龍膽瀉肝湯對氧自由基和由羥自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的影響

1、中國中醫(yī)眼科雜志63實驗研究龍膽瀉肝湯對氧自由基和由羥自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的影響馮亦穎1 劉炳治1 王巨存2關(guān)鍵詞 龍膽瀉肝湯 超氧陰離子自由基 羥自由基 脂質(zhì)過氧化摘 要 目的 探討龍膽瀉肝湯對氧自由基和由羥自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的影響。方法 用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基和Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基,由羥自由基誘導(dǎo)大鼠虹膜睫狀體組織勻漿的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。結(jié)果 龍膽瀉肝湯對超氧陰離子自由基具有清除作用,并優(yōu)于抗壞血酸;對羥自由基具有清除作用,對羥自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化具有抑制作用,并強(qiáng)于甘露醇。結(jié)論 龍膽瀉肝湯瀉肝膽實火,清下焦?jié)駸岬臋C(jī)理可能與其清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化作用有

2、關(guān)。Aneffectoflongdanxiegantang(龍膽瀉肝湯)onoxygenfreeradicalsandthelipidperoxidationinducedbyhydroxylfreeradicalFenYiying1,LiuBinzhi1,WangJucun2 1DepartmentofOph thalmology,TianjinNankaiHospital,Tianjin300100,ChinaKeywords longdanxiegantan(龍膽瀉肝湯) superoxideanionfreeradical hydroxylfreeradical lipidperoxi

3、dationAbstract OBJECTIVE Toinvestigatetheeffectsoflongdanxiegantan(龍膽瀉肝湯,LT)onoxygenfreeradicals(OFR)andlipidperoxidation(LP)inducedbyhydroxylfreeradical(HFR)invitro METHODS Superoxideanionfreeradical(SAFR)wasproducedbyauto-oxidationof1,2,3-benzentriol,HFRwasproducedbyFentonreaction,andLPofratinthei

4、risandciliarybodyho mogenatewasreducedbyHFR RESULTS SAFRcouldbescavengedbyLTanditseffectwasstrongerthanascorbicacid,andbetterthanmannitolforHFR CONCLUSION Theessenceofef fectsthatLTpurgegandanshihuo(肝膽實火)andclearxiajiaoshire(下焦?jié)駸?couldberelativewitheliminationofOFRandinhibitionofLP 龍膽瀉肝湯(longdanxieg

5、antan,LT)對急性虹膜睫狀體炎有顯著的療效 1,2,3 。我們于1999年2月5月通過動物實驗,觀察了LT對超氧陰離子自由基(superoxideanionfreeradical,SAFR)、羥自由基(hydroxylfreeradical,HFR)及由HFR誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的影響,旨在闡明LT對急性虹膜睫狀體炎的作用機(jī)理。作者單位:1 天津市南開醫(yī)院眼科2 天津市天津醫(yī)院藥理室:(天津300100)1 材料與方法1 1 實驗材料實驗動物:購自天津醫(yī)學(xué)實驗動物中心,雄性SD大鼠,每只體重272 0g 13 4g。藥品及試劑:LT方由龍膽草酒炒6g 黃芩炒9g 梔子酒炒9g 澤瀉12g 木

6、通9g 車前子9g 當(dāng)歸酒洗9g 生地黃酒炒9g 柴胡6g 生甘草6g組成。LT全方84g加水400ml浸泡4h后,煎煮0 5h,過濾,殘渣再加水300ml,煎煮0 5h,過濾,合并二次濾液,并濃縮至168ml,得供試液(LTS),每1ml464 2000年5月第10卷第2期LTS相當(dāng)于生藥0 5g。番紅花紅(safranineT)為生物染色素,20%抗壞血酸、20%甘露醇為天津氨基酸公司產(chǎn)品,其他試劑均為分析純。所有供試藥品用前均根據(jù)需要進(jìn)行倍比稀釋。儀器:UV-240紫外分光光度計(日本島津)。1 2 實驗方法1 2 1 超氧陰離子自由基生成與清除實驗:對參考文獻(xiàn)的方法 5 略作修改。取0

7、 05mol/L,pH8 2的Tris-HCL緩沖液4 5ml于試管中,置25 水浴中預(yù)熱20min,加入供試藥品(LTS/抗壞血酸)0 1ml,2 5mmol/L鄰苯三酚0 4ml,混勻后在25 水浴中反應(yīng)4min,立即用8mol/L的HCL兩滴終止反應(yīng),并在299nm 1nm處測定吸收度(用0 4ml蒸餾水代替鄰苯三酚的上述各相應(yīng)反應(yīng)液調(diào)零)?？瞻捉M以0 1ml蒸餾水代替樣品,并按A空白-A樣品下式計算清除率:清除率=A空白100%。1 2 2 羥自由基的生成及清除實驗:采用亞鐵離子催化過氧化氫產(chǎn)生羥自由基(Fenton反應(yīng)) 6 ,該反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基可使番紅花紅褪色。該項實驗以羥自由基

8、特異性清除劑 甘露醇 7 作為對照品。取0 15mmol/L,pH7 4的磷酸鹽緩沖液1ml,40 g/ml的番紅花紅1ml,供試藥品0 5ml,3%過氧化氫1ml(新鮮配制),0 945mmol/LEDTA-Fe( )1ml(新鮮配制),混合后在37 水浴中反應(yīng)30min后在520nm 1nm處測定吸收度(用3ml蒸餾水代替番紅花紅,過氧化氫和EDTA-Fe的上述各相應(yīng)反應(yīng)液調(diào)零)?？瞻捉M以0 5ml蒸餾水代替供試樣品,對照組以1 5ml蒸餾水代替EDTA-Fe( )和供試樣品,并按下式計算清除A樣品-A空白率:清除率=A-A 100%。對照空白1 2 3 脂質(zhì)過氧化的檢測:無菌條件下取大鼠

9、虹膜睫狀體,制成10%組織勻漿。取上清液 液1ml,11 8mmol/L的EDTA-Fe( )1ml(新鮮配制),供試藥品0 6ml,3%過氧化氫(新鮮配制)1ml于試管中,混勻后于37 水浴溫育30min。空白組以0 6ml蒸餾水代替供試藥品,對照組以1 6ml蒸餾水代替EDTA-Fe( )和供試藥品。取上述反應(yīng)液0 6ml,20%醋酸1 2ml,1%硫代巴比妥酸(TBA)1 4ml,混勻后在95 水浴加熱60min,按文獻(xiàn)方法處理后在532nm 1nm處測定吸收度(用2ml蒸餾水代替EDTA-Fe和過氧化氫的上述各相應(yīng)反應(yīng)液的正丁醇提取液調(diào)零)。A空白-A樣品按下式計算抑制率:抑制率=A空

10、白-A對照100%。2 結(jié)果實驗結(jié)果表明:對SAFR產(chǎn)生50%清除效應(yīng)所需LTS的濃度(EC50)小于抗壞血酸的濃度;對于清除HFR而言,LT的EC50小于甘露醇的EC50;LT抗脂質(zhì)過氧化所需EC50小于甘露醇的EC50。數(shù)據(jù)見表1。表1 LT清除SAFR、HFR抗LPO的效應(yīng)藥物名稱LT抗壞血酸LT甘露醇LT甘露醇藥物效應(yīng)清除SAFR(n=5)清除HFR(n=5)抗LPO(n=10)-EC50(x s,g/L)82 13 0 131)7 26 0 3414 32 0 562)33 76 1 3125 43 0 963)47 52 1 76注:1)與抗壞血酸比較P<0 05;2)與甘露

11、醇比較P<0 05;3)與甘露醇比較P<0 013 討論機(jī)體在代謝過程中可以產(chǎn)生SAFR-(O 2)、HFR( OH)、過氧化氫(hydrogenperoxide,HP)、單線態(tài)氧(singletmolecularoxygen,SMO,O2),上述4種成分統(tǒng)稱為活性氧,前二者為氧自由基。HFR和SMO可由SAFR、HP衍生,例如Fenton反應(yīng)和Harber Weiss反應(yīng)。在生理情況下,這些活性氧的產(chǎn)生和清除處于生理性低水平的平衡狀態(tài),并對人體有利,但在某些病理情況下無論何種原因1中國中醫(yī)眼科雜志-65傷?；钚匝跻环矫姹旧砭涂梢栽斐蓪ι锎蠓肿拥膿p傷,另一方面可觸發(fā)多不飽和脂肪酸

12、的脂質(zhì)過氧化(lipidperoxidation,LPO),反應(yīng)中產(chǎn)生的各種中間產(chǎn)物造成同樣的損傷,LPO反應(yīng)的終產(chǎn)物 丙二醛(MDA)就是一種雙功能基化合物,它可使含氨基的蛋白質(zhì)、核酸、腦磷脂發(fā)生交聯(lián)并喪失其活性。4種活性氧中,HFR對LPO的作用最強(qiáng)。近年來大量的研究證明:氧自由基誘導(dǎo)的LPO反應(yīng)與許多疾病的發(fā)生有密切的聯(lián)系,如物理因素、生物因素、免疫損傷導(dǎo)致機(jī)體的各種炎癥、老年性白內(nèi)障、動脈粥樣硬化、腦動脈痙攣、老年性癡呆、衰老等。由于這些原因,國內(nèi)外學(xué)者正積極地從事篩選具有清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化功能的有效藥物 9,10 。急性虹膜睫狀體炎歸為自身免疫性疾病,屬中醫(yī)瞳神緊小范疇,證屬

13、肝膽濕熱。龍膽瀉肝湯適用于合并慢性胃炎、胃潰瘍、高血壓以及有糖尿病不適用消炎痛或皮質(zhì)激素口服者。本實驗結(jié)果從LT清除氧自由基抗脂質(zhì)過氧化角度部分揭示了LT上瀉肝膽實火,下清下焦?jié)駸岬膶嵸|(zhì),對指導(dǎo)臨床用藥有一定的參考價值。作者認(rèn)為,評價LT上述作用強(qiáng)度尚需多種實驗加以證明,例如用黃嘌呤/次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應(yīng)作為產(chǎn)生O 2的體系,-以及用電子自旋共振法(ESR)直接檢測O 2和用自旋捕捉法(spintrapping)檢測 OH。參考文獻(xiàn)1 鄔鳳巖,陳蘭英 龍膽瀉肝湯治療急性虹膜睫狀體炎60例,實用中醫(yī)藥雜志,1996,12(6):152 王 宇 疏風(fēng)清肝法治療虹膜睫狀體炎86例 浙江中醫(yī)雜志

14、,1995,30(1):203 徐 惠 龍膽瀉肝湯加減治療虹膜睫狀體炎30例 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥,1994,13(1):144 許濟(jì)群,主編 方劑學(xué) 上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1985,63645 黃維嘉,陳宏礎(chǔ),黃天祿 鄰苯三酚自氧化法測定人紅細(xì)胞超氧化物歧化酶 中華醫(yī)學(xué)檢驗雜志,1989,12(4):2066 魯純素,趙會英,史錄文 絲裂霉素促進(jìn)活性氧自由基生成的研究 生物化學(xué)雜志,1985,5(6):5327 陳 修 自由基對心血管功能的損傷和藥物保護(hù) 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,1992,6(1):38 董 偉,李建新,陳國樞,等 人紅細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物及超氧化物歧化酶的研究 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)

15、展,1986,13(6):359 TodasS,KumuraM OhnishiM Effectsofphenolcarboxylicacidsuperoxideanion Plantamedica:1991,57(1):810 林童俊,劉耕陶,李小潔,等 黃皮酰胺抗脂質(zhì)過氧化及對氧自由基的清除作用 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,1992,6(2):97中西醫(yī)結(jié)合治療乙酸汽霧致眼損傷陳維華1996年1月12月本院眼科門診經(jīng)治乙酸汽霧致眼損傷14例,患者均為男性,發(fā)病21人次,其中1例連續(xù)發(fā)生3次,5例各連續(xù)發(fā)生2次,患者是農(nóng)藥廠制藥車間的工人。年齡2139歲。均在酸味較濃的車間連續(xù)工作8h,晨起時雙眼同時發(fā)病。臨床表現(xiàn):雙眼刺痛難睜,畏光、流淚、異物感,雙眼瞼皮膚潮紅發(fā)熱,瞼緣部水腫明顯。瞼球結(jié)膜充血水腫。角膜熒光素著色陽性,裂隙燈檢查見角膜點狀或小片狀缺損、水腫。結(jié)膜囊石蕊試紙檢測呈酸性反應(yīng)。6例因為口罩戴得過低,伴有面頰部皮膚潮紅發(fā)熱;4例因帽耳上翻,使頸部、耳廓裸露潮紅。治療:用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊,直到結(jié)膜囊內(nèi)為作者單位:射陽縣中醫(yī)院眼科(江蘇224300)收稿:1999-05-04中性。中藥五味消毒飲加減,每日1劑煎服,前兩遍內(nèi)服,第3遍熏洗雙眼。配合