限制性核酸內(nèi)切酶

1、限制性核酸內(nèi)切酶 限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶，簡稱限制酶。 限制性核酸內(nèi)切酶是由細菌產(chǎn)生的，其生理意義是提高自身的防御能力. 限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNA。 根據(jù)限制酶的結構，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性內(nèi)切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性內(nèi)切酶同時具有修飾及認知切割的作用。 第一型限制酶

2、同時具有修飾（modification）及識別切割（restriction）的作用；另有識別（recognize)DNA上特定堿基序列的能力，通常其切割位點（cleavage site）距離識別位點（recognition site）可達數(shù)千個堿基之遠。例如：EcoB、EcoK。 第二型限制酶 只具有識別切割的作用，修飾作用由其他酶進行。所識別的位置多為短的回文序列（palindrome sequence）；所剪切的堿基序列通常即為所識別的序列。是遺傳工程上，實用性較高的限制酶種類。例如：EcoRI、Hind。 第三型限制酶 與第一型限制酶類似，同時具有修飾及識別切割的作用。可識別短的不對稱序

3、列，切割位與識別序列約距24-26個堿基對。例如：Hinf。生理意義 限制作用實際就是限制酶降解外源DNA1 ，維護宿主遺傳穩(wěn)定的保護機制。甲基化是常見的修飾作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保護。通過甲基化作用達到識別自身遺傳物質(zhì)和外來遺傳物質(zhì)的目的。所以，能產(chǎn)生防御病毒侵染的限制酶的細菌，其自身的基因組中可能有該酶識別的序列，只是該識別序列或酶切位點被甲基化了。但并不是說一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多數(shù)限制酶對DNA甲基化敏感，因此當限制酶目標序列與甲基化位點重疊時，對酶切的影響有3種可能，即不影響、部分影響、完全阻止。對甲基化DNA的切割能力是限制酶內(nèi)在和不可預測的特性，

4、因此，為有效的切割DNA，必須同時考慮DNA甲基化和限制酶對該類型甲基化的敏感性。另外，大部分商業(yè)限制酶如今專門用于切割甲基化DNA。限制性內(nèi)切酶的應用 自從I型限制酶發(fā)現(xiàn)以來,越來越多地受到生化學家的青睞,因為限制酶對DNA分子具有專一性的切口,而為人們在分子水平上切割分析、重組遺傳信息提供了重要的工具。 (一)用于染色體DNA的分析 先將DNA用限制性內(nèi)切酶切割成一系列片段,利用聚丙烯酷胺或瓊脂糖電泳可以輕而易舉地將上述片段分離并且通過測定它們在凝膠中的遷移速度或直接在電鏡下觀察測量它們的大小。這些碎片在整個基因組的排列次序,主要靠幾種不同的限制酶部分水解DNA,再對產(chǎn)物進行電泳分析。 用

5、同樣的方法也可以進行DNA中各脫氧核普酸的順序分析。也就是說,逐步使用多種限制酶,可將染色體DNA片段切得很小,如果片段之間出現(xiàn)重迭,分析小的重迭DNA片段的脫氧核普酸的序列,用現(xiàn)在的生化方法是毫無問題的。 (二)確定DNA復制起點或終點的位置在DNA復制開始之后,將DNA分離出來,用限制酶處理,再用電鏡觀察是在什么地方開始復制的,Fareed等利用EeoRI確定了sV40DNA分子的復制起點。 同理也可以確定RNA在DNA上的轉錄位置,例如,將標記的RNA與未標記的DNA雜交,就可以知道這段RNA是從哪一段DNA上轉錄的。(三)基因的甲基化研究由于HPal僅能識別切割雙鏈DNA分子中ccGG

6、順序,但其中Cyt必需是設有甲基化的;而MPsI識別同樣的順序,但其中Cyt必需是被甲基化的。因此有人利用這一對限制酶對真核基因的甲基化程度進行研究(1。(四）應用于DNA重組分子生物學研究中發(fā)現(xiàn)的許多核酸酶類都可用作基因工程的工具。其中能識別特定的回文序列并切割DNA雙鏈的類限制性核酸內(nèi)切酶在DNA重組技術中被廣泛應用。（五）構建載體采用5端引入1個限制性內(nèi)切酶Xcm 酶切位點的1對引物,以水稻品種日本晴基兇組DNA作為模板,擴增得到一段627 bp的PCR片段.并將其連接到pGEM-T Easy載體上得到名為T-xia的重組載體.利用限制性內(nèi)切酶Xcm 酶切T-xia載體產(chǎn)生的自制T載體與

7、其他PCR片段連接,檢測結果表明,有80%的重組菌能擴增出目的片段。限制酶的作用位點質(zhì)粒 質(zhì)粒存在于許多細菌以及酵母菌等生物中，是細胞染色體外能夠自主復制的很小的環(huán)狀DNA分子。 把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術，送進受體細胞中去進行繁殖和表達的工具叫載體（Vector）。細菌質(zhì)粒是重組DNA 技術中常用的載體。質(zhì)粒分子本身是含有復制功能的遺傳結構。質(zhì)粒還帶有某些遺傳信息，所以會賦予宿主細胞一些遺傳性狀。其自我復制能力及所攜帶的遺傳信息在重組DNA操作，如擴增、篩選過程中都是極為有用的。 質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎上為適應實驗室操作而進行人工構建的。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有

8、一個或一個以上的選擇性標記基因（如抗生素抗性基因）和一個人工合成的含有多個限制性內(nèi)切酶識別位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多質(zhì)粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些用途包括通過組織化學方法肉眼鑒定重組克隆、產(chǎn)生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉錄外源DNA序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。一個理想的克隆載體大致應有下列一些特性：分子量小、多拷貝、松弛控制型；具有多種常用的限制性內(nèi)切酶的單切點；能插入較大的外源DNA片段；具有兩個以上的遺傳標記物，便于鑒定和篩選。對宿主細胞無害。常用的質(zhì)粒載體大小一般在1kb至10kb之間，如P

9、BR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（簡稱pBS）等。細胞復制 質(zhì)粒在細胞內(nèi)的復制一般有兩種類型：緊密控制型（Stringent control）和松弛控制型（Relaxed control）。前者只在細胞周期的一定階段進行復制，當染色體不復制時，它也不能復制，通常每個細胞內(nèi)只含有一個或幾個質(zhì)粒分子，如F因子。后者的質(zhì)粒在整個細胞周期中隨時可以復制，在每個細胞中有許多拷貝，一般在20個以上，如 Col E1質(zhì)粒。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑-氯霉素時，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、染色體DNA復制和細胞分裂均受到抑制，緊密型質(zhì)粒復制停止，而松弛型質(zhì)粒繼續(xù)復制，質(zhì)?？截悢?shù)可由原來20多個擴

10、增至1000-3000個，此時質(zhì)粒DNA占總DNA的含量可由原來的2%增加至40-50%。質(zhì)粒的不相容性 利用同一復制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能在同一宿主細胞中共同存在，當兩種質(zhì)粒同時導入同一細胞時, 它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中彼此競爭。在一些細胞中，一種質(zhì)粒占優(yōu)勢，而在另一些細胞中另一種質(zhì)粒卻占上風。當細胞生長幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會丟失，因而在細胞后代中只有兩種質(zhì)粒的一種，這種現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同復制系統(tǒng)的質(zhì)粒則可以穩(wěn)定地共存于同一宿主細胞中。質(zhì)粒通常含有編碼某些酶的基因，其表型包括對抗生素的抗性，產(chǎn)生某些抗生素，降解復雜有機物，產(chǎn)生大腸桿菌

11、素和腸毒素及某些限制性內(nèi)切酶與修飾酶等。質(zhì)粒圖譜大腸桿菌質(zhì)粒的分子結構示意圖pBR322質(zhì)粒 pBR322質(zhì)粒DNA分子的長度為4361bp*（*Sequencing data from Watson (confirmed at New England Biolabs, Inc.) has shown pBR322 to be 4,361 base pairs, not 4,363 base pairs as previously reported.），此載體中有兩個標記基因，一個是氨芐青霉素抗性基因（Apr），另一個是四環(huán)素抗性基因（Tetr）。已知pBR322DNA分子共有24種核酸內(nèi)切限

12、制酶的單一識別位點。其中7種限制酶（從12：00位置按順時針方向）即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、Xma和NruI的識別位點位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，另外有2 種限制酶即ClaI和Hind的識別位點是存在于這個基因的啟動區(qū)內(nèi)，在這9個限制位點上插入外源DNA都會導致tetr的失活。3種限制酶即ScaI、PvuI和PstI的識別位點位于氨芐青霉素抗性基因內(nèi)，在這些位點插入外源DNA則會導致ampr基因的失活。 由pBR322質(zhì)粒載體的結構可知其具有如下優(yōu)點：具有較小的分子量。經(jīng)驗表明，為了避免在DNA的純化過程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小最好不要超過10Kb。pBR3

13、22質(zhì)粒這種小分子量的特點，不僅易于自身DNA的純化，而且可容納較大的外源DNA片段；具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號，能指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。標記基因往往可以賦予宿主細胞一種新的表型，這種轉化細胞可明顯地區(qū)別于非轉化細胞。當我們把一個DNA片段插入到某一個標記基因內(nèi)時，該基因就失去了相應的功能。當把這種重組DNA分子轉到宿主細胞后，該基因原來賦予的表型也就消失了。要是仍保留了原來表型的轉化細胞，細胞內(nèi)含有的DNA分子一定不是重組子。很顯然，既要指示外源DNA是否進入了宿主細胞，又要指示載體DNA分子中是否插入了外源

14、DNA片段，那么這種載體必須至少具有兩個標記基因。另外，pBR322質(zhì)粒載體還具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素擴增之后，每個細胞中可積累10003000個拷貝，這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。 常用的人工質(zhì)粒運載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因（Tcr）和抗氨芐青霉素基因（Apr），并含有27種限制性內(nèi)切酶的單一識別位點。 pBR322質(zhì)粒作為一種常用的基因克隆載體，在實際應用中有著非常重要的地位，其中一個突出的例子就是應用pBR322 作為克隆載體對水稻的葉綠體光誘導基因psbA 進行結構分析。應用實例 -1 將水稻葉綠體的DNA，用EcoRI核酸限制性內(nèi)

15、切酶消化之后，放入含有溴化乙錠的低熔點（LMP）的1%瓊脂糖凝膠中作電泳分離。從LMP中分離出分子大小為1.82.5kb之間的DNA片段，再與同樣經(jīng)過了EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的pBR322質(zhì)粒連接。然后，將混合物轉化到大腸桿菌5346菌株，培養(yǎng)在氨芐青霉素選擇平板上，形成Ampr轉化子菌落群體。這樣就構成了由EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶切割的水稻葉綠體DNA基因組庫。用Ampr轉化子菌落與32P放射性標記的玉米psbA DNA 探針作菌落雜交，可以分離出其中的陽性克隆體。從這些陽性克隆體中分離出來的重組體質(zhì)粒DNA，經(jīng)過進一步的分析，就能測出水稻葉綠體基因ps

16、bA的序列。應用實例-2 利用pBR322作為載體重組人體的抑生長激素也是一個經(jīng)常提到的應用例子。其過程和水稻葉綠體基因重組大同小異，只是除了在質(zhì)粒載體上插入抑生長激素基因外，還將含有l(wèi)ac操縱子起始部分的片段（包括啟動子、操縱區(qū)、核糖體結合位點和半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生長激素基因的旁邊。由于有了lac操縱子的控制，重組基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)就變得比較容易了。應用實例-3 目的監(jiān)控MSAP甲基化檢測過程,以控制MSAP每一反應步驟。方法利用PBR322質(zhì)粒作為陽性對照,全程監(jiān)控MSAP分析中酶切、連接、預擴與選擴體系。結果PBR322質(zhì)粒作為陽性對照電泳時條帶有限,可以根據(jù)條帶有無和位置對MSAP甲基化檢測過程進行全程監(jiān)控,有助于發(fā)現(xiàn)問題的具有所在。結論該研究可以為MSAP技術提供可靠保障。 MS