誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展

1、誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究進(jìn)展         11-01-28 11:45:00     作者：夏海濱, 趙俊麗    編輯：studa20【關(guān)鍵詞】  干細(xì)胞; 細(xì)胞分化; 轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells, iPS）是通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)(gene transfection)將某些轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入動(dòng)物或人的體細(xì)胞, 使體細(xì)胞直接重構(gòu)成為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem c

2、ell,  ES）細(xì)胞樣的多潛能細(xì)胞。iPS細(xì)胞不僅在細(xì)胞形態(tài)、 生長特性、 干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)等方面與ES細(xì)胞非常相似, 而且在DNA甲基化方式、 基因表達(dá)譜、 染色質(zhì)狀態(tài)、 形成嵌合體動(dòng)物等方面也與ES細(xì)胞幾乎完全相同。iPS細(xì)胞的研究受到人們廣泛的關(guān)注, 是目前細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。iPS細(xì)胞技術(shù)誕生還不到2年, 卻為干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和臨床疾病治療研究帶來了前所未有的希望, iPS細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)使人們從ES細(xì)胞和治療性克隆等激烈的倫理學(xué)爭論中解脫出來。但是, 目前制備iPS細(xì)胞的方法在安全性方面還存在一定問題, 因此探索一種高效、 安全的iPS細(xì)胞的制備方法顯得十

3、分必要。    1  iPS細(xì)胞的制備方法    2006年Takahashi等1研究小組利用分別攜帶Oct4、 Sox2、 Myc和Klf4轉(zhuǎn)錄因子的4種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,  MEFs), 經(jīng)過G418藥物篩選成功獲得第1批iPS細(xì)胞。但是這批iPS細(xì)胞系中DNA甲基化的方式與自然存在的ES細(xì)胞不同, 而且這批iPS細(xì)胞不能形成畸胎瘤。Okita等2研究小組報(bào)道了第2批iPS細(xì)胞的產(chǎn)生。他們采用與制備首批iPS細(xì)胞相同的方法, 但是采用了

4、不同的篩選基因。第2批iPS細(xì)胞系DNA甲基化的方式與自然存在的ES細(xì)胞的甲基化方式相同, 并且能形成畸胎瘤。2007年末, Takahashi和Yu等3, 4兩研究小組分別在細(xì)胞和科學(xué)雜志上報(bào)道關(guān)于iPS研究里程碑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 他們都成功獲得了人的iPS細(xì)胞系。Yamanaka采用與誘導(dǎo)小鼠iPS相同的方法, 成功將人成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成多干細(xì)胞。Thomson研究小組采用與Yamanaka不同的方法, 他們利用慢病毒載體運(yùn)輸Oct4、 Sox2、 Nanog和Lin28轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染IMR90胚胎成纖維細(xì)胞, 并且成功地獲得了人iPS細(xì)胞。2008年1月Nakagawa等5研究小組報(bào)道他們可以利

5、用Oct4、 Sox2和Klf4  3種轉(zhuǎn)錄因子將小鼠和人的成纖維細(xì)胞成功誘導(dǎo)出iPS細(xì)胞。Aoi等6研究小組將小鼠肝細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞成功誘導(dǎo)為iPS。Stadtfeld等7實(shí)驗(yàn)小組利用Oct4、 Sox2、 cmyc和Klf4 4種轉(zhuǎn)錄因子將胰島  細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞。    Hanna等8研究小組在細(xì)胞雜志上報(bào)道了他們將小鼠終末分化的B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。他們采用類似于利用成纖維細(xì)胞制備iPS細(xì)胞的方法, 使用4種轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、 Sox2、 cMyc和Klf4）及CCATT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）, 成功地將成

6、熟B淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞。    Eminli等9研究小組利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶Oct4、 Klf4和cMyc 3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子將神經(jīng)祖細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞, 之后Kim等10研究小組報(bào)道利用慢病毒載體攜帶Oct4和cMyc或Oct4與Klf4兩種轉(zhuǎn)錄因子就可以將成人的神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞。他們檢測到在成人神經(jīng)干細(xì)胞中Oct4和cMyc的表達(dá)量高于胚胎干細(xì)胞中Oct4和cMyc的表達(dá)量, 因此考慮利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體只攜帶兩種轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)成人神經(jīng)干細(xì)胞為iPS細(xì)胞并獲得成功。由此他們推測當(dāng)被誘導(dǎo)的體細(xì)胞中高表達(dá)某個(gè)或某幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子時(shí), 可以減少其他轉(zhuǎn)錄因子的使

7、用。    當(dāng)一系列人正常體細(xì)胞被誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞之后, 科學(xué)研究者開始研究患者的細(xì)胞是否也能誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞。Dimos等11研究小組報(bào)道他們將肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）患者的細(xì)胞成功誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞。隨后Park等12報(bào)道他們將腺苷脫氨酶缺陷相關(guān)嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷、 三型葡萄糖腦苷脂沉積癥、 帕金森綜合征、 舞蹈癥、 青少年I型糖尿病等患者的細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞。    體細(xì)胞可以誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞, 但是獲得iPS細(xì)胞的幾率很低。于是科學(xué)研究者們研究能否找到提高iPS

8、細(xì)胞產(chǎn)生效率的方法。Mali等13報(bào)道他們將SV40大T抗原和Oct4、 Sox2、 cMyc和Klf4同時(shí)誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞能顯著提高iPS細(xì)胞產(chǎn)生的效率, 而且iPS細(xì)胞提前12周產(chǎn)生。Huangfu等14報(bào)道DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；敢种苿┠茱@著提高iPS細(xì)胞產(chǎn)生的效率。Aasen等15研究小組報(bào)道采用逆轉(zhuǎn)錄病毒運(yùn)輸Oct4、 Sox、 Klf4和cmyc誘導(dǎo)人角化細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞的效率比誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPS細(xì)胞的效率至少提高100倍, 而且大大縮短了產(chǎn)生iPS細(xì)胞的時(shí)間。    Maherali等16研究小組報(bào)道了制備iPS細(xì)胞新的研究平臺(tái),

9、 并指出可從分子、 遺傳和生化機(jī)制上改造細(xì)胞程序重排技術(shù)。他們開發(fā)了一種新的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù), 采用doxycycline誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá), 從而可以通過藥物來控制iPS細(xì)胞的產(chǎn)生, 其制備的iPS細(xì)胞從結(jié)構(gòu)和功能上都與人類胚胎干細(xì)胞很相似。人們研究發(fā)現(xiàn), 不同的皮膚細(xì)胞類型用于誘導(dǎo)產(chǎn)生iPS細(xì)胞的時(shí)間也不同16。Huangfu等17研究小組報(bào)道僅利用反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)Oct4和Sox2兩種轉(zhuǎn)錄因子, 同時(shí)借助抑制組蛋白去乙?；富钚缘男》肿踊衔锉焖幔╒alproic Acid, VPA）的作用就能將人的成纖維細(xì)胞系BJ和NHDF逆轉(zhuǎn)成iPS細(xì)胞。    最近

10、, Stadtfeld等18報(bào)道他們利用腺病毒載體運(yùn)輸Oct4、 Sox2、 Klf4和cMyc 4種轉(zhuǎn)錄因子成功獲得無病毒整合的iPS(AdenoiPS)細(xì)胞。Okita等19研究小組采用2種質(zhì)粒分別攜帶Oct4、 Sox2和Klf4 3種轉(zhuǎn)錄因子和cmyc轉(zhuǎn)錄因子共轉(zhuǎn)染人或小鼠的體細(xì)胞并使之誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞, 經(jīng)過檢測并無質(zhì)粒整合進(jìn)入iPS細(xì)胞基因組中, 即獲得了在基因組水平無轉(zhuǎn)錄因子整合的iPS細(xì)胞。Frank 等采用帶有l(wèi)oxpCre 系統(tǒng)的病毒載體誘導(dǎo)iPS, 此系統(tǒng)可將整合到iPS基因組中的4種外源轉(zhuǎn)錄因子及病毒基因成分完全剔除, 因而所獲得了完全沒有病毒基因組的來源于Parki

11、nson患者成纖維細(xì)胞的iPS; 而Knut 等人使用含有轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的病毒載體也成功獲得了完全沒有病毒基因組的來源于人胚胎成纖維細(xì)胞的iPS。這些無病毒基因組成分的iPS誘導(dǎo)成功為其臨床實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。iPS細(xì)胞產(chǎn)生的方法歸納見表1。表1  誘導(dǎo)iPS產(chǎn)生的方法    小鼠胚胎成纖維細(xì)胞13Oct4,  Sox2,  Klf4小鼠及人成纖維細(xì)胞5Oct4,  Klf4,  cmyc神經(jīng)祖細(xì)胞9Oct4,  Klf4成人神經(jīng)干細(xì)胞10Oct4,  cmyc成人神經(jīng)干細(xì)胞10Oct4, 

12、; Sox2,  cmyc,  Klf4,  Nanog人角質(zhì)細(xì)胞16Oct4,  Sox2人成纖維細(xì)胞系BJ and NHDF17    2  iPS細(xì)胞的應(yīng)用    iPS細(xì)胞技術(shù)是一把了解細(xì)胞核基因組重序(reprogramming)的鑰匙, 因?yàn)閕PS細(xì)胞在功能上與胚胎干細(xì)胞幾乎完全相同。因此, iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)產(chǎn)生過程將是我們了解基因組重序分子機(jī)制和個(gè)體特異的疾病發(fā)生機(jī)制的最理想的模型。Hanna等20近期已經(jīng)進(jìn)行了iPS細(xì)胞應(yīng)用基礎(chǔ)研究的首次嘗試, 利用人類鐮狀細(xì)胞性貧血的小鼠動(dòng)物模型, 取其尾尖部皮膚的成纖維細(xì)胞, 通過導(dǎo)入Oct4、 Sox2、 Klf4和cMyc基因, 獲得自體iPS細(xì)胞; 進(jìn)一步采用基因特異性打靶技術(shù)對(duì)人類鐮狀血紅