生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法ppt課件

1、糖的薄層層析糖的薄層層析 v實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理v薄層層析是一種微量而快速的層析方法。該法是把薄層層析是一種微量而快速的層析方法。該法是把吸附劑或支持劑涂布在玻璃板上成為一薄層，將要吸附劑或支持劑涂布在玻璃板上成為一薄層，將要分析的樣品滴加到薄層上，然后用合適的溶劑進(jìn)行分析的樣品滴加到薄層上，然后用合適的溶劑進(jìn)行展開，使樣品各個(gè)成分分離，然后進(jìn)行定性鑒定和展開，使樣品各個(gè)成分分離，然后進(jìn)行定性鑒定和定量測(cè)定。定量測(cè)定。v根據(jù)原理的不同薄層層析通常有根據(jù)原理的不同薄層層析通常有4種類型：吸附薄種類型：吸附薄層層析，分配薄層層析，離子交換薄層層析和薄層層層析，分配薄層層析，離子交換薄層層析和薄層電泳。

2、電泳。實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作硅膠薄板的制備：注意膠要均勻。硅膠薄板的制備：注意膠要均勻。 1.2 g硅膠硅膠H加加4.0 ml0.5%CMC溶溶液，研磨數(shù)分鐘后，倒在預(yù)先準(zhǔn)備好的液，研磨數(shù)分鐘后，倒在預(yù)先準(zhǔn)備好的玻璃板上，鋪開，使?jié){液分部均勻，放玻璃板上，鋪開，使?jié){液分部均勻，放在水平臺(tái)上，自然晾干。在水平臺(tái)上，自然晾干。2. 板的處理：板的處理：薄板的活化：薄板的活化：105，0.5h 薄板的刮分：徑向?qū)游龅膬?yōu)點(diǎn)是：樣品展層后圖薄板的刮分：徑向?qū)游龅膬?yōu)點(diǎn)是：樣品展層后圖譜呈弧形帶狀，使譜呈弧形帶狀，使Rf值相近的化合物也能清楚地值相近的化合物也能清楚地分開。分開。3. 點(diǎn)樣：樣品為鼠李糖、木糖和葡

3、萄糖。點(diǎn)樣量點(diǎn)樣：樣品為鼠李糖、木糖和葡萄糖。點(diǎn)樣量8-10l。留意：點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑小于。留意：點(diǎn)樣點(diǎn)的直徑小于5mm，點(diǎn)樣，點(diǎn)樣要少量多次，吹風(fēng)機(jī)風(fēng)力不能過大。要少量多次，吹風(fēng)機(jī)風(fēng)力不能過大。4. 展層：展層溶劑為：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：展層：展層溶劑為：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水水=12：3：3：2體積比），新鮮配制。體積比），新鮮配制。5. 顯色：顯色劑：苯胺顯色：顯色劑：苯胺-二苯胺二苯胺-磷酸試劑。磷酸試劑。20mm10mm30mm8mm苯丙氨酸解氨酶的提取純化苯丙氨酸解氨酶的提取純化 v實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理v苯丙氨酸解氨酶苯丙氨酸解氨酶L-phenylalanine：ammonia lya

4、se，簡(jiǎn)稱，簡(jiǎn)稱PAL；EC4.3.1.5是植物體內(nèi)苯丙是植物體內(nèi)苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木烷類代謝的關(guān)鍵酶，與一些重要的次生物質(zhì)如木質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切質(zhì)素、異黃酮類植保素、黃酮類色素等合成密切有關(guān)，在植物正常生長(zhǎng)發(fā)育和抵御病菌侵害過程有關(guān)，在植物正常生長(zhǎng)發(fā)育和抵御病菌侵害過程中起重要作用。中起重要作用。 v本次實(shí)驗(yàn)是以銀杏葉為原料采用分步鹽析、透析本次實(shí)驗(yàn)是以銀杏葉為原料采用分步鹽析、透析脫鹽、離子交換等方法得到苯丙氨酸解氨酶。脫鹽、離子交換等方法得到苯丙氨酸解氨酶。儀器儀器高速冷凍離心機(jī)；恒溫水??；電子天平；柱層析系統(tǒng)高速冷凍離心機(jī)；恒溫水??；電

5、子天平；柱層析系統(tǒng)試劑試劑酶提取液：酶提取液：0.1mol/L硼酸硼酸-硼砂緩沖液含硼砂緩沖液含1mmol/LEDTA、20mmol/L-巰基乙醇）巰基乙醇）固體硫酸銨固體硫酸銨0.02mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液pH8.0，含，含0.5mmol/LEDTA，2.5%甘油，甘油，20mmol/L-巰基巰基乙醇）；乙醇）；DEAE纖維素纖維素52操作步驟操作步驟酶液提取酶液提?。?植物材料植物材料2g，剪成小段，加入，剪成小段，加入5倍體積的酶提取液，于冰浴上用倍體積的酶提取液，于冰浴上用研缽研磨。研缽研磨。（2將已勻漿的酶液轉(zhuǎn)入離心管，將已勻漿的酶液轉(zhuǎn)入離心管，4000r冷凍離心冷凍離心

6、30min。（3取離心后的上清液酶粗提取離心后的上清液酶粗提液），量出其體積，留樣液），量出其體積，留樣 0.5ml 。硫酸銨分級(jí)沉淀酶蛋白硫酸銨分級(jí)沉淀酶蛋白（1根據(jù)實(shí)際體積、溫度和硫酸銨根據(jù)實(shí)際體積、溫度和硫酸銨飽和度用量表，算出達(dá)到飽和度用量表，算出達(dá)到38%飽飽和度應(yīng)加入酶粗提液中的硫酸銨和度應(yīng)加入酶粗提液中的硫酸銨量，并稱硫酸銨。（量，并稱硫酸銨。（240g/L)（2將酶液倒入燒杯內(nèi)，邊緩慢攪將酶液倒入燒杯內(nèi)，邊緩慢攪拌邊緩慢加入稱好的固體硫酸銨，拌邊緩慢加入稱好的固體硫酸銨，待全部加完后，再緩慢攪拌待全部加完后，再緩慢攪拌10min；然后于；然后于9000r離心離心15min，保留

7、上清液于燒杯內(nèi)。保留上清液于燒杯內(nèi)。（3根據(jù)硫酸銨飽和度用量表，算根據(jù)硫酸銨飽和度用量表，算出從出從38%到到75%飽和度所需硫酸飽和度所需硫酸銨用量。銨用量。 （222g/L)（4按上述按上述2步同法處理，離步同法處理，離心后，棄去上清液，保留沉淀。心后，棄去上清液，保留沉淀。（5將沉淀溶于將沉淀溶于2ml酶抽提液中酶抽提液中,留留樣樣 0.5ml 。透析脫鹽透析脫鹽酶液裝入透析袋，放入低鹽溶液中透酶液裝入透析袋，放入低鹽溶液中透析過夜析過夜,留樣留樣 0.5ml 。銀杏葉銀杏葉2g +10ml酶提取液研磨酶提取液研磨 4000rpm、30min 取上清液取上清液 加硫酸銨至飽和度加硫酸銨至

8、飽和度38% 9000rpm、15min 取上清液取上清液 加硫酸銨至飽和加硫酸銨至飽和度度75% 9000rpm、15min 取沉淀取沉淀 溶于溶于2ml酶抽提液酶抽提液 透析透析純化純化離子交換層析離子交換層析-DEAE纖維素纖維素（1稱取稱取DEAE纖維素纖維素52干粉干粉11.5g，加，加20ml的的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液pH8.0浸泡浸泡4h以上或浸泡過夜）。以上或浸泡過夜）。（2裝柱：把預(yù)處理的裝柱：把預(yù)處理的DEAE纖維素纖維素52裝柱。裝柱完成后，裝柱。裝柱完成后，用用23個(gè)床體積的個(gè)床體積的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液pH8.0洗脫平洗脫平衡

9、該柱。衡該柱。（3上樣：把所得的酶洗脫液小心地注入柱床面中央，上樣上樣：把所得的酶洗脫液小心地注入柱床面中央，上樣結(jié)束后，在床面以上小心地加入結(jié)束后，在床面以上小心地加入0.02mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液23cm厚液層。注意上樣開始就收集流出液。厚液層。注意上樣開始就收集流出液。（4洗柱：約用洗柱：約用2倍床體積的倍床體積的A液液0.02mol/L磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液及及B液含液含1mol/LNaCl 的的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液洗柱，磷酸鹽緩沖液洗柱， 按洗脫管編號(hào)，取按洗脫管編號(hào)，取A280值高的管中洗脫液測(cè)其值高的管中洗脫液測(cè)其PAL的活力；的活力；合并主要含有合并主要

10、含有PAL活力的各管洗脫液，并量出其體積活力的各管洗脫液，并量出其體積ml）。）。苯丙氨酸解氨酶的活力測(cè)定苯丙氨酸解氨酶的活力測(cè)定 PAL催化催化L-苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸，苯丙氨酸裂解為反式肉桂酸，反式肉桂酸在反式肉桂酸在290nm處有最大吸收值。若處有最大吸收值。若酶的加入量適當(dāng)，酶的加入量適當(dāng)，A290升高的速率可在升高的速率可在幾小時(shí)內(nèi)保持不變，因此通過測(cè)定幾小時(shí)內(nèi)保持不變，因此通過測(cè)定A290升高的速率以測(cè)定升高的速率以測(cè)定PAL活力。規(guī)定活力。規(guī)定1h內(nèi)內(nèi)A290增加增加0.01為為PAL的一個(gè)活力單位。的一個(gè)活力單位。v取試管取試管2支，按表中所述支，按表中所述0號(hào)為調(diào)零管，號(hào)

11、為調(diào)零管，1號(hào)為測(cè)定管。號(hào)為測(cè)定管。注意按表格從上到下的順序加入試劑）。（單位：注意按表格從上到下的順序加入試劑）。（單位：ml） 試劑類型調(diào)零管（0號(hào)）待測(cè)管（1號(hào)）pH8.7的0.1mol/L硼酸緩沖液320.1mol/L L-苯丙氨酸溶液0 1樣品（酶）溶液0.1 0.1將各管混勻，放入將各管混勻，放入40恒溫水浴保溫恒溫水浴保溫1h準(zhǔn)確計(jì)時(shí)），到時(shí)準(zhǔn)確計(jì)時(shí)），到時(shí)各加各加0.2 ml 2 mol/LHCl終止反應(yīng)。終止反應(yīng)。紫外分光光度于波長(zhǎng)紫外分光光度于波長(zhǎng)290nm處測(cè)定處測(cè)定1號(hào)管的號(hào)管的A290。蛋白質(zhì)測(cè)定考馬斯亮藍(lán)染色法）蛋白質(zhì)測(cè)定考馬斯亮藍(lán)染色法）取酶液取酶液0.1ml，用

12、蒸餾水稀釋至，用蒸餾水稀釋至5ml取試管取試管8支，按下表加入各溶液：支，按下表加入各溶液：將上述各試管混勻，靜置將上述各試管混勻，靜置2min，測(cè)定各管的，測(cè)定各管的A595。 試管編號(hào)01234567標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（ml）50ug/ml 00.20.40.60.81.0/稀釋酶液（ml）/1.01.0蒸餾水（ml）2.01.81.61.41.21.01.01.0考馬斯亮藍(lán)（ml）2.02.02.02.02.02.02.02.0PAL總活力、比活力、蛋白質(zhì)含量的計(jì)算總活力、比活力、蛋白質(zhì)含量的計(jì)算步驟步驟體積（體積（ml）蛋白質(zhì)含量蛋白質(zhì)含量（mg）總活力總活力（m）比活力比活力（m/mg

13、protein）粗提粗提硫酸銨沉淀硫酸銨沉淀透析透析離子交換層析離子交換層析SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)分子量分子量 v原理：原理：vSDS PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)的電泳方法，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。v 電泳遷移率與顆粒的電荷、外形、大小電泳遷移率與顆粒的電荷、外形、大小分子量有關(guān)，如電荷、形狀都一樣，分子量有關(guān)，如電荷、形狀都一樣，則電泳遷移率只與分子量有關(guān)。則電泳遷移率只與分子量有關(guān)。測(cè)定各條帶的相對(duì)遷移率，測(cè)定各條帶的相對(duì)遷移率，

14、根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和根據(jù)已知蛋白質(zhì)分子量和它們的相對(duì)遷移率，以相它們的相對(duì)遷移率，以相對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，對(duì)遷移率為橫坐標(biāo)，lgMr為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移據(jù)未知蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出它們的的lgMr，再換算成蛋白質(zhì)，再換算成蛋白質(zhì)分子量分子量操作如同操作如同PAGE。樣品：蛋白質(zhì)要完全變性。樣品：蛋白質(zhì)要完全變性。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)+SDS+巰基乙醇巰基乙醇 100 2-5分鐘分鐘標(biāo)準(zhǔn)蛋白市場(chǎng)有售，被測(cè)蛋白質(zhì)的分子量應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)蛋白市場(chǎng)有售，被測(cè)蛋白質(zhì)的分子量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量以內(nèi)。在標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量以內(nèi)。染色：考馬氏亮藍(lán)、銀染色

15、染色：考馬氏亮藍(lán)、銀染色該法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的局限性：該法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量的局限性：1.蛋白質(zhì)是由亞基如血紅蛋白或兩條以上蛋白質(zhì)是由亞基如血紅蛋白或兩條以上肽鏈如胰凝乳蛋白酶組成的，測(cè)定時(shí)只肽鏈如胰凝乳蛋白酶組成的，測(cè)定時(shí)只是它們的亞基或單條肽鏈的是它們的亞基或單條肽鏈的MW。2. 電荷異常的蛋白質(zhì)如組蛋白，帶大量正電荷異常的蛋白質(zhì)如組蛋白，帶大量正電荷）電荷）3.結(jié)構(gòu)異常，不于分子量呈線性關(guān)系如膠原結(jié)構(gòu)異常，不于分子量呈線性關(guān)系如膠原蛋白）蛋白）4.帶有較大輔基的蛋白質(zhì)如糖蛋白）帶有較大輔基的蛋白質(zhì)如糖蛋白）實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作編號(hào)溶液名稱12%分離膠4%濃縮膠130% Acr 0.8% Bis

16、2.0ml0.2ml2pH 8.8 Tris -HCI1.25ml-3pH 6.8Tris- HCI-0.375ml410%SDS50ul15ul5TEMED5ul5ul610%AP50ul15ul7H2O1.65mlo.9ml總體積約5 mL約1.5 mL 膠的制備膠的制備標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量分子量兔磷酸化酶兔磷酸化酶B97 400牛血清白蛋白牛血清白蛋白66 200兔肌動(dòng)蛋白兔肌動(dòng)蛋白43 000牛碳酸酐酶牛碳酸酐酶31 000胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑20 100雞蛋清溶菌酶雞蛋清溶菌酶14 400樣品的處理：按樣品的處理：按0.5mg蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)/1mL溶液的比例向標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的比例向標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)或待測(cè)樣品中加入樣品溶解液小試管），充分溶解后，置沸水或待測(cè)樣品中加入樣品溶解液小