最新整理慢病毒包裝、濃縮、純化、滴度實(shí)驗(yàn)步驟教學(xué)文案

1、此文檔收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除一、包裝細(xì)胞293T 細(xì)胞的培養(yǎng)1、 293T 細(xì)胞的凍存1. 隨著傳代的次數(shù)增加， 293T 細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等。所以要在細(xì)胞 購(gòu)進(jìn)時(shí)就進(jìn)行凍存。2. 在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行凍存，增加細(xì)胞復(fù)蘇成活率。3. 倒去細(xì)胞上清液，加入 D-Hank's 液洗去殘留的培養(yǎng)基。4. 加入 0.25% 的胰酶，消化 10-20s 后倒去。5. 鏡下觀察細(xì)胞變圓，細(xì)胞間間隙加大時(shí)，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻。6. 細(xì)胞計(jì)數(shù)。7. 將細(xì)胞離心， 1000rpm ， 2min 。8. 根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果加入細(xì)胞凍存液（70% 完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%

2、 DMSO ） 重懸細(xì)胞，密度為3X106個(gè)/ml。10. 第二天將細(xì)胞放入液氮灌，并記錄。2、 293T 細(xì)胞的傳代1. 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合率達(dá)到 8090% 需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代操作，以擴(kuò)大細(xì)胞數(shù)量，維 持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。2. 消化細(xì)胞，方法同上。3. 細(xì)胞離心結(jié)束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。密度為 3X105個(gè)/ml。4. 分到 10cm 培養(yǎng)皿中， 10ml/ 皿。3、 293T 細(xì)胞的復(fù)蘇1. 當(dāng)細(xì)胞傳代次數(shù)過(guò)多（超過(guò)50 代），細(xì)胞狀態(tài)變差時(shí)或細(xì)胞出現(xiàn)污染事故時(shí)，需要丟棄并對(duì)開始凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇。2. 打開水浴鍋，設(shè)置溫度為 40 。3. 查看細(xì)胞庫(kù)記錄， 根據(jù)記錄從液氮灌中取出凍存

3、的細(xì)胞 （需戴上棉手套， 防止被凍傷） ， 迅速丟入水浴鍋中并快速晃動(dòng)，在12 min 內(nèi)使細(xì)胞溶液完全溶解。4. 將 1ml 細(xì)胞溶液加入 9 ml 完全培養(yǎng)基中并混勻后轉(zhuǎn)入 10cm 培養(yǎng)皿。5. 放回 37 、 3%CO 2 和 95% 相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6. 第二天觀察細(xì)胞存活率。倒掉舊的培養(yǎng)基，加入 10ml 新鮮培養(yǎng)基。二、慢病毒的包裝、濃縮和滴度測(cè)定1. 所用病毒檢測(cè)引物為 WPRE 特異引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCE-3' (forward primer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3' (

4、reverse primer) and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3' (probe)2. TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems 4304437)3. TaqMan DNA Template Reagent Kit (Applied Biosystems 401970)4. TaqMan RNaseP control reagent (Applied Biosystemscat. no.cat. no.cat. no. 4316844)SunBio IV VictorP

5、ackaging Cellin Mh j 1 弓 luction用于包裝的293T細(xì)胞的培養(yǎng)用于包裝的293T細(xì)胞(ATCC No. CRL-11268)必需選擇處于生長(zhǎng)旺盛期，細(xì)胞狀態(tài)較佳，存活率90%以上，細(xì)胞邊緣清晰，傳代次數(shù)較低。任何時(shí)候細(xì)胞匯合率都不準(zhǔn)達(dá) 到 100% 。慢病毒的包裝1 .預(yù)先準(zhǔn)備3個(gè)T150 瓶的293T 細(xì)胞，培養(yǎng)基為 DMEM + 10% FBS , 1% Glutamax , 1% 青霉素-鏈霉素。2 .將細(xì)胞分到12分到12個(gè)T150瓶中，每瓶的細(xì)胞密度是 8X10 6個(gè)。3 .第二天，鏡下檢查細(xì)胞。細(xì)胞融合度應(yīng)大致為30-40% ,分布均勻。4 .轉(zhuǎn)染前1

6、小時(shí)，取出細(xì)胞板，去除原有細(xì)胞培養(yǎng)基，加入 20ml的Opti-MEM 培養(yǎng) 基，將細(xì)胞送回培養(yǎng)箱。5 .取兩支無(wú)菌的 50ml離心管，其中一支中加入 252 g pNLEGFP/CMV/WPREDU3 載體質(zhì)粒，168 pg pCD/NL -BH*DDD包裝質(zhì)粒和 84 pg pLTR-G 質(zhì)粒，用 Opti-MEM培養(yǎng)基補(bǔ)齊到 18ml 。另一支中加入 500 口 Trans -EZ溶液和17.5 ml Opti-MEM 培 養(yǎng)基，用電動(dòng)移液器輕輕混勻。將Trans-EZ 稀釋液滴加到質(zhì)粒管中，邊加邊輕輕晃勻。關(guān)鍵步驟：推薦使用 Qiagen質(zhì)粒大抽試劑盒或相當(dāng)?shù)脑噭┖兴苽涞馁|(zhì)粒。6 .

7、室溫孵育20分鐘，使DNA和Trans-EZ 充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體。7 .取1支5ml的移液管，將得到的 DNA-Trans-EZ 復(fù)合體均勻滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)板 中，每板3ml。來(lái)回晃動(dòng)培養(yǎng)板，混勻后放回到 5%二氧化碳培養(yǎng)箱。每一皿細(xì)胞培養(yǎng) 盤不要超過(guò)6盤。8 . 6小時(shí)后，移去細(xì)胞上清，更換為 17ml的DMEM完全培養(yǎng)基。9 .轉(zhuǎn)染后一天觀察細(xì)胞，所有的細(xì)胞應(yīng)當(dāng)都是健康的并且密度接近60-80% 。如果所轉(zhuǎn)染質(zhì)粒帶有 GFP熒光，那么這時(shí)候可以看到大于95%的細(xì)胞都是帶有熒光的。10 .將細(xì)胞送回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2天（36-48小時(shí)）。在這個(gè)過(guò)程中，細(xì)胞會(huì)逐漸融合形成多核體，大多數(shù)的細(xì)胞

8、依然貼壁。11 .收集所有的上清，分裝到 50ml離心管中。12 .4 C, 500g離心10分鐘，除去脫落的細(xì)胞和大的細(xì)胞碎片。13.總的上清約為204 ml ,用250- ml 0.45 科m PVDF濾裝置過(guò)濾。如果發(fā)現(xiàn)濾膜 被堵住，表現(xiàn)為過(guò)濾速度變慢，更換新的濾器。精品文檔慢病毒的濃縮與純化方法一超速離心沉淀法1.取 6 個(gè) Ultra-clear SW28 外燈繼續(xù)消毒30分鐘。離心管，用70%乙醇消毒后，放在超凈工作臺(tái)中打開紫此文檔收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除2. 每個(gè) Ultra-clear SW28 離心管中加入約 32ml 的預(yù)先處理的病毒上清液。3. 取一支 10m

9、l 的移液管，吸取12 ml 20% 的蔗糖溶液。將移液管一直插入到離心管的底部，緩慢將蔗糖溶液打出 4 ml 。同樣地，將剩下8 ml 的蔗糖溶液分別加入到另兩個(gè)離心管中。另取一支干凈的移液管，對(duì)剩下 3 管進(jìn)行同樣處理。4. 用 PBS 調(diào)整各管的重量，使對(duì)應(yīng)的離心管之間的重量相差不超過(guò)0.1g 。5. 按次序?qū)⑺? 個(gè)離心管放入 Beckman SW28 超速離心轉(zhuǎn)頭中。7. 小心將管子從轉(zhuǎn)頭中取出。倒掉上清，將離心管倒扣在紙巾上放置10 分鐘使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底應(yīng)當(dāng)有可見(jiàn)的沉淀。8. 每管中加入 100ml 不含鈣和鎂的 PBS 洗下沉淀。9. 將 SW28 超速

10、離心管插入到 50ml 錐底離心管中，蓋上蓋子。10. 在 4溶解 2 小時(shí)，每隔 20 分鐘輕輕震蕩。11. 4 ， 500g 離心 1 分鐘，使溶液集中于管底。12 .用200科l移液器輕柔吹打使沉淀重懸。避免產(chǎn)生泡沫。將所有管中的液體集中到一個(gè) SW28 離心管中。13 .集中后的病毒懸液分裝成50科l每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲(chǔ)存在-80 。方法二 PEG-8000 濃縮法PEG （聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高親水性，在溶液中會(huì)吸收大量水分，減少病毒之間的距離，使病毒與病毒能夠很容易的聚合在一起，病毒的相對(duì)濃度提高，達(dá)到沉淀濃縮的目的。5X PEG8000+NaCl 配制

11、 稱取 NaCl 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在 200ml Milli-Q純水中； 121 攝氏度 30min 濕熱滅絕 30min ；保存在 4 。1 .使用0.45濾頭過(guò)濾慢病毒上清液；3. 每2030min 混合一次，共進(jìn)行 3-5次；4. 4 度放置過(guò)夜；5. 4 度， 4000 g ，離心 20min ；6. 吸棄上清，靜置管子12分鐘，吸走殘余液體；7. 加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8.集中后的病毒懸液分裝成50科每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲(chǔ)存在-80 病毒滴度的測(cè)定稀釋計(jì)數(shù)法滴度單位： TU/ml ，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)

12、。 ” TU”為” transducing units ” 的縮寫， 中文為 “轉(zhuǎn)導(dǎo)單位 ” ， 表示可以感染并進(jìn)入到靶細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)。第一天 細(xì)胞準(zhǔn)備將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至1X105/ml ,加入96孔板，100科l磯,為每個(gè)病毒準(zhǔn)備10 個(gè)孔。放入 37 ， 5%CO 2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天 加病毒在 EP 管中做 10 倍梯度稀釋，連續(xù)10 個(gè)稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準(zhǔn)備 10 個(gè)1.5ml EP 管，每管加入90培養(yǎng)液，往第一個(gè)管中加入10 “病毒原液，混勻后，吸取10 dl加入第二個(gè)管混勻。依此類推，做十個(gè)稀釋度（1010 -8）。吸取 96 孔板

13、中原有的培養(yǎng)基，加入含稀釋好的病毒液。并做好標(biāo)記。第三天追加培養(yǎng)液在每個(gè)孔再加入100 dl完全培養(yǎng)液，利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。第五天觀察結(jié)果并計(jì)算滴度在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并數(shù)出最后兩個(gè)有熒光的熒光細(xì)胞克隆數(shù)。假設(shè)為 X 和 Y ， 則滴度（TU/ml ） = （X+Y*10 ） *1000/2/X孔的病毒液的含量（科）。定量 PCR 法病毒感染1天前，取6孔板接種HOS細(xì)胞。每孔細(xì)胞為 5X104個(gè)。接種細(xì)胞 24 小時(shí)后，取兩個(gè)孔的細(xì)胞用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定感染時(shí)細(xì)胞的實(shí)際數(shù)目，記為 N 。棄去其他培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，更換為含有5g/ml polybrene 的新鮮培養(yǎng)基。將濃縮病毒用培養(yǎng)基稀釋

14、200倍，也就是取11病毒加入到199"的培養(yǎng)基中。在3個(gè)培養(yǎng)孔 中分別加入0.5 1, 5dl和50 dl的稀釋病毒。感染開始后20小時(shí)，除去培養(yǎng)上清，換為 500 "含DNaseI （Takara Mirus Bio ,終濃度為 10 U/ml） 的新鮮培養(yǎng)基。在 37 消化 15 分鐘，這一步是要除去殘余的質(zhì)粒DNA 。然后換為 2ml 正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 小時(shí)。精品文檔此文檔收集于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站刪除用0.5ml 0.25% 胰酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，在 37 c放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗下,DNA。每個(gè)樣品管中加入 200科1 )。基因組DNA可

15、以穩(wěn)定保存離心收集細(xì)胞。按照DNeasy試劑盒的說(shuō)明抽提基因組 洗脫液洗下 DNA 。用DNA定量試劑盒定量(Bio-Rad 在-20 C至少2個(gè)月。準(zhǔn)備PCR所需的試劑和樣品。為病毒序列檢測(cè)引物配總管I :2 x TaqMan Master Mix25 11 l x nForward primer (100 pmol ml-1)0.1 11 l x nReverse primer (100 pmol ml-1)0.1 11 l x nProbe (100 pmol ml-1)0.1 11 l x nH2O19.7 11 l x nn = number of reactions. 例如：總反應(yīng)

16、數(shù)為 40,將 1ml 2 x TaqMan UniversalPCR Master Mix , 4l forward primer , 4l reverse primer , 4l probe 和 788 科 lH2O混和。震蕩后放在冰上。為人基因組序列檢測(cè)引物配總管 n ：2 x TaqMan Master Mix25 11 lx n10 x RNaseP primer/probe mix2.511x nH2O17.5 11x nn = number of reactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為 40 ,將 1ml 2 x TaqMan UniversalPCR Master Mix , 1

17、00 l 10 x RNaseP primer/probe mix 和 700 科 l H2O 混和。震 蕩后放在冰上。在預(yù)冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管I中各取45科1加入到A-D各行 的孔中，從總管II中各取45 口加入到E-G各行的孔中。分別取5 口質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組DNA加入到A-D行中，每個(gè)樣品重復(fù) 1次。另留1個(gè)孔加入5(11的水做為無(wú)模板對(duì)照(no-template control )。分別取5 n基因組標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品基因組DNA加入到E-G行中，每個(gè)樣品重復(fù)1、次。另留1個(gè)孔加入5(11的水做為無(wú)模板對(duì)照(no-template control )。所

18、使用定量PCR儀為ABI PRISM 7000定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50 C 2分鐘，95 C 10分鐘，然后是95 C 15秒，60 C 1分鐘的40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：測(cè)得的 DNA 樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標(biāo)定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度( integration units per ml ， IU ml -1 )的計(jì)算公式如下：IU ml-1 = (CNX D X1000)/V其中： C = 平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)N =感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目(約為 1X105)D =病毒載體的稀釋倍數(shù)V =加入的稀釋病毒的體積數(shù)慢病毒的儲(chǔ)存與稀釋慢病毒的儲(chǔ)存1. 病毒的運(yùn)輸

19、采用干冰保溫，收到病毒液后若幾天內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)，可于4 保存(于一周內(nèi)用完)。2. 若病毒量較大，需長(zhǎng)期保存。則根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)用量分裝后放于-80 冰箱。一般病毒可以放于 -80 約 12 個(gè)月以上，但若超過(guò)6 個(gè)月后使用，請(qǐng)重新檢測(cè)病毒滴度。3. 避免反復(fù)凍融，否則會(huì)降低病毒滴度。每次凍融會(huì)降低病毒滴度10% 。慢病毒的稀釋需要稀釋病毒時(shí)，將病毒取出后置于冰上融解，用細(xì)胞培養(yǎng)用 D-Hank's 、 PBS 或培養(yǎng)基稀釋到所需濃度后混勻分裝后 4 保存，并盡快用于實(shí)驗(yàn)(于一周內(nèi)用完)。慢病毒在細(xì)胞水平的使用什么是 MOI ？"MOI為"multiplicity of i

20、nfection 的縮寫，中文為感染復(fù)數(shù)”或 復(fù)感染指數(shù)”，含義為感染時(shí)病毒和細(xì)胞數(shù)量的比值， 即平均每個(gè)細(xì)胞感染的病毒活性單位數(shù)( TU number/cell )。在實(shí)驗(yàn)中將某種細(xì)胞感染達(dá)到 80% 時(shí)的 MOI 定義為這種細(xì)胞的 MOI 。MOI 與整合事件以及目的基因的表達(dá)相關(guān)。一定范圍內(nèi)，表達(dá)水平和MOI 呈正相關(guān)。MOI 取決于多種因素， 如細(xì)胞狀態(tài)， 目的基因的大小與性質(zhì)， 細(xì)胞的感染效率等。 所以，實(shí)驗(yàn)前需查閱相關(guān)文獻(xiàn)，確定慢病毒對(duì)目的細(xì)胞的親嗜性、 MOI 以及在體( in vivo )注射所需病毒量。若無(wú)文獻(xiàn)支持，可以通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到合適的 MOI 。實(shí)際上，即使有文獻(xiàn)支持，

21、 但由于所用細(xì)胞代數(shù)、 細(xì)胞狀態(tài)以及目的基因的差異， 實(shí)際的 MOI 和文獻(xiàn)報(bào)道也會(huì)不同，所以要安排預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定所需MOI 以及病毒對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。目的細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)體系的放大實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定細(xì)胞感染所需的MOI ,以及是否需要添加感染增強(qiáng)劑Polybrene 。實(shí)驗(yàn)材料：96孔板，1.5ml EP管，長(zhǎng)勢(shì)良好的目的細(xì)胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液,Polybrene （10mg/ml ）,目的細(xì)胞培養(yǎng)基等。第一天：細(xì)胞準(zhǔn)備將長(zhǎng)勢(shì)良好的目的細(xì)胞接種到96板，消化好細(xì)胞（懸浮細(xì)胞不需要消化，直接離心收集細(xì)胞后加新鮮培養(yǎng)基重懸即可）后把濃度調(diào)為3X1045 X104個(gè)/ml ,按90 口/孔加

22、入。接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞的生長(zhǎng)速度而略有不同，一般是保證第二天進(jìn)行病毒感染時(shí)細(xì) 胞匯合率介于3050% 之間。第二天：病毒感染感染實(shí)驗(yàn)分兩組，一組直接添加病毒液，一組同時(shí)添加Polybrene 。病毒稀釋方法同病毒滴度測(cè)定時(shí)方法，10倍倍比稀釋，共三個(gè)稀釋度，MOI值依次為100 , 10和1 （細(xì)胞經(jīng)過(guò)一天的生長(zhǎng)數(shù)量約為1X104個(gè)/孔，對(duì)應(yīng)的病毒數(shù)量為1X10 6TU、1 X105TU和1X10 4TU）。每個(gè)MOI值加兩個(gè)孔，取出一組加入感染增強(qiáng)劑，比例為 1 : 2000 ,終 濃度為5g/ml。第二天：換液感染實(shí)驗(yàn)同一天，8-12小時(shí)后，棄去上清液，更換為新鮮培養(yǎng)基，100 d l/孔。