第十二章熒光分析法（Fluorometry）

1、2022年2月6日星期日12022年2月6日星期日2v第一節(jié)第一節(jié) 基本原理基本原理v第二節(jié)第二節(jié) 定量分析方法定量分析方法v第三節(jié)第三節(jié) 熒光分析條件的選擇熒光分析條件的選擇v第四節(jié)第四節(jié) 熒光分光光度計和熒光分析新技術(shù)熒光分光光度計和熒光分析新技術(shù)2022年2月6日星期日3.v光致發(fā)光：光致發(fā)光： 物質(zhì)吸收能量（電、熱、化學(xué)和光能等）后電子物質(zhì)吸收能量（電、熱、化學(xué)和光能等）后電子會從基態(tài)能級被激發(fā)至激發(fā)態(tài)能級，然后從不穩(wěn)會從基態(tài)能級被激發(fā)至激發(fā)態(tài)能級，然后從不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象定的激發(fā)態(tài)返回至基態(tài)并發(fā)射出光子，此種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。稱為光致發(fā)光。v常見的光致發(fā)光

2、是熒光和磷光。常見的光致發(fā)光是熒光和磷光。v熒光：熒光：物質(zhì)從激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)時物質(zhì)從激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)時發(fā)射出的光輻射。發(fā)射出的光輻射。v分子熒光和原子熒光：分子熒光和原子熒光：待測物為待測物為分子分子、原子、原子v種類：種類：紫外可見熒光紫外可見熒光、紅外熒光、紅外熒光、X射線熒光射線熒光2022年2月6日星期日4電子能級的多重性：電子能級的多重性：M=2S+1基態(tài)：基態(tài)：M=2S+1=1激發(fā)態(tài)：激發(fā)態(tài)：S=0，M=2S+1=1S=1，M=2S+1=3S*1S0T*12022年2月6日星期日52022年2月6日星期日6v處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過輻射或非輻射躍遷處于激

3、發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通過輻射或非輻射躍遷等去活化過程返回至基態(tài)等去活化過程返回至基態(tài) 。這些過程包括：。這些過程包括：v處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱熱的形式傳遞給周圍的的形式傳遞給周圍的分子，電子從高振動能層失活至同一電子能級內(nèi)低振動能分子，電子從高振動能層失活至同一電子能級內(nèi)低振動能層的過程，稱為振動弛豫。層的過程，稱為振動弛豫。v較高電子能級的低振動能層與較低電子能級的高振動能層較高電子能級的低振動能層與較低電子能級的高振動能層相重疊時，則電子可在重疊的能層之間通過振動偶合產(chǎn)生相重疊時，則電子可在重疊的能層之間通過振動偶合產(chǎn)生無輻射無輻射躍遷。躍遷。2022年

4、2月6日星期日7v受激分子與溶劑或其它分子相互作用發(fā)生能量轉(zhuǎn)換而使受激分子與溶劑或其它分子相互作用發(fā)生能量轉(zhuǎn)換而使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失的過程，也稱熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失的過程，也稱“熄滅熄滅”或或“猝滅猝滅”。常發(fā)生在第一激發(fā)單重態(tài)或激發(fā)三重態(tài)的最。常發(fā)生在第一激發(fā)單重態(tài)或激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過程中。低振動能級向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過程中。v系間跨躍是發(fā)生在兩個不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷，系間跨躍是發(fā)生在兩個不同多重態(tài)之間的無輻射躍遷，即處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重即處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過程。為無輻射躍遷，重原子或容液中存

5、性發(fā)生變化的過程。為無輻射躍遷，重原子或容液中存在氧分子等順磁性物質(zhì)時容易發(fā)生。結(jié)果：熒光減弱在氧分子等順磁性物質(zhì)時容易發(fā)生。結(jié)果：熒光減弱2022年2月6日星期日8v分子電子從單重激發(fā)態(tài)（分子電子從單重激發(fā)態(tài)（Kasha規(guī)則）的最低振動能級規(guī)則）的最低振動能級在很短時間（在很短時間（109107s）躍遷到基態(tài)各振動能層時所）躍遷到基態(tài)各振動能層時所產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光。由于各種去活化過程的存在，產(chǎn)生的光子輻射稱為熒光。由于各種去活化過程的存在，熒光輻射能通常要比激發(fā)光能量低，即熒光波長大于激熒光輻射能通常要比激發(fā)光能量低，即熒光波長大于激發(fā)波長（發(fā)波長（Stokes效應(yīng)，效應(yīng)，1852年）

6、。年）。v從單重態(tài)到三重態(tài)分子間發(fā)生系間跨躍躍遷后，再經(jīng)振從單重態(tài)到三重態(tài)分子間發(fā)生系間跨躍躍遷后，再經(jīng)振動弛豫回到三重態(tài)最低振動能層，最后，在動弛豫回到三重態(tài)最低振動能層，最后，在10410s內(nèi)內(nèi)躍遷到基態(tài)的各振動能層所產(chǎn)生的輻射。躍遷到基態(tài)的各振動能層所產(chǎn)生的輻射。0 0S S光光發(fā)發(fā)射射（低低振振動動能能層層）1 1T T振振動動弛弛豫豫（高高振振動動能能層層）1 1T T系系間間跨跨躍躍1 1S S磷磷2022年2月6日星期日9受激分子去活化過程受激分子去活化過程輻射躍遷輻射躍遷無輻射躍遷無輻射躍遷熒熒 光光磷磷 光光猝猝 滅滅內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換系間跨越系間跨越振動弛豫振動弛豫2022年2月

7、6日星期日10v任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜任何熒（磷）光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜（熒光光譜）。是定性分析的基礎(chǔ)。與發(fā)射光譜（熒光光譜）。是定性分析的基礎(chǔ)。excitation spectrumv改變激發(fā)波長，測量在最強(qiáng)熒（磷）光發(fā)射波長改變激發(fā)波長，測量在最強(qiáng)熒（磷）光發(fā)射波長處的強(qiáng)度變化，以處的強(qiáng)度變化，以對對 作作圖得激發(fā)光譜。圖得激發(fā)光譜。v激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀十分相似，經(jīng)校正激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀十分相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因為后二者完全相同！這是因為v激發(fā)光譜可用于激發(fā)光譜可用于熒光物質(zhì)；在定量時，用于熒光物質(zhì)；在定量時，用于選擇最適宜

8、的激發(fā)波長。選擇最適宜的激發(fā)波長。2022年2月6日星期日11emission spectrumv發(fā)射光譜即光譜。一定波發(fā)射光譜即光譜。一定波長和強(qiáng)度的激發(fā)波長輻照長和強(qiáng)度的激發(fā)波長輻照熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長熒光物質(zhì)，產(chǎn)生不同波長和強(qiáng)度的熒光，以和強(qiáng)度的熒光，以對其發(fā)射對其發(fā)射作作圖得熒光發(fā)射光譜。圖得熒光發(fā)射光譜。v由于不同物質(zhì)具不同的特由于不同物質(zhì)具不同的特征發(fā)射峰，因而使用熒光征發(fā)射峰，因而使用熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光發(fā)射光譜可用于鑒別熒光物質(zhì)。物質(zhì)。2022年2月6日星期日12v波長比較波長比較 熒光發(fā)射波長比激發(fā)（或吸收）波長更長，即產(chǎn)生所謂Stokes位移。（振動弛豫失活所致）v

9、形狀比較形狀比較 熒光發(fā)射光譜只有一個吸收帶，其形狀與激發(fā)波長無關(guān)。v熒光激發(fā)與發(fā)射呈鏡像對稱熒光激發(fā)與發(fā)射呈鏡像對稱 通常熒光光譜與激發(fā)（吸收）光譜呈鏡像對稱關(guān)系。如蒽的熒光光譜與激發(fā)光譜2022年2月6日星期日132022年2月6日星期日142022年2月6日星期日15v去除激發(fā)光源后，分子熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度去除激發(fā)光源后，分子熒光強(qiáng)度降低到最大熒光強(qiáng)度的的1/e所需的時間，用所需的時間，用f 表示。表示。v根據(jù)指數(shù)衰減定律可求出熒光壽命：根據(jù)指數(shù)衰減定律可求出熒光壽命：, ,Ktt0eFF= =f0t1KFe1Ft/ /, ,) )/ /( (, ,f f= = = =則則若若K

10、t0teFF= =ft0tFFln= =v以以lnF0/Ft對對t作圖，直線斜率即為作圖，直線斜率即為1/fv利用熒光壽命的差別，可進(jìn)行熒光物質(zhì)的混合物分析利用熒光壽命的差別，可進(jìn)行熒光物質(zhì)的混合物分析2022年2月6日星期日16P PE EC CI IS SC CI IC CV VR Rk kk kk kk kk k+ + + + + += = =FFfkk吸吸收收激激發(fā)發(fā)光光的的光光子子數(shù)數(shù)發(fā)發(fā)射射熒熒光光的的光光子子數(shù)數(shù)（fluorescence efficiency)v凡使凡使 kF 增加，使其它去活化常數(shù)降低的因素增加，使其它去活化常數(shù)降低的因素均可增加熒光量子產(chǎn)率。均可增加熒光量子

11、產(chǎn)率。vkF通常由分子結(jié)構(gòu)決定，而其它參數(shù)則由化學(xué)通常由分子結(jié)構(gòu)決定，而其它參數(shù)則由化學(xué)環(huán)境和結(jié)構(gòu)共同決定。環(huán)境和結(jié)構(gòu)共同決定。2022年2月6日星期日17 v產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：產(chǎn)生并可觀察到熒光的條件：1）分子必須具有吸收一定頻率紫外光的特定）分子必須具有吸收一定頻率紫外光的特定結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)；2）物質(zhì)吸收特征頻率的輻射后，必須具有較）物質(zhì)吸收特征頻率的輻射后，必須具有較高的熒光效率高的熒光效率2022年2月6日星期日18（1）長共軛結(jié)構(gòu)：）長共軛結(jié)構(gòu)：v共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光效率與大，熒光越強(qiáng)，熒光共軛效應(yīng)：共軛度越大，熒光效率與大，熒光越強(qiáng)，熒光光譜紅移。（與紫外光譜紅移。（與紫

12、外可見光譜規(guī)律類似）可見光譜規(guī)律類似）（2）剛性平面結(jié)構(gòu)：）剛性平面結(jié)構(gòu)：v分子剛性（分子剛性（Rigidity）和平面性越大，分子振動越少，系）和平面性越大，分子振動越少，系間跨越和碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高，光譜間跨越和碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高，光譜紅移。紅移。 C CO OC CO OO O H HH H O OO OC CO OC CO OO O H HH H O O酚酞熒光素N NN NO OO OM M g g8-羥基喹啉鎂螯合物2022年2月6日星期日191-二甲胺基萘-4-磺酸鹽 f 0.481-二甲胺基萘-5-磺酸鹽 f 0.531-二甲胺基萘-7-磺酸

13、鹽 f 0.751-二甲胺基萘-8-磺酸鹽 f C CC CH HH HC CC CH HH H強(qiáng)熒光無熒光2022年2月6日星期日20 （3）苯環(huán)上的取代基：）苯環(huán)上的取代基：v給電子取代基：給電子取代基：增強(qiáng)熒光（增強(qiáng)熒光（p共軛），如共軛），如OH、OR、 NH2、 CN、 NR2等；等；v吸電子取代基：吸電子取代基：減弱或破壞熒光，減弱或破壞熒光，COOH、 C=O、 NO2、 NO、 X等；等；鹵素取代基隨原子序數(shù)增加熒光逐漸減弱，磷光逐漸鹵素取代基隨原子序數(shù)增加熒光逐漸減弱，磷光逐漸增強(qiáng)，該現(xiàn)象也稱增強(qiáng)，該現(xiàn)象也稱重原子效應(yīng)重原子效應(yīng)。v與與鍵作用較小的取代基：鍵作用較小的取代基：

14、對熒光影響不明顯。對熒光影響不明顯。SO3H、NH3+2022年2月6日星期日21（4）熒光試劑：）熒光試劑：v指與弱熒光物質(zhì)作用得到強(qiáng)熒光物質(zhì)的化合物。指與弱熒光物質(zhì)作用得到強(qiáng)熒光物質(zhì)的化合物。常用熒光試劑：常用熒光試劑：熒光胺：用于脂肪或芳香伯胺熒光胺：用于脂肪或芳香伯胺鄰苯二甲醛：用于伯胺、氨基酸鄰苯二甲醛：用于伯胺、氨基酸丹酰氯：伯、仲胺，酚基生物堿丹酰氯：伯、仲胺，酚基生物堿測定無機(jī)離子的熒光試劑：與無機(jī)離子形成共軛有機(jī)測定無機(jī)離子的熒光試劑：與無機(jī)離子形成共軛有機(jī)配合物配合物2022年2月6日星期日22（1）溶劑效應(yīng)：）溶劑效應(yīng)： 一般，溶劑極性增大熒光強(qiáng)度增加并紅移；一般，溶劑極

15、性增大熒光強(qiáng)度增加并紅移； 溶劑粘度降低，熒光強(qiáng)度減弱。溶劑粘度降低，熒光強(qiáng)度減弱。因溶劑而形成氫鍵、電離等作用而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)因溶劑而形成氫鍵、電離等作用而改變熒光物質(zhì)結(jié)構(gòu)會使熒光波長和強(qiáng)度改變。如重原子溶劑使熒光減弱會使熒光波長和強(qiáng)度改變。如重原子溶劑使熒光減弱（2）溫度：）溫度：溫度增加，熒光強(qiáng)度下降溫度增加，熒光強(qiáng)度下降（因為內(nèi)、外轉(zhuǎn)換增加，粘（因為內(nèi)、外轉(zhuǎn)換增加，粘度或度或“剛性剛性”降低）。因此體系降低溫度可增加熒光降低）。因此體系降低溫度可增加熒光分析靈敏度。分析靈敏度。2022年2月6日星期日23（3）pH值：值：在不同在不同pH值時，具酸或堿性基團(tuán)的有機(jī)物值時，具酸或堿性基

16、團(tuán)的有機(jī)物結(jié)構(gòu)可能結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化發(fā)生變化；無機(jī)熒光物質(zhì)，；無機(jī)熒光物質(zhì)，影響其穩(wěn)定性。影響其穩(wěn)定性。N N H H2 2N N H H3 3N N H HH HO O H HH HO O H HpH13pH2pH712無熒光無熒光藍(lán)熒光v具熒光性的金屬有機(jī)配合物也會受到具熒光性的金屬有機(jī)配合物也會受到pH的影響的影響2022年2月6日星期日24（4）熒光猝滅與猝滅劑：）熒光猝滅與猝滅劑：指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低、消失或熒光強(qiáng)度與濃度不呈線性引起熒光強(qiáng)度降低、消失或熒光強(qiáng)度與濃度不呈線性關(guān)系的現(xiàn)象。關(guān)系的現(xiàn)象。

17、猝滅劑：如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化猝滅劑：如鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等吸電子極性物質(zhì)。合物、重氮化合物、羰基化合物等吸電子極性物質(zhì)。猝滅形式：猝滅形式：碰撞猝滅；碰撞猝滅；轉(zhuǎn)化為物熒光物質(zhì)；轉(zhuǎn)化為物熒光物質(zhì)；轉(zhuǎn)入三重態(tài)的轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅，引入溴、碘、氧猝滅，引入溴、碘、氧；電子轉(zhuǎn)移猝滅；電子轉(zhuǎn)移猝滅；濃度濃度較大產(chǎn)生自猝滅。較大產(chǎn)生自猝滅。v熒光猝滅法熒光猝滅法: 若加入猝滅劑后，其熒光強(qiáng)度的減少與熒光若加入猝滅劑后，其熒光強(qiáng)度的減少與熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，則可據(jù)此測定熒光猝滅劑的猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，則可據(jù)此測定熒光猝滅劑的含量，這

18、種方法稱為熒光猝滅法。含量，這種方法稱為熒光猝滅法。2022年2月6日星期日25（5）散射光：）散射光：v瑞利光：瑞利光：與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換只改變方向的散射光。換只改變方向的散射光。v拉曼光：拉曼光：與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，既有能量交與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，既有能量交換又改變方向的散射光。換又改變方向的散射光。v干擾及消除：干擾及消除：散射光尤其是比入射波長波長更長的拉曼光干擾較大。散射光尤其是比入射波長波長更長的拉曼光干擾較大。消除方法：選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長。消除方法：選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)波長。注意溶劑的拉曼光的干擾：注意溶劑的拉曼光的干擾

19、：P237表表12-22022年2月6日星期日26v內(nèi)濾光內(nèi)濾光：體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或：體系內(nèi)存在可以吸收熒光的物質(zhì)，或熒光物質(zhì)的熒光光譜與吸收光譜有重疊，而使熒光物質(zhì)的熒光光譜與吸收光譜有重疊，而使熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象；熒光強(qiáng)度下降的現(xiàn)象；v自吸收自吸收：當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時，熒光分子吸：當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較大時，熒光分子吸收自身的熒光發(fā)射的現(xiàn)象。收自身的熒光發(fā)射的現(xiàn)象。2022年2月6日星期日272022年2月6日星期日28v 為避免激發(fā)光透過的影響在為避免激發(fā)光透過的影響在與激發(fā)光垂直的方向檢測與激發(fā)光垂直的方向檢測KCEClI3K2F10IIIIKF0ElC00= = = = .

20、 .) )( ( 該公式的近似處理條件該公式的近似處理條件：ECl0.052022年2月6日星期日29v熒光分析法在很弱的背景上直接測定熒光強(qiáng)度，熒光分析法在很弱的背景上直接測定熒光強(qiáng)度，其靈敏度取決于檢測器的靈敏度，測定溶液的濃其靈敏度取決于檢測器的靈敏度，測定溶液的濃度更稀；度更稀；v紫外可見分析法通過測定入射光和透過光的光強(qiáng)紫外可見分析法通過測定入射光和透過光的光強(qiáng)比值，濃度很低時檢測器很難檢測到微小的光強(qiáng)比值，濃度很低時檢測器很難檢測到微小的光強(qiáng)差，信號放大而比值不變，靈敏度仍不能提高。差，信號放大而比值不變，靈敏度仍不能提高。2022年2月6日星期日30 當(dāng)校正曲線通過原點時，可選擇

21、其線性范圍，用比例法當(dāng)校正曲線通過原點時，可選擇其線性范圍，用比例法進(jìn)行測定。空白不能調(diào)零：進(jìn)行測定?？瞻撞荒苷{(diào)零： (Fs F0) (F x-F0) = Cs:Cx 求求 Cx F0為空白溶液的熒光強(qiáng)度。為空白溶液的熒光強(qiáng)度。 用于多組分混合樣品的含量測定，同用于多組分混合樣品的含量測定，同UV方法。方法。3 3、定量分析方法、定量分析方法2022年2月6日星期日3144、熒光分析條件的選擇熒光分析條件的選擇（1）樣品濃度的選擇）樣品濃度的選擇v適用于稀濃度條件下，測定最佳濃度范圍一般為：適用于稀濃度條件下，測定最佳濃度范圍一般為： 10-5g/ml100g/mlv當(dāng)濃度較濃時，吸光度當(dāng)濃度較濃時，吸光度A0.05時，熒光強(qiáng)度同濃度的線時，熒光強(qiáng)度同濃度的線性關(guān)系將向濃度軸偏離。性關(guān)系將向濃度軸偏離。（2）激發(fā)光和熒光波長的選擇）激發(fā)光和熒光波長的選擇v若無散射光的干擾，一般選最大激發(fā)波長為激發(fā)光，最若無散射光的干擾，一般選最大激發(fā)波長為激發(fā)光，最大熒光波長為熒光的測定波長，測定的靈敏度最高。大熒光波長為熒光的測定波長，測定的靈敏度最高。（3）散射光干擾及消除干擾的