植物25羥基維生素D325OHD3酶聯(lián)免疫分析

1、植物 25羥基維生素 D3（25(OH)D3 ）酶聯(lián)免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用。檢測范圍：96T60ng/L -2500 ng/L使用目的：本試劑盒用于測定植物組織，細(xì)胞及其它相關(guān)樣本中25 羥基維生素 D3（ 25(OH)D3 ）含量。實驗原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中植物25 羥基維生素 D3 （ 25(OH)D3 ）水平。用純化的植物 25 羥基維生素D3（ 25(OH)D3 ）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入植物 25羥基維生素D3（ 25(OH)D3 ），再與 HRP 標(biāo)記的 25 羥基維生素D3 （25(OH)D3 ）抗體結(jié)合，形成

2、抗體- 抗原 -酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物 25 羥基維生素 D3 （ 25(OH)D3 ）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（ OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中植物25 羥基維生素 D3（ 25(OH)D3 ）濃度。試劑盒組成130 倍濃縮洗滌液20ml× 1 瓶7終止液6ml ×1 瓶2酶標(biāo)試劑6ml × 1 瓶8標(biāo)準(zhǔn)品（ 4800ng/L ）0.5ml × 1 瓶3酶標(biāo)包被板12孔× 8條9標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

3、1.5ml × 1 瓶4樣品稀釋液6ml × 1 瓶10說明書1 份5顯色劑 A液6ml × 1 瓶11封板膜2 張6顯色劑 B液6ml × 1/瓶12密封袋1 個標(biāo)本要求1標(biāo)本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標(biāo)本放于-20保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融2不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋： 本試劑盒提供原倍標(biāo)準(zhǔn)品一支， 用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。2400 ng/L5 號標(biāo)準(zhǔn)品150l 的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1200

4、 ng/L4 號標(biāo)準(zhǔn)品150l 的 5 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液600 ng/L3 號標(biāo)準(zhǔn)品150l 的 4 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液300 ng/L2 號標(biāo)準(zhǔn)品150l 的 3 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液150 ng/L1 號標(biāo)準(zhǔn)品150l 的 2 號標(biāo)準(zhǔn)品加入150l 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液2.加樣： 分別設(shè)空白孔 （空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑， 其余各步操作相同） 、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50l，待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40l，然后再加待測樣品 10l（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻

5、。3.溫育：用封板膜封板后置37溫育 30 分鐘。4.配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50l，空白孔除外。7. 溫育：操作同 3。8. 洗滌：操作同 5。9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50 l，再加入顯色劑 B50l，輕輕震蕩混勻， 37避光顯色10 分鐘.10. 終止：每孔加終止液 50l，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色） 。11.測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（液后 15 分鐘以內(nèi)進行。操作程序總結(jié)：OD值）。 測

6、定應(yīng)在加終止計算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式， 將樣品的 OD 值代入方程式， 計算出樣品濃度， 再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。注意事項1試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。3各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（× n× 5）。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6底物請避光保存。