粒載體不同于pBR322,除抗生素抗性基因之外，這些質(zhì)粒中的其他基因也可以作為選擇基因。例如，pUC8帶有氨芐青霉素抗性基因和 LacZ基因。由于目的基因的插入部位位于LacZ/基因之內(nèi)，所以，甄別轉(zhuǎn)化細胞的操作變得更加直觀和簡單。質(zhì)粒能使轉(zhuǎn)化細胞在含有氨芐青霉 素的培養(yǎng)基上生長，并且，如果同時添加LacZ基因表達誘導(dǎo)物質(zhì)IPTG和LacZ酶（b-半乳糖苷酶）的底物X-gal，那么，帶有目的基因的轉(zhuǎn)化細胞菌落呈現(xiàn)藍色，不含目

13、的基因的轉(zhuǎn)化細胞菌落呈現(xiàn)白色。在細菌中，噬菌體載體是另外一類常用的克隆載體。和質(zhì)粒不同的是，噬菌體載體通過感染過程即轉(zhuǎn) 導(dǎo)進入宿主大腸桿菌細胞。通常，作為克隆載體的噬菌體，都經(jīng)過一定的突變和缺失處理。因此，這類噬 菌體進入大腸桿菌細胞之后，并不像一般噬菌體那樣在宿主染色體上整合，而是直接進入裂解周期：大量 復(fù)制噬菌體、裂解宿主細胞，最終在培養(yǎng)基上形成含有大量噬菌體拷貝的噬菌斑。篩選帶有目的基因的噬菌體的方法多種多樣，例如，使用有LacZ基因的噬菌體載體時，可以通過X-gal培養(yǎng)基上形成噬菌斑的顏色，區(qū)別帶有目的基因的重組噬菌體（重組子）和沒有目的基因的載體。有時， 也可以簡單地通過轉(zhuǎn)導(dǎo)前后所形

14、成的噬菌斑形態(tài)鑒別重組子。和質(zhì)粒載體相比，噬菌體載體能夠克隆更長的DNA片斷。例如，pBR322及pUC8的質(zhì)粒中可以插入最長8kb的DNA片斷，載體等噬菌體則能克隆長達25kb的DNA片斷。3、真核生物的克隆載體通常，大腸桿菌及其質(zhì)粒或噬菌體載體可以充分滿足分離和純化某些實驗用基因的目的。但是，我們 有時需要用真核生物細胞而不是大腸桿菌細胞作為受體， 例如，利用基因克隆控制和促進重要代謝產(chǎn)物 （胰 島素等）的合成、改變受體生物的特定性狀（將抗蟲特性導(dǎo)入糧食作物等），等等。這時，我們必須選擇 適合于真核細胞的克隆載體。酵母是基因克隆實驗中常用的真核生物受體細胞，培養(yǎng)酵母菌和培養(yǎng)大腸桿菌一樣方便

15、。酵母克隆載 體的種類也很多。其中，游離型質(zhì)粒 YEps（ yeast episomal plasmids ）、整合型載體 YIps （ Integrative yeast vectors ）和人工染色體 YACs（yeast artificial chromosomes ）是三種最具代表性的酵母克隆載 體。YEps是一種罕見的真核細胞質(zhì)粒，大小2mm長約6kb。YEps在細胞內(nèi)的拷貝數(shù)為 70-200個。YEps的性質(zhì)和細菌質(zhì)粒載體非常相似，唯一不同的是轉(zhuǎn)化細胞的篩選方法。使用YEps時，主要通過受體細胞營養(yǎng)要求的變化鑒別轉(zhuǎn)化細胞與受體細胞。由于利用YEps克隆的基因容易在細胞繼代過程中丟失

16、，因而，人們常用YIps替代YEps。不過，作為酵母菌的克隆載體，YIps的轉(zhuǎn)化頻率很低。另一方面，典型的 YACs包括一個著絲點、兩個端粒、一個復(fù)制起點和幾個選擇標記基因，是一個微型染色體。YACs主要用于克隆長基因或包括數(shù)個基因序列的基因組DNA片斷。許多重要的動物基因往往含有多個內(nèi)含子、占據(jù)相當(dāng)長的DNA區(qū)域，而使用普通載體通常難以獲得完整的基因序列克隆。在某些特殊的情形中，我們還需要選用動物或植物細胞作為克隆的受體細胞。例如，把克隆的基因?qū)?入糧食作物以改善其營養(yǎng)質(zhì)量等。常用的植物克隆載體主要是 Ti 質(zhì)粒及其衍生物；常用的哺乳動物克隆 載體主要是一些由大腸桿菌質(zhì)粒或哺乳類病毒改建的載

17、體。二、構(gòu)建和篩選基因文庫基因文庫（genomic library ）是一套包含特定生物體所有基因的DNA序列，其中，不同的 DNA序列片段分別被克隆在適當(dāng)?shù)妮d體上。例如，人類基因文庫是一群帶有人類基因克隆的大腸桿菌細胞，我們可 以從這個文庫中篩選、鑒定和研究任何人類基因?；蛭膸彀ㄓ苫蚪M DNA勾成的基因組文庫和由與 mRNA 互補的DNA勾成的cDNA文庫。cDNA文庫不含非轉(zhuǎn)錄的基因組序列（重復(fù)序列等）。從基因組文庫中篩選 和鑒定目的基因主要方法是利用各種分子探針手段和DNA 側(cè)序儀。1、構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫的基本方法是：（1 ）將特定生物體的基因組 DNA或互補DNA分解成適當(dāng)

18、長度的 DNA片段， 然后分別與克隆載體連接；（2）通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將帶有不同DNA片段的重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞，獲得一套包含特定生物體所有DNA序列的克隆。成功構(gòu)建基因文庫的關(guān)鍵是選擇合適的純化、切斷DNA的方法和克隆載體，使所獲得的一套DNA序列克隆具有代表性、即不短缺任何DNA片段。例如，在構(gòu)建基因組文庫的過程中，如果某一段基因組 DNA序列沒能被克隆，那么，該基因組文庫便不具有代表性。相似地，如果所建文庫中沒有足夠數(shù)量的克隆，那么，肯定會有某些基因缺失。當(dāng)然，一個完整的cDNA文庫也只包括那些與mRNA補的DNA序列，缺乏不轉(zhuǎn)錄的 DNA序列。分離和純化真核生物基因組 DNA時

19、，通常采用蛋白酶分解和相抽提的方法除掉蛋白質(zhì)及脂類等其他大 分子。基因組DNA片段化則主要采用物理剪切法和限制性內(nèi)切酶法。其中，用攪拌及超聲波等物理剪切法 處理基因組DNA后，可獲得大量較短的 DNA隨機斷片。另一方面，由于各種識別位點在基因組DNA上是非隨機分布的，使用不同的限制性內(nèi)切酶，可以獲得具有不同長度分布特征的DNA片段。常用的限制性內(nèi)切酶有 Sau3A 等。構(gòu)建基因文庫中常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體、粘粒（cosmid）以及YAC這些載體可以克隆的 DNA片段長度上限分別約為10、23、45和1000kb。選擇載體的主要參數(shù)是基因組大小，即基因組DNA序列的長短。例如，構(gòu)建大腸桿菌（4.6 10 6kb）等基因組較小生物的基因組文庫時，采用質(zhì)粒作為載體便可得到 滿意的結(jié)果：按每個 DNA片段平均長5kb計算，一個包括5000個DNA片段克隆的基因文庫就能夠代表一 個完整的大腸桿菌基因組序列。構(gòu)建較大基因組的文庫時，噬菌體、粘粒以及YAC常被選作克隆載體。其中，EMBL3和 IDASH等噬菌體的衍生物是構(gòu)建基因組文庫中使用最多的載體。2、篩選和鑒定基因文庫中的目的基因 目前，有很多方法能夠幫助我們從基因文庫的眾多克隆中篩選和鑒定帶有特定基因的克隆，這些方法大多是以雜交探查技術(shù)（ hybridization probing ）為基礎(chǔ)的。雜交探測是一種利用能和目的基因序列互