一氧化氮、內(nèi)皮素和循環(huán)內(nèi)皮細胞在支氣管哮喘中的作用研究

1、    一氧化氮、內(nèi)皮素和循環(huán)內(nèi)皮細胞在支氣管哮喘中的作用研究        摘要目的：探討一氧化氮、內(nèi)皮素和循環(huán)內(nèi)皮細胞在支氣管哮喘中的作用。方法：哮喘患兒61例，40名健康兒童為對照，測定其血漿NO-2/NO-3、ET、cGMP和循環(huán)內(nèi)皮細胞(CEC)水平，用過敏性哮喘豚鼠進行驗證。結(jié)果：哮喘患兒血漿NO-2/NO-3、cGMP和CEC水平均明顯升高(P0.050.01)，其中重度哮喘患兒血漿NO-2/NO-3和CEC水平較輕中度哮喘患兒更高(P均0.01)；重度哮喘患兒

2、血漿ET水平明顯升高(P0.01)；哮喘患兒血漿NO-2/NO-3與cGMP和CEC水平呈顯著正相關(guān)(P0.050.01)。過敏性哮喘豚鼠BALF中NO-2/NO-3、ET及cGMP水平均明顯升高(P均0.01)；血漿中cGMP和CEC水平亦升高(P均0.05)；糖皮質(zhì)激素可降低NO-2/NO-3、ET、cGMP和CEC水平。結(jié)論：哮喘時NO-2/NO-3、ET和CEC產(chǎn)生過多，它們在哮喘發(fā)病機制中占有重要地位，而且血漿ET和CEC水平可能與哮喘病情相關(guān)。主題詞哮喘；一氧化氮；內(nèi)皮縮血管肽類；內(nèi)皮；細胞；兒童；豚鼠 Roles of NO, ET and CEC in the pathogen

3、esis of asthmaJIANG Dong-Bo, LI Hua-Qiang, SHI Yuan, PAN Jie, SHEN Ji-Gao,YANG Ying-Bo, FENG Su-Zhen, LI Tian-Xing, XU You-QiDaping Hospital, and the Institute of Surgery. Third Military Medical College, Chongqing(400042)Abstract AIM:To investigate the roles of NO,endothelin(ET) and circulating endo

4、thelial cells (CEC) in the pathogenesis of asthma. METHODS：Plasma nitrite and nitrate (NO-2/NO-3), ET, cGMP and CEC levels in 61 asthmatic children and 40 matched normal children were examined. In addition, the plasma and bronchoalveolar lavege fluid (BALF) NO-2/NO-3, ET, cGMP and CEC levels in guin

5、ea-pigs with allergic asthma were determined.RESULTS：Asthmatic children had increased amounts of NO-2/NO-3, cGMP and CEC compared with normal control subjects (P0.05, P0.01).Among them, 15 severe asthmatic children had significantly higher levels of ET than normal subjects (P0.01). Elevations of NO-

6、2/NO-3 were correlated with cGMP and CEC(P0.05,P0.01). Guinea-pigs with allergic asthma had increased amounts of NO-2/NO-3,ET and cGMP in BALF than normal control subjects (P0.01),so did cGMP and CEC in plasms(P0.05). Glucocorticoid may have reduced NO-2/NO-3, ET, cGMP and CEC contents and even have

7、 therapeutic effects.CONCLUSIONS：There were increased production of NO-2/NO-3, ET, and CEC in asthma, they may play an important roles in the pathogenesis of asthma. ET and CEC may be useful in forecasting the severity of illness.MeSHAsthma; Nitric oxide; Endothelins; Endothelium; Cells; Child;Guine

8、a-pigs肺臟能釋放內(nèi)皮依賴性舒張因子(endothelium derived relaxing factor, EDRF)及內(nèi)皮依賴性收縮因子(endothelium derived contracting factor,EDCF)，二者的動態(tài)平衡對于維持正常的氣道張力及肺血管張力非常重要。目前已知：一氧化氮(nitric oxide, NO)是EDRF的主要活性成分，而內(nèi)皮素(endothelin, ET)是EDCF的主要活性成分之一。NO具有血管及支氣管舒張作用1，ET是強烈的血管及支氣管收縮劑2。故我們推測NO及ET在支氣管哮喘中可能具有重要的發(fā)病學(xué)意義。本文旨在測定正常兒童，支氣管

9、哮喘患兒血漿NO、ET、cGMP及循環(huán)內(nèi)皮細胞(circulating endothelial cells, CEC)水平，并在動物模型上進行驗證，探討NO及ET在哮喘發(fā)病機理中的作用。對象和方法一、研究對象及分組處理：(一)臨床研究：1.對照組：健康兒童共40名，210歲(平均4.6歲)，其中男22名，女18名。均無哮喘病史，采血前4周內(nèi)無感染及用藥史。2.哮喘組：確診為支氣管哮喘的本院住院患兒，均為急性發(fā)作期病人，輕中度哮喘46例，重度哮喘(哮喘持續(xù)狀態(tài))15例，共61例，其中男37例，女24例，年齡112歲(平均4.9歲)。住院次晨采外周靜脈血樣待測。(二)動物實驗研究：體重為20025

10、0 g健康幼年豚鼠24只 ，雌雄各半，隨機分為3組，每組8只。1.哮喘組：用10%卵白蛋白腹腔注射1.0mL致敏動物，2周后用1%卵白蛋白超聲霧化吸入致其哮喘發(fā)作，出現(xiàn)喘息，呼吸困難和紫紺等。隔日誘喘1次，共10次，末次后于15min內(nèi)采心臟血樣品并摘取動物肺臟行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)67mL，置4 3 000 r/min離心10min后，取上清液待測。2.哮喘+氫化可的松組：誘喘方法同上，在每次誘喘前腹腔注射氫化可的松0.5mg/100g。3.對照組：用生理鹽水(normal saline, NS)做對照，方法同哮喘組。二、檢測方法：(一)NO水平測定：NO-2/N

11、O-3是NO的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，是反映NO產(chǎn)生水平的良好指標(biāo)。檢測其濃度以代表NO水平3。(二)ET及cGMP水平測定：采用特異性放射免疫分析法測定(試劑盒分別由解放軍總醫(yī)院及上海醫(yī)科大學(xué)提供)，按說明書要求操作。(三)CEC水平測定：見參考文獻4。三、統(tǒng)計處理：結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(<"x-108 (98 bytes)" src="/med/cano/201003/20100310174315249" 12 16>±s)表示，哮喘患兒組間比較用t檢驗；動物實驗結(jié)果行方差分析，組間q檢驗或t檢驗作統(tǒng)計處理，并做直線相關(guān)分析。結(jié)果

12、一、輕中度哮喘患兒血漿NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC水平：輕中度哮喘患兒血漿NO-2/NO-3、cGMP和CEC水平均顯著高于正常兒童(P0.050.01)，而ET水平與健康兒童比較無明顯差異(P0.05)(見表1)。二、重度哮喘患兒血漿NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC水平：重度哮喘患兒血漿NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC水平均顯著高于正常兒童(P0.01)，且NO-2/NO-3、ET及CEC水平明顯高于輕中度哮喘患兒(P0.01)，而cGMP水平在重度與輕中度哮喘患兒之間比較無明顯差異(P0.05)(見表1)。表1哮喘患兒血漿NO-2/NO-3、ET、cGMP

13、及CEC水平Tab 1 Levels of NO-2/NO-3,ET,cGMP and CEC in the plasma of asthmatic children (<"x-109 (98 bytes)" src="/med/cano/201003/20100310174315626" 12 16>±s)nNO-2/NO-3(mol/L)ET(ng/L)cGMP(nmol/L)CEC(0.9 L-1)Control4029.8±4.610.2±2.14.72±0.255.56±0.20Mi

14、ld asthma4632.7±5.8*10.4±3.16.23±0.22*11.24±1.59*Severe asthma15105.1±7.1*25.9±3.6*6.36±0.23*16.87±1.25*     *P0.05, *P0.01,vs control； P0.01, vs mild asthma 三、哮喘豚鼠血漿NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC水平：哮喘豚鼠血漿NO-2/NO-3、ET水平與對照組和哮喘+氫化可的松組比較差異均無顯著性(P均0.05

15、)；哮喘組cGMP水平明顯高于對照組(P0.05)，哮喘+氫化可的松組cGMP水平同對照組比較差異無顯著(P0.05)，但明顯低于哮喘組(P0.05)；哮喘組CEC水平明顯高于對照組和哮喘+氫化可的松組(P均0.05)，而后二者比較差異無顯著性(P0.05)(見表2)。表2過敏性哮喘豚鼠血漿和支氣管肺泡灌洗液中NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC水平Tab 2 Levels of NO-2/NO-3,ET, cGMP and CEC in the plasma and BALF(bronchoalveolar lavage fluid) of guingea-pigs with alle

16、rgic asthma (<"x-110 (98 bytes)" src="/med/cano/201003/20100310174315935" 12 16>±s)nNO-2/NO-3(mol/L)ET(ng/L)cGMP(nmol/L)CEC(0.9 L-1)Control8PlasmaBALF22.6±2.76.2±0.81.10±0.211.27±0.332.20±0.041.42±0.152.4±0.8Asthma8PlasmaBALF21.6±

17、;2.310.2±1.3*1.26±0.295.05±0.59*3.54±0.06*3.09±0.11*4.3±1.2*Asthma+glucocorticoid8PlasmaBALF21.4±2.87.2±1.11.14±0.232.36±0.272.18±0.041.50±0.092.5±0.9     P0.05,P0.01, vs control; P0.05,P0.01, vs asthma 四、哮喘豚鼠支氣管肺泡灌

18、洗液(BALF)NO-2/NO-3、ET和cGMP水平：哮喘豚鼠BALF中NO-2/NO-3、ET和cGMP水平明顯高于對照組(P均0.01)和哮喘+氫化可的松組(P均0.01)，而后二者比較差異無顯著(P均0.05)(見表2)。五、直線相關(guān)分析：哮喘患兒血漿NO-2/NO-3與cGMP及CEC水平呈顯著正相關(guān)(r分別為0.401；0.391，P分別0.01，0.05)；而NO-2/NO-3與ET水平之間無顯著相關(guān)(r=0.043,P0.05)。哮喘豚鼠BALF中NO-2/NO-3水平與cGMP呈顯著正相關(guān)(r=0.862,P0.01)；BALF中NO-2/NO-3水平與CEC水平亦呈顯著正相

19、關(guān)(r=0.796,P0.05)；NO-2/NO-3與ET水平無顯著相關(guān)(r=0.516,P0.05)。Hamid等5報道哮喘氣道誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)增多，功能活躍，推測哮喘時NO產(chǎn)生應(yīng)增多，但目前未見類似報道。僅Kharitonov等6發(fā)現(xiàn)哮喘患者呼出的NO增加。本實驗觀察到哮喘患兒血漿NO-2/NO-3水平升高；過敏性哮喘豚鼠BALF中水平亦顯著升高。越來越多的證據(jù)表明NO是非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)(NANC)的遞質(zhì)之一。氣道神經(jīng)中NO釋放數(shù)量增多對哮喘患者可能是有益的，但氣道神經(jīng)釋放的NO是由結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS)合成的，而在哮喘時cNOS可能存在功能上的缺陷7。iNO

20、S在細胞因子等誘導(dǎo)下可產(chǎn)生大量NO。NO在哮喘時升高的機制尚不清楚，可能與巨噬細胞激活，炎癥刺激及細胞因子釋放有關(guān)。NO的過多生成對機體是有害的，它可引起哮喘患者氣道充血，加重血漿滲漏，造成肺上皮細胞及組織損傷，引起氣道高反應(yīng)性(AHR)7而導(dǎo)致或(和)加重哮喘。本研究還發(fā)現(xiàn)輕中度哮喘患兒血漿ET水平無明顯變化，而重度哮喘患兒則明顯升高，且過敏性哮喘豚鼠BALF中也明顯升高。其原因可能有：(一)肺臟是體內(nèi)循環(huán)ET清除和代謝的主要器官，在輕中度哮喘時能及時清除多余的ET，而在重度哮喘時肺組織生成和釋放ET增多，但清除ET減少；(二)重度哮喘時機體極度缺血、缺氧、CO2潴留可促進全身血管內(nèi)皮細胞等

21、產(chǎn)生大量的ET8。ET乃是機體在嚴(yán)重缺血、缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生的一種內(nèi)源性致傷因子，從而加重機體的缺血、缺氧，導(dǎo)致惡性循環(huán)，甚至哮喘性呼吸衰竭。故血漿ET水平可作為判斷哮喘病情的一項生化指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)CEC水平在哮喘患兒及過敏性哮喘豚鼠均顯著升高。CEC水平是目前活體內(nèi)唯一可以特異而直接反映血管內(nèi)皮細胞損傷的指標(biāo)4。說明哮喘時存在血管內(nèi)皮細胞的損傷、脫落。我們發(fā)現(xiàn)CEC水平與NO-2/NO-3水平呈顯著正相關(guān)。說明NO在哮喘血管內(nèi)皮細胞損傷中可能起一定作用。重度哮喘患兒CEC水平明顯高于輕中度哮喘患兒，說明CEC水平同病情可能相關(guān)。另外NO可導(dǎo)致cGMP升高，哮喘時cGMP的升高可導(dǎo)致肥大細胞脫

22、顆粒，釋放大量遞質(zhì)而致哮喘發(fā)作。本實驗還發(fā)現(xiàn)哮喘+氫化可的松組豚鼠BALF中NO-2/NO-3、ET、cGMP和血漿cGMP、CEC水平明顯低于哮喘組，與對照組無顯著差異。說明氫化可的松可抑制哮喘時NO-2/NO-3、ET、cGMP及CEC的產(chǎn)生。其機制可能在于：抑制iNOS的生成及活性(cNOS無作用)；抑制ET mRNA的基因轉(zhuǎn)錄，且對ET活性有直接抑制作用8。作者單位：第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院，野戰(zhàn)外科研究所(重慶 400042)參考文獻1Belvisi MG, Stretton CD, Barnes PJ. Nitric oxide is the endogenous neurotransmitter of bronchodilator nerves i