蛋白質(zhì)的功能

1、1.4 1.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1.5 1.5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)1.6 1.6 蛋白質(zhì)的分離、純化與測(cè)定蛋白質(zhì)的分離、純化與測(cè)定（一）（一） 一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系一、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 以以124個(gè)氨基酸殘基組成的牛胰核糖核酸酶?jìng)€(gè)氨基酸殘基組成的牛胰核糖核酸酶（4對(duì)二硫鍵）為例說(shuō)明對(duì)二硫鍵）為例說(shuō)明牛胰核糖核酸酶的變性與復(fù)性-巰基乙醇尿素或鹽酸胍透析有活性有活性無(wú)活性無(wú)活性1.一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)功能相似一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)功能相似一級(jí)結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)功能不同一級(jí)結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)功能不

2、同（二）一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（二）一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)及種屬差異胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)及種屬差異ACTH 促腎上腺素皮質(zhì)激素MSH 促黑激素一級(jí)結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)功能不同一級(jí)結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)功能不同HbS與HbA的區(qū)別-亞基第6位氨基酸正常人：Glu患者：Val例2由4個(gè)亞基組成血紅蛋白功能:運(yùn)輸O2二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 （一）肌紅蛋白（一）肌紅蛋白（MbMb）與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能：）與血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能：蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定生物學(xué)功能蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定生物學(xué)功能肌紅蛋白（肌紅蛋白（1個(gè)亞基）與血紅蛋白（個(gè)亞基）與血紅蛋白（4個(gè)亞基）且一級(jí)結(jié)構(gòu)有較個(gè)亞基）且一級(jí)結(jié)構(gòu)有

3、較大差異，但均具有與氧可逆地結(jié)合的能力。大差異，但均具有與氧可逆地結(jié)合的能力。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是，都與血紅素（輔基）共價(jià)結(jié)合其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是，都與血紅素（輔基）共價(jià)結(jié)合肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)O2（二）血紅蛋白構(gòu)象變化與結(jié)合氧的能力（二）血紅蛋白構(gòu)象變化與結(jié)合氧的能力O2上述上述HbHb與與O O2 2結(jié)合后，結(jié)合后，HbHb的構(gòu)象發(fā)生變化，這類(lèi)變化稱(chēng)的構(gòu)象發(fā)生變化，這類(lèi)變化稱(chēng)為為變構(gòu)效應(yīng)，變構(gòu)效應(yīng)，即通過(guò)構(gòu)象變化影響蛋白質(zhì)的功能。像血即通過(guò)構(gòu)象變化影響蛋白質(zhì)的功能。像血紅蛋白這種具有變構(gòu)效應(yīng)的蛋白質(zhì)稱(chēng)為紅蛋白這種具有變構(gòu)效應(yīng)的蛋白質(zhì)稱(chēng)為變構(gòu)蛋白變構(gòu)蛋白（allosteric proteinallo

4、steric protein）。血紅蛋白的這種變構(gòu)效應(yīng)）。血紅蛋白的這種變構(gòu)效應(yīng)能能更有效地行使其運(yùn)氧的生物學(xué)功能。更有效地行使其運(yùn)氧的生物學(xué)功能。血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)使其有利于氧的運(yùn)輸血紅蛋白的變構(gòu)效應(yīng)使其有利于氧的運(yùn)輸血紅蛋白的亞基與肌紅蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中的保守氨基酸殘基血紅蛋白的亞基與肌紅蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中的保守氨基酸殘基 由于血紅蛋白亞基之間存在大量離子鍵，使其構(gòu)象由于血紅蛋白亞基之間存在大量離子鍵，使其構(gòu)象呈呈緊張態(tài)緊張態(tài)，對(duì)氧的親和力很低，第一個(gè)亞基與，對(duì)氧的親和力很低，第一個(gè)亞基與O O2 2結(jié)合時(shí)，離結(jié)合時(shí)，離子鍵的破壞較難，所需要的能量較多。當(dāng)血紅蛋白的一個(gè)子鍵的破壞較難，所需要的能量

5、較多。當(dāng)血紅蛋白的一個(gè)亞基結(jié)合氧之后引起它的構(gòu)象亞基結(jié)合氧之后引起它的構(gòu)象從緊張態(tài)變成松弛態(tài)從緊張態(tài)變成松弛態(tài)，其它，其它的離子鍵也依次破壞，此時(shí)破壞離子鍵所需要的能量也少，的離子鍵也依次破壞，此時(shí)破壞離子鍵所需要的能量也少，構(gòu)象的變化導(dǎo)致血紅蛋白對(duì)氧的親和力大大增強(qiáng)，因此第構(gòu)象的變化導(dǎo)致血紅蛋白對(duì)氧的親和力大大增強(qiáng)，因此第四個(gè)亞基結(jié)合氧的能力比第一個(gè)大幾百倍。四個(gè)亞基結(jié)合氧的能力比第一個(gè)大幾百倍。 ( (三三) ) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與分子病蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與分子病 現(xiàn)知幾乎所有遺傳病都與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)改變現(xiàn)知幾乎所有遺傳病都與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，都稱(chēng)之為有關(guān)，都稱(chēng)之為分子病分子病。例如鐮

6、刀型貧血癥，它是。例如鐮刀型貧血癥，它是由于血紅蛋白的由于血紅蛋白的-亞基上的亞基上的第六位氨基酸第六位氨基酸由由谷氨谷氨酸酸變成了變成了纈氨酸纈氨酸，導(dǎo)致血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的改，導(dǎo)致血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的改變，其運(yùn)輸氧氣的能力大大地降低，并且紅細(xì)胞呈變，其運(yùn)輸氧氣的能力大大地降低，并且紅細(xì)胞呈鐮刀狀。鐮刀狀。 瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。引起的一組人和動(dòng)物神經(jīng)退行性病變。正常的正常的PrP富含富含-螺旋，稱(chēng)為螺旋，稱(chēng)為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用

7、下可轉(zhuǎn)變成全在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為為-折疊的折疊的PrPsc，從而致病。，從而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折疊折疊正常正常瘋牛病瘋牛病 所以，蛋白質(zhì)一定的結(jié)構(gòu)執(zhí)行一定的功能。所以，蛋白質(zhì)一定的結(jié)構(gòu)執(zhí)行一定的功能。功能不同的蛋白質(zhì)總是有著不同的序列；比較功能不同的蛋白質(zhì)總是有著不同的序列；比較種屬來(lái)源不同而功能相同的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，種屬來(lái)源不同而功能相同的蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，可能有某些差異，但與功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)也總是可能有某些差異，但與功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)也總是相同。若一級(jí)結(jié)構(gòu)變化，蛋白質(zhì)的功能可能發(fā)相同。若一級(jí)結(jié)構(gòu)變化，蛋白質(zhì)的功能可能發(fā)生很大的變化。生很大的變化。 總之，各種蛋

8、白質(zhì)都有特定的空間構(gòu)總之，各種蛋白質(zhì)都有特定的空間構(gòu)象，而特定的空間構(gòu)象又與它們特定的生象，而特定的空間構(gòu)象又與它們特定的生物學(xué)功能相適應(yīng)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是物學(xué)功能相適應(yīng)，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是高度統(tǒng)一的。高度統(tǒng)一的。1.5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化一、蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn)1 1、蛋白質(zhì)的兩性電離蛋白質(zhì)與氨基酸相似，也具有蛋白質(zhì)與氨基酸相似，也具有兩性電離兩性電離的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側(cè)鏈上含有可解離的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側(cè)鏈上含有可解離的基團(tuán)，有的可以接受氫離子，有的可以電離出氫離子，的基團(tuán)，有的可以接受氫離子，有的可以電離出氫離子，因

9、此蛋白質(zhì)具有酸堿兩性電離的性質(zhì)。它的因此蛋白質(zhì)具有酸堿兩性電離的性質(zhì)。它的兩性電離比兩性電離比氨基酸復(fù)雜氨基酸復(fù)雜。 1.5 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化一、蛋白質(zhì)的兩性電離和等電點(diǎn) 對(duì)某一蛋白質(zhì)而言，在某一對(duì)某一蛋白質(zhì)而言，在某一pHpH下，當(dāng)它所帶正負(fù)電下，當(dāng)它所帶正負(fù)電荷相等的時(shí)候，該溶液的荷相等的時(shí)候，該溶液的pHpH就稱(chēng)為該就稱(chēng)為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的大小與蛋白質(zhì)的氨基酸組成有關(guān)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的大小與蛋白質(zhì)的氨基酸組成有關(guān)。 2、等電點(diǎn)蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在溶液中的帶電狀況主要取蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在溶液中的帶電狀況主要取決于溶液的決于溶液的pH值。值。P

10、rCOOHNH3+PrCOO-NH3+PrCOO-NH2+OH-+H+OH-+H+pH=pIpHpI二、蛋白質(zhì)的高分子性質(zhì) 蛋白質(zhì)溶液有許多高分子溶液的性質(zhì)，蛋白質(zhì)溶液有許多高分子溶液的性質(zhì)，如：如：擴(kuò)散慢、易沉降、擴(kuò)散慢、易沉降、 粘度大、不能透過(guò)半透膜，粘度大、不能透過(guò)半透膜，在水溶液中可形成親水的膠體。在水溶液中可形成親水的膠體。 蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定因素：水化膜、帶水化膜、帶電荷。當(dāng)破壞這兩個(gè)因素時(shí)，蛋白質(zhì)中從溶液電荷。當(dāng)破壞這兩個(gè)因素時(shí)，蛋白質(zhì)中從溶液中析出而產(chǎn)生沉淀。中析出而產(chǎn)生沉淀。蛋白質(zhì)分子顆粒大小1100nm之間,屬膠體顆粒范圍，蛋白質(zhì)的膠體原因：表

11、面形成水化層表面同種電荷的斥力蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體三、蛋白質(zhì)的沉淀作用 當(dāng)破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋當(dāng)破壞了維持蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素甚至蛋白質(zhì)的構(gòu)象時(shí)，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中析出，這白質(zhì)的構(gòu)象時(shí)，蛋白質(zhì)就會(huì)從溶液中析出，這種現(xiàn)象稱(chēng)為種現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)的沉淀。1. 鹽析：鹽析：在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強(qiáng)在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)從電解質(zhì)鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)從溶液中析出，稱(chēng)為溶液中析出，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的鹽析蛋白質(zhì)的鹽析。而低濃度的鹽溶液。而低

12、濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該現(xiàn)象稱(chēng)為現(xiàn)象稱(chēng)為鹽溶鹽溶。 蛋白質(zhì)沉淀的方法蛋白質(zhì)沉淀的方法鹽析的機(jī)理：鹽析的機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電破壞蛋白質(zhì)的水化膜，中和表面的凈電荷。荷。 鹽析法是最常用的鹽析法是最常用的蛋白質(zhì)沉淀方法蛋白質(zhì)沉淀方法，該方法不會(huì)使，該方法不會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。2.2.有機(jī)溶劑沉淀法：有機(jī)溶劑沉淀法：在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與在蛋白質(zhì)溶液中，加入能與水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生水互溶的有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮等，蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。沉淀。 有機(jī)溶劑沉淀法的有機(jī)溶劑沉淀

13、法的機(jī)理機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。：破壞蛋白質(zhì)的水化膜。又能降低溶液的介電常數(shù)使蛋白質(zhì)表面電荷減少，又能降低溶液的介電常數(shù)使蛋白質(zhì)表面電荷減少，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀。導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀。 有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在有機(jī)溶液沉淀蛋白質(zhì)通常在低溫低溫條件下進(jìn)行，條件下進(jìn)行，否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)否則有機(jī)溶劑與水互溶產(chǎn)生的溶解熱會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性。產(chǎn)生變性。3.3.重金屬鹽沉淀重金屬鹽沉淀（條件：（條件：pH pH 稍大于稍大于pIpI為宜）：在為宜）：在蛋白質(zhì)溶液中加入重金屬鹽溶液，會(huì)使蛋白質(zhì)沉淀。蛋白質(zhì)溶液中加入重金屬鹽溶液，會(huì)使蛋白質(zhì)沉淀。 重金屬沉淀法的重金屬沉淀

14、法的機(jī)理機(jī)理：重金屬鹽加入之后，與：重金屬鹽加入之后，與帶負(fù)電的羧基結(jié)合帶負(fù)電的羧基結(jié)合，生成不溶性的重金屬蛋白鹽而生成不溶性的重金屬蛋白鹽而沉淀。沉淀。 重金屬沉淀蛋白質(zhì)會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生重金屬沉淀蛋白質(zhì)會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生變性變性，長(zhǎng)期從長(zhǎng)期從事重金屬作業(yè)的人應(yīng)多吃高蛋白食品，事重金屬作業(yè)的人應(yīng)多吃高蛋白食品，以防止重金以防止重金屬離子被機(jī)體吸收后造成對(duì)機(jī)體的損害。屬離子被機(jī)體吸收后造成對(duì)機(jī)體的損害。4.4.生物堿試劑沉淀法生物堿試劑沉淀法（條件：（條件：pHpH稍小于稍小于pIpI）生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類(lèi)含生物堿是植物組織中具有顯著生理作用的一類(lèi)含氮的堿性物質(zhì)。能夠沉淀生物堿的試

15、劑稱(chēng)為氮的堿性物質(zhì)。能夠沉淀生物堿的試劑稱(chēng)為生物堿生物堿試劑試劑。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、。生物堿試劑一般為弱酸性物質(zhì)，如單寧酸、苦味酸、三氯乙酸等。苦味酸、三氯乙酸等。生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的生物堿試劑沉淀蛋白質(zhì)的機(jī)理機(jī)理：在酸性條件下，：在酸性條件下，蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合蛋白質(zhì)帶正電，可以與生物堿試劑的酸根離子結(jié)合而產(chǎn)生沉淀。而產(chǎn)生沉淀。 “柿石癥柿石癥”的產(chǎn)生的產(chǎn)生就是由于空腹吃了大量的柿子，就是由于空腹吃了大量的柿子，柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)凝固柿子中含有大量的單寧酸，使腸胃中的蛋白質(zhì)凝固變性而成為不能被消化的變性而成為不能被消化的“

16、柿石柿石”。5.5.弱酸或弱堿沉淀法弱酸或弱堿沉淀法：用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液：用弱酸或弱堿調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的的pHpH處于等電點(diǎn)處，使蛋白質(zhì)沉淀。處于等電點(diǎn)處，使蛋白質(zhì)沉淀。 弱酸或弱堿沉淀法弱酸或弱堿沉淀法機(jī)理機(jī)理：破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷。：破壞蛋白質(zhì)表面凈電荷。 四、蛋白質(zhì)的變性作用1.1.蛋白質(zhì)變性的概念：蛋白質(zhì)變性的概念：天然蛋白質(zhì)受物理或化天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響后，使其失去原有的生物活性，學(xué)因素的影響后，使其失去原有的生物活性，并伴隨著物理化學(xué)性質(zhì)的改變，這種作用稱(chēng)為并伴隨著物理化學(xué)性質(zhì)的改變，這種作用稱(chēng)為蛋白質(zhì)的變性。蛋白質(zhì)的變性。2.2.使蛋白質(zhì)變性的因素使蛋白質(zhì)變性的

17、因素1 1）物理因素：高溫、高壓、射線(xiàn)等）物理因素：高溫、高壓、射線(xiàn)等 2 2）化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽等）化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽等 四、蛋白質(zhì)的變性作用3.3.變性的本質(zhì)：變性的本質(zhì)： 分子中各種分子中各種次級(jí)鍵斷裂、二硫鍵破會(huì)次級(jí)鍵斷裂、二硫鍵破會(huì)，使其空，使其空間構(gòu)象從緊密有序的間構(gòu)象從緊密有序的 狀態(tài)變成松散無(wú)序的狀態(tài)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不破壞。狀態(tài)變成松散無(wú)序的狀態(tài)，一級(jí)結(jié)構(gòu)不破壞。4.4.蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)：蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)：1 1）生物學(xué)活性消失）生物學(xué)活性消失2 2）理化性質(zhì)改變：溶解度下降，粘度增加，紫外）理化性質(zhì)改變：溶解度下降，粘度增加，紫外吸收增加，側(cè)鏈反應(yīng)增強(qiáng)，

18、對(duì)酶的作用敏感，易吸收增加，側(cè)鏈反應(yīng)增強(qiáng)，對(duì)酶的作用敏感，易被水解。被水解。 五、蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)主要與其定性、定量測(cè)定有關(guān)：蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)主要與其定性、定量測(cè)定有關(guān)： 1.1.茚三酮反應(yīng)：茚三酮反應(yīng)：多肽與蛋白質(zhì)都能與之反應(yīng)生成多肽與蛋白質(zhì)都能與之反應(yīng)生成藍(lán)色化合物。藍(lán)色化合物。2.2.雙縮脲反應(yīng)：雙縮脲反應(yīng)：多肽與蛋白質(zhì)都能和雙縮脲試劑多肽與蛋白質(zhì)都能和雙縮脲試劑反應(yīng)，隨著肽鍵的數(shù)目越多，顏色依次為粉紅、紫反應(yīng)，隨著肽鍵的數(shù)目越多，顏色依次為粉紅、紫紅、紫、藍(lán)。紅、紫、藍(lán)。3.3.酚試劑反應(yīng)：酚試劑反應(yīng)：多肽與蛋白質(zhì)與酚試劑生成藍(lán)色多肽與蛋白質(zhì)與酚試劑生成藍(lán)色的化合物。

19、另外，前面提到的氨基酸顏色反應(yīng)蛋白的化合物。另外，前面提到的氨基酸顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)都具有。質(zhì)都具有。 六、蛋白質(zhì)的紫外吸收特征 蛋白質(zhì)溶液能在近紫外區(qū)（蛋白質(zhì)溶液能在近紫外區(qū)（280nm280nm處）有光吸收，處）有光吸收，主要是由帶芳香環(huán)的氨基酸決定的。其對(duì)紫外光主要是由帶芳香環(huán)的氨基酸決定的。其對(duì)紫外光吸收能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋何漳芰Φ膹?qiáng)弱順序?yàn)椋?色（色（TrpTrp） 酪（酪（TyrTyr） 苯丙（苯丙（PhePhe）。）。 1.6 蛋白質(zhì)的分離純化與測(cè)定一、分離純化蛋白質(zhì)的意義 研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能：要求純度高，不要求純度高，不變性；變性； 提取活性的酶或蛋白質(zhì)

20、：提取活性的酶或蛋白質(zhì)：必須保持天然活性必須保持天然活性狀態(tài)；狀態(tài)； 作為藥物或食品添加劑：作為藥物或食品添加劑：純度要求一般。純度要求一般。 1.6 蛋白質(zhì)的分離純化與測(cè)定二、蛋白質(zhì)分離純化的一般步驟 材料的選擇材料的選擇原料的預(yù)處理原料的預(yù)處理蛋白質(zhì)的抽提蛋白質(zhì)的抽提從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)純化純化蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)的結(jié)晶結(jié)晶1.1.原料的選擇：原料的選擇：要求含待分離的蛋白質(zhì)豐富，廉價(jià)，易要求含待分離的蛋白質(zhì)豐富，廉價(jià)，易得，容易收集，新鮮無(wú)腐敗。得，容易收集，新鮮無(wú)腐敗。2.2.原料的預(yù)處理：原料的預(yù)處理：如果待分離蛋白質(zhì)為胞外蛋白質(zhì)，材如果待分離蛋白質(zhì)為胞外蛋白質(zhì)，材料破

21、碎后，用適當(dāng)?shù)娜軇┲苯映樘?；若待分離蛋白質(zhì)為料破碎后，用適當(dāng)?shù)娜軇┲苯映樘?；若待分離蛋白質(zhì)為胞內(nèi)蛋白質(zhì)，則需要破碎細(xì)胞膜，再用適當(dāng)?shù)娜軇┏樘?。胞?nèi)蛋白質(zhì)，則需要破碎細(xì)胞膜，再用適當(dāng)?shù)娜軇┏樘帷?.3.從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)：從抽提液中沉淀蛋白質(zhì)：常用鹽析法、低溫乙醇沉淀常用鹽析法、低溫乙醇沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法。法、等電點(diǎn)沉淀法。4. 4. 純化：純化：將沉淀的蛋白質(zhì)溶解，再選擇適當(dāng)?shù)膶⒊恋淼牡鞍踪|(zhì)溶解，再選擇適當(dāng)?shù)募兓椒ǎ玫郊兌缺容^高的蛋白質(zhì)溶液。純化方法，得到純度比較高的蛋白質(zhì)溶液。純化方法：透析或超濾、電泳法、凝膠過(guò)濾法、純化方法：透析或超濾、電泳法、凝膠過(guò)濾法、離子交換層析、吸附層析法

22、、超速離心法等。離子交換層析、吸附層析法、超速離心法等。5. 5. 蛋白質(zhì)的結(jié)晶：蛋白質(zhì)的結(jié)晶：從溶液中重新沉淀蛋白質(zhì)。從溶液中重新沉淀蛋白質(zhì)。幾種常見(jiàn)的純化蛋白質(zhì)的方法如下圖所示：幾種常見(jiàn)的純化蛋白質(zhì)的方法如下圖所示：三、 蛋白質(zhì)的分離純化的方法(一) 鹽析和有機(jī)溶劑沉淀(二) 電泳(三) 透析和超濾(四) 層析(五) 超速離心分類(lèi)：分類(lèi)： 根據(jù)支持物的不同，電泳電泳可分為： 薄膜電泳、凝膠電泳。（二）電（二）電 泳泳概念：概念： 帶電顆粒在電場(chǎng)中向著所帶電荷相反 方向 移動(dòng)稱(chēng)為電泳。原理：原理： 不同的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、形狀和帶電 量的 不同而有不同的泳動(dòng)速度，從而 達(dá)到分析和分離蛋白質(zhì)的目的

23、。 應(yīng)用：應(yīng)用：電泳技術(shù)是生化常用分析技術(shù)之一利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜質(zhì)通過(guò)利用壓力或離心力強(qiáng)行使水和小分子雜質(zhì)通過(guò)超濾膜超濾膜(一種半透膜一種半透膜)除去，而蛋白質(zhì)留在膜上除去，而蛋白質(zhì)留在膜上，稱(chēng)為，稱(chēng)為超過(guò)濾。超過(guò)濾。將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜的袋內(nèi)，置于流動(dòng)將蛋白質(zhì)溶液放在半透膜的袋內(nèi)，置于流動(dòng)的適當(dāng)?shù)木彌_液（如純水）中，小分子雜質(zhì)的適當(dāng)?shù)木彌_液（如純水）中，小分子雜質(zhì)（如硫酸銨、氧化鈉等）從袋中透出，而蛋（如硫酸銨、氧化鈉等）從袋中透出，而蛋白質(zhì)保留于袋中從而將蛋白質(zhì)純化，這種方白質(zhì)保留于袋中從而將蛋白質(zhì)純化，這種方法稱(chēng)為法稱(chēng)為透析。透析。（三）透析（三）透析透析工作圖透析工作

24、圖半透膜原理半透膜原理 層析種類(lèi)：層析種類(lèi)：凝膠過(guò)濾（分子篩）凝膠過(guò)濾（分子篩）離子交換層析（陰離子和陽(yáng)離子）離子交換層析（陰離子和陽(yáng)離子）親和層析親和層析(四四) 層析層析帶正電荷多帶正電荷多蛋白緊密結(jié)合蛋白緊密結(jié)合帶負(fù)電荷多帶負(fù)電荷多蛋白流過(guò)層析蛋白流過(guò)層析柱柱陽(yáng)離子交換樹(shù)脂工作示意圖陽(yáng)離子交換樹(shù)脂工作示意圖分子篩層析分子篩層析親和層析工作示意圖親和層析工作示意圖蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)載體介質(zhì)載體介質(zhì)配體配體結(jié)合結(jié)合洗脫洗脫洗脫介質(zhì)洗脫介質(zhì)（五）（五） 超速離心超速離心離離心心機(jī)機(jī)結(jié)結(jié)構(gòu)構(gòu)示示意意圖圖轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)頭腔沉降樣品驅(qū)動(dòng)馬達(dá)真空冷凍沉降系數(shù)沉降系數(shù)（sedimentation coefficien

25、t） 生物大分子在單位離心力場(chǎng)作用下的沉降速度稱(chēng)為沉降系數(shù)。即沉降系數(shù)是微顆粒在離心力場(chǎng)的作用下，從靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所需要的時(shí)間。數(shù)學(xué)定義式為： 沉降系數(shù)單位：由于蛋白質(zhì)、核酸、病毒等的沉降系數(shù)介于110-13到20010-13秒的范圍，為方便起見(jiàn)，把作為沉降系數(shù)的一個(gè)單位，用Svedberg單位，用即S表示。沉降系數(shù)（s）與相對(duì)分子量（Mr）的關(guān)系:Mr =RTsD(1-)Svedberg方程:d /dt2 s =四、多肽鏈中氨基酸的順序分析第一步：第一步： 分離提純蛋白質(zhì)分離提純蛋白質(zhì) ，測(cè)定，測(cè)定NH2末端的數(shù)目，確定蛋白質(zhì)末端的數(shù)目，確定蛋白質(zhì)分子是分子是 由幾條肽鏈構(gòu)成的，并分離

26、出由幾條肽鏈構(gòu)成的，并分離出 每條肽鏈。測(cè)定肽鏈的分每條肽鏈。測(cè)定肽鏈的分子量子量,計(jì)算組成該肽鏈的氨基酸殘基數(shù)。計(jì)算組成該肽鏈的氨基酸殘基數(shù)。及每種及每種aa的百分組成。的百分組成。肽鏈分子中氨基酸殘基數(shù)肽鏈分子中氨基酸殘基數(shù)=肽鏈的分子量肽鏈的分子量120 （各種的氨基酸殘基的平均分子量為（各種的氨基酸殘基的平均分子量為120）再將肽鏈徹底水解，用離子交換層析法將各種的氨基酸分離。再將肽鏈徹底水解，用離子交換層析法將各種的氨基酸分離。丹磺酰氯是一種強(qiáng)熒光劑，它能專(zhuān)一地與鏈N-端-氨基反應(yīng)生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很強(qiáng)的熒光，可直接用電泳法或?qū)游龇ㄨb定出N-端是何種氨基

27、酸。第二步第二步 測(cè)定肽鏈的氨基末端和羧基末端測(cè)定肽鏈的氨基末端和羧基末端1. N末端的測(cè)定末端的測(cè)定b. 二硝基苯氟法二硝基苯氟法 ：過(guò)時(shí)，不用過(guò)時(shí)，不用a. 丹磺酰氯法丹磺酰氯法 2. C末端的測(cè)定末端的測(cè)定常用羧基肽酶法常用羧基肽酶法 羧基肽酶專(zhuān)一地將肽鏈水解成片斷，分別進(jìn)行羧基肽酶專(zhuān)一地將肽鏈水解成片斷，分別進(jìn)行順序分析。順序分析。第三步第三步 肽鏈的局部水解肽鏈的局部水解胰蛋白酶的作用原理胰蛋白酶的作用原理1. 酶解法酶解法CNBr與與Met反應(yīng)測(cè)定反應(yīng)測(cè)定Pr的一級(jí)結(jié)構(gòu)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 2. 化學(xué)法化學(xué)法層析鑒定就可層析鑒定就可N-端開(kāi)始確定被測(cè)肽段的氨基酸排列順序端開(kāi)始確定被測(cè)肽段的氨

28、基酸排列順序第四步第四步 肽段氨基酸順序分析肽段氨基酸順序分析一般采用一般采用 Edman降解法降解法弱堿條件異硫氰酸苯酯異硫氰酸苯酯+N端端-氨基氨基苯氨基硫甲酰肽苯氨基硫甲酰肽(PTC-肽）肽）酸性條件環(huán)化水解苯乙內(nèi)酰硫氨基酸(PTH-aa)失去原N-端氨基酸的肽剩下的肽可反復(fù)進(jìn)行上述處理，依次生成各種剩下的肽可反復(fù)進(jìn)行上述處理，依次生成各種PTH-aa，Edman降解法的示意圖 一般常用多種方法使肽鏈斷裂，并分析出各一般常用多種方法使肽鏈斷裂，并分析出各肽段中的氨基酸順序。由于在不同部位斷鏈，只要肽段中的氨基酸順序。由于在不同部位斷鏈，只要找出多套肽段的重疊部位，然后組合排列對(duì)比，即找出多套肽段的重疊部位，然后組合排列對(duì)比，即可推斷肽段的排列順序，從而得出完整肽鏈中氨基可推斷肽段的排列順序，從而得出完整肽鏈中氨基酸的順序。酸的順序。第五步第五步 肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)的確定肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)的確定則其氨基