鹽酸羅格列酮對(duì)糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖及分泌NO的

1、鹽酸羅格列酮對(duì)糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖及分泌NO的影響    【摘要】  目的：探討鹽酸羅格列酮對(duì)糖基化終產(chǎn)物（AGEs）誘導(dǎo)新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞（CFs）增殖及分泌一氧化氮（NO）的影響。方法：采用胰酶消化法和差速貼壁分離法獲取CFs，應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）分別觀察不同濃度鹽酸羅格列酮對(duì)AGEs作用下CFs的細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響；硝酸還原酶法分別測(cè)定不同條件下CFs培養(yǎng)液中的NO水平。結(jié)果：AGEs對(duì)CFs的增殖有顯著的促進(jìn)作用；不同濃度的鹽酸羅格列酮干預(yù)后，與AGEs組對(duì)比A值均明顯下降（P<0.05）；S

2、期及G2/M期細(xì)胞百分值明顯低于AGEs組，而G0/G1 期的細(xì)胞百分值增高（P<0.05），且隨著濃度的增加，抑制細(xì)胞增殖作用越顯著。AGEs抑制CFs分泌NO，鹽酸羅格列酮可阻斷AGEs的上述作用，并呈一定的濃度依賴關(guān)系（P<0.01）。結(jié)論：在一定濃度范圍內(nèi)，鹽酸羅格列酮呈劑量依賴性地抑制AGEs誘導(dǎo)的大鼠CFs增殖，并阻斷AGEs抑制CFs分泌NO。 【關(guān)鍵詞】  鹽酸羅格列酮;糖基化終產(chǎn)物;心肌成纖維細(xì)胞;一氧化氮  糖基化終產(chǎn)物(advanced glycosylation end products，AGEs) 在體內(nèi)積聚是導(dǎo)致糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)

3、展的重要原因之一1。糖尿病心肌病變是糖尿病的主要并發(fā)癥之一。近年來(lái)已認(rèn)識(shí)到心肌成纖維細(xì)胞（CFs）和心肌間質(zhì)在心肌重構(gòu)中起著不可忽視的作用，研究發(fā)現(xiàn)，CFs具有分泌多種生物活性物質(zhì)的能力2。近來(lái)大量資料提示內(nèi)皮素、一氧化氮(nitricoxide，NO)等一些生物活性物質(zhì)與心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)3。噻唑烷二酮類(TZDs)降糖藥對(duì)AGEs誘導(dǎo)CFs增殖及分泌NO的影響未見(jiàn)報(bào)道。1  材料與方法1.1  材料 SD大鼠乳鼠由南京軍區(qū)總院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,胎牛血清(杭州四季青生物技術(shù)材料研究所)、DMEM干粉培養(yǎng)基(Gibco公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、四氮唑藍(lán)

4、(MTT，Gibco公司)均購(gòu)于南京創(chuàng)瑞生物技術(shù)有限公司，NO含量測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物公司，AGEs由東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管病研究所提供，鹽酸羅格列酮（維戈洛）由上海三維制藥公司惠贈(zèng)。1.2  CFs的分離、培養(yǎng)和鑒定無(wú)菌條件下取下新生14齡SD大鼠乳鼠(雌雄不限)心室，浸入D?Hanks液中剪碎，用0.06%胰蛋白酶于37水浴并在磁力攪拌器上(速率100 r?min-1)分次消化成單細(xì)胞懸液。此時(shí)細(xì)胞懸液的主要成分是搏動(dòng)的心肌細(xì)胞及CFs，利用CFs能更快更早貼壁的特點(diǎn)將兩種細(xì)胞分離。經(jīng)兩次差速貼壁后，首次先貼壁的為成纖維細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為0.1的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)

5、至融合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行傳代，第2代細(xì)胞按每毫升5×104個(gè)細(xì)胞數(shù)量均勻接種培養(yǎng)。使用倒置顯微鏡觀察兩種細(xì)胞的形態(tài)，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板和臺(tái)盼藍(lán)染色進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。經(jīng)倒置顯微鏡、透射電鏡確認(rèn)，SABC免疫組化染色示纖維粘連蛋白染色陽(yáng)性，血管平滑肌肌動(dòng)蛋白因子和結(jié)蛋白染色陰性，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為CFs，實(shí)驗(yàn)采用24代細(xì)胞。1.3  實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)中將24代CFs分為空白對(duì)照、AGEs（100mg?L-1）、AGEs加鹽酸羅格列酮0.1 mmol?L-1、AGEs加鹽酸羅格列酮1.0 mmol?L-1和AGEs加鹽酸羅格列酮10.0 mmol?L-15組。1.4  MTT法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)

6、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的CFs，2.5 g?L-1胰酶消化，用含10胎牛血清的DMEM調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為2.5×107 L-1，加入96孔培養(yǎng)板中接種，每孔200 l，靜置培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁、伸展，分別加入100mg?L-1 AGEs及不同濃度鹽酸羅格列酮培養(yǎng)48h后，每孔加入10 l MTT溶液(5g?L-1)，37繼續(xù)培養(yǎng)4小心吸棄培養(yǎng)液上清，每孔加入二甲基亞砜150l，振蕩混勻10min，測(cè)490nm 值。1.5  細(xì)胞周期測(cè)定細(xì)胞經(jīng)傳代并加入不同試劑培養(yǎng)24后，將單層培養(yǎng)細(xì)胞(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)用胰酶消化。加入34ml無(wú)鈣、鎂離子的PBS液，用吸管反復(fù)操作使成為單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)細(xì)胞密度為1&

7、#215;109 L-1，離心，去上清，約留0.5ml細(xì)胞懸液，用振蕩器使細(xì)胞分散。使用細(xì)滴管將細(xì)胞迅速注入4 70冷乙醇中，4保存。調(diào)整細(xì)胞密度為 1×109 L-1，碘化丙錠染色15min后用FACS440型流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson，美國(guó)）進(jìn)行細(xì)胞周期分析，計(jì)算機(jī)處理后得出各期細(xì)胞數(shù)目及其占總細(xì)胞數(shù)的百分比。1.6  NO含量測(cè)定 NO在體外轉(zhuǎn)化為NO-2和NO-3，利用硝酸還原酶將NO-3還原為NO-2，通過(guò)顯色深淺測(cè)定NO-2濃度來(lái)推算NO含量。操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，NO含量以公式（測(cè)定管吸光度-空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）&#

8、215;100mol?L-1計(jì)算。1.7  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SAS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)以x-±s表示，除細(xì)胞周期以百分值表示并用2檢驗(yàn)外，其它數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組間比較采用q檢驗(yàn)，P<0?05為差異有顯著性。2  結(jié)    果2.1  鹽酸羅格列酮對(duì)AGEs作用下CFs細(xì)胞增殖的影響    與AGEs組相比，隨著鹽酸羅格列酮濃度的增加，A值明顯下降，詳見(jiàn)表1。2.2  鹽酸羅格列酮對(duì)AGEs作用下CFs細(xì)胞周期的影響    流式細(xì)胞儀檢測(cè)示A

9、GEs組S期及G2/M期細(xì)胞百分值明顯高于對(duì)照組（P<0.01）,而鹽酸羅格列酮干預(yù)組均不同程度地被抑制（P<0.05），且隨鹽酸羅格列酮濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)，增殖期細(xì)胞的百分值越接近對(duì)照組，見(jiàn)表1。2.3  鹽酸羅格列酮對(duì)AGEs作用下CFs分泌NO的影響    3  討    論心肌纖維化與多種內(nèi)源性的神經(jīng)內(nèi)分泌和細(xì)胞因子的激活有關(guān)，CFs是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞。NO是強(qiáng)舒張血管、抑制心肌纖維化的活性物質(zhì)，在病理?xiàng)l件下，如高血壓、高血脂、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和心力衰竭等都有NO的儲(chǔ)備或基礎(chǔ)N

10、O的減少4。心臟中的NO除引起冠狀血管舒張、調(diào)節(jié)冠脈供血等一系列效用外，還可通過(guò)自分泌和(或)旁分泌的途徑抑制CFs增生和膠原合成，改善心肌纖維化，故CFs合成的NO是一種重要的抗心肌纖維化因子5。AGEs干預(yù)下CFs分泌NO的變化，及其與心肌纖維化的關(guān)系尚不清楚。羅格列酮屬胰島素增敏劑，是過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)的人工合成配體，TZD與PPAR結(jié)合后通過(guò)調(diào)節(jié)核因子B(NF?撥?B)抑制其下游靶基因(如TGF?撥隆?PAI?1、?SMA和?FABP)的表達(dá)，從而發(fā)揮了抗纖維化的作用6。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)的新生大鼠CFs與心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞一樣能分泌NO；并且AGEs組的CFs培

11、養(yǎng)液中NO含量較對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，提示AGEs具有抑制CFs分泌NO的作用,鹽酸羅格列酮可阻斷AGEs對(duì)CFs分泌NO的抑制作用，提示鹽酸羅格列酮抑制CFs增殖的作用可能與NO有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1HIARELLI F，de MARTINO M，MEZZETTI A，et al.Advanced glycation end products in children and adolescents with diabetes:relation to glycemic control and early microvascular complicationsJ.J

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