抗肺癌、食管癌天然小分子化合物的篩選及其作用機制研究

1、抗肺癌、食管癌天然小分子化合物的篩選及其作用機制研究在全球所有惡性腫瘤當(dāng)中,肺癌的發(fā)病率以及死亡率位列榜首。我國是肺癌的高發(fā)國家,尤其近些年來在城市人群中肺癌的發(fā)病率持續(xù)升高,嚴重威脅著人們的生命健康。肺癌按照病理分型分類可分為:非小細胞肺癌(non-smallcelllungcancer,NSCLC)和小細胞肺癌(smallcelllungcancer,SCLC)。其中非小細胞癌在所有肺癌中約占80-85%是最常見的類型。隨研究的不斷深入,治療的手段也不斷的豐富。在眾多的治療方式中,化學(xué)治療發(fā)揮著重要的作用,但經(jīng)典的化療存在著特異性低的特點,因此在治療過程中經(jīng)常會影響到正常細胞組織的生存、生

2、長,從而出現(xiàn)骨髓造血功能抑制、胃腸道反應(yīng)等副反應(yīng)。另外現(xiàn)階段的化療藥物同時還普遍存在著耐藥現(xiàn)象。為解決上述問題,我們需要更加深入的從分子水平上研究肺癌細胞的發(fā)生發(fā)展,并且尋找新型的,抗肺癌效果更確切、毒副作用更低的治療藥物。食道癌是世界上常見的惡性腫瘤之一。在腫瘤所致的死亡率排名中位于第7,嚴重威脅著人們的生命健康安全。其中食管鱗狀細胞癌(SCC)是最常見的食管癌病理分型。雖然在過去的幾十年里,手術(shù)和輔助化療使患者的癥狀得以緩解,生活質(zhì)量得以改善,但是食道癌患者的5年生存率仍小于30%。食管癌對化療藥物敏感性不高,并且化療藥物常帶有明顯的副作用。因此,探索新的、更有效的、更加安全的治療藥物是十

3、分必要的。近些年來,一系列以我國傳統(tǒng)中藥單體作為新型抗腫瘤藥物的研究受到高度關(guān)注。經(jīng)研究這些藥物常常特異性的作用于腫瘤細胞凋亡與細胞周期,參與相關(guān)信號通路的調(diào)控,從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、細胞周期發(fā)生阻滯,抑制了腫瘤細胞的增殖,為腫瘤的預(yù)防以及治療提供了新的方法,為探究腫瘤的分子學(xué)機制提供了研究方向。木香烴內(nèi)酯(Costunolide,CT)為倍半萜內(nèi)酯類化合物,是中藥木香的主要化學(xué)成分之一。木香烴內(nèi)酯具有廣泛的藥理活性,具有抗腫瘤、抗?jié)?、抗炎、抗真菌以及抗病毒等多種活性。其中抗腫瘤為其主要藥理活性,且存在多種抗腫瘤機制,對多種腫瘤細胞表現(xiàn)出較好的抑制作用,千金藤素(Cepharanthine,

4、CEP)是一種天然的植物生物堿,主要來自中藥千金藤屬植物千金藤,既往的研究表明其具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用,最近的一些研究表明千金藤素具有潛在的抗腫瘤作用。但是在抗非小細胞肺癌及抗食管癌方面,沒有研究報道過木香烴內(nèi)酯和千金藤素的作用。所以本實驗擬研究木香烴內(nèi)酯對非小細胞肺癌、食管癌的作用效果,千金藤素對非小細胞肺癌的作用,以及其具體的機制。前期的細胞抑制實驗中,我們發(fā)現(xiàn)木香姓:內(nèi)酯對人肺鱗癌SK-MES-1細胞、人肺腺癌A549細胞、人非小細胞肺癌H1299細胞以及人食管鱗癌Eca-109細胞顯著的抑制作用，千金藤素則是對3種NSCL©田胞增殖抑制明顯。為探究其具體的作用機制,我們進行

5、了以下研究。實驗一,我們主要應(yīng)用人肺鱗癌SK-MES-1細胞作為實驗對象來研究木香姓:內(nèi)酯的抗癌機制。木香姓:內(nèi)酯可誘導(dǎo)SK-MES-1細胞發(fā)生形態(tài)結(jié)構(gòu)上的改變,同時生長增殖也受到抑制。流式細胞分析證明經(jīng)木香姓:內(nèi)酯處理的SK-MES-1細胞發(fā)生了細胞凋亡，并且細胞周期被阻滯在G1/S期。通過westernblot（蛋白免疫印跡）進行蛋白分析,p53、Bax、p21的表達量上調(diào),Bcl-2下調(diào),caspase-3被激活,其下游的PARP（PolyADP-RibosePolymerase,天冬氨酸蛋白水解酶）分裂。另外實驗發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位（MitochondrialMembranePotenti

6、al,MMP）發(fā)生了明顯的下降,這些結(jié)論清晰的證明了線粒體介導(dǎo)的Caspase活化途徑存在于木香爛內(nèi)酯誘導(dǎo)SK細胞凋亡的機制中。這些發(fā)現(xiàn)提示我們木香烴內(nèi)酯在未來有望成為抗肺癌治療的新型化合物。實驗二，我們應(yīng)用人非小細胞肺癌A549,H1299細胞作為實驗對象來探究小分子藥物千金藤素的抗肺癌機制。實驗發(fā)現(xiàn)千金藤素可以通過濃度依賴的方式抑制A549,H1299細胞的生長,且通過流式的檢測,經(jīng)處理的這兩種細胞發(fā)生了細胞凋亡,上述的現(xiàn)象均可被活性氧（ROS刖制劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）所拮抗，這表明木香爛內(nèi)酯導(dǎo)致的非小細胞凋亡是由ROS0T介導(dǎo)的。另外，通過流式細胞

7、術(shù)檢測細胞周期的實驗顯示，千金藤素阻滯H1299細胞周期在S期；阻滯A549細胞周期在G2/M期，表明千金藤素同時可以作用于細胞周期的調(diào)定點。通過westernblot分析相關(guān)蛋白的水平變化,結(jié)果顯示,促凋亡蛋白Bax蛋白上調(diào)、抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)，同時caspase-3活化，伴隨著下游PAR嚓解。這些證據(jù)表明千金藤素激活了線粒體通路,導(dǎo)致了凋亡的發(fā)生。這些研究結(jié)果證實千金藤素可能成為未來抗肺癌治療的一個潛在的化合物。實驗三,探究木香烴內(nèi)酯抗食管癌Eca-109細胞的作用機制。通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布,結(jié)果顯示木香烴內(nèi)酯阻滯Eca-109細胞周期在G1/G0期。同時通過流式細胞術(shù)還發(fā)現(xiàn)，木香爛內(nèi)酯可明顯誘導(dǎo)人食管鱗癌Eca-109細胞細胞凋亡水平明顯上升，同時可以顯著上升ROS勺水平、破壞線粒體膜電位。通過westernblot分析蛋白水平的變化,周期相關(guān)蛋白p53,p21表達上調(diào),Bcl-2家族中抗凋亡蛋白下調(diào),促凋亡蛋白上調(diào),同時caspase-3被激活,以及伴隨著下游的PARPH解。以上的現(xiàn)象均可以被NACff抑制。這些數(shù)據(jù)表明木香姓:內(nèi)酯抑制人食管鱗癌細胞生長增殖,與ROSK平以及p53介導(dǎo)的線粒體途