全自動的HPV核酸檢測新技術新項目申報表

1、附件 1:大理州醫(yī)療衛(wèi)生新技術新項目申報表大理州衛(wèi)生和計劃生育委員會制、項目基本情況申報單位項目名稱完成科室.完成人姓名..9.領先地位國內口省內口州內口項目分類基礎醫(yī)學口藥學口臨床醫(yī)學口預防醫(yī)學與衛(wèi)生學口中醫(yī)學與中藥學口項目起止時間年月-年月項目開展科室意見：項目開展協(xié)同科室意見：蓋章蓋章年月日年月日單位審核意見：縣市衛(wèi)計局審核意見：蓋章蓋章年月日年月日、項目詳細內容項目完成人基本情況姓名技術職稱工作單位參加項目時間承擔責任與分工聯(lián)系人：聯(lián)系電話：項目綜述(主要技術內容、特點、開展情況、效益和價值、起止時間，應用數(shù)量、應用情況、參考文獻等內容?？闪砀?/p>

2、頁。)1.主要技木內容：本項目用于體外定性檢測女性宮頸脫落上皮細胞樣本中 24種基因型(6,11,16,18,31,33,35,39,42,43,44,45,51,52,53,56,58,59,66,68,73,81,82,83)人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus,HPV)的核酸。 并可鑒別病毒基因亞型。采用 PCR 體外擴增和 DNA 反向斑點雜交法相結合的 DNA 芯片技術，檢測 24 種人乳頭瘤病毒核酸亞型。本項目中采用北京博暉生產的 HPV 核酸檢測試劑盒和核酸芯片檢測儀（型號 BHF-VI）配套使用。將待測樣本加入到 HPV檢測芯片加樣孔后，在微泵的驅動下，分別進行

3、目的 DNA 的提取、針對目的 DNA 進行的 PCR 擴增和反向斑點雜交。根據 HPV 特定基因設計的特異性引物， 可以擴增由 24 種 HPV 基因型的目的片段， 儀器將擴增產物轉移到芯片的檢測區(qū)，在檢測區(qū)雜交膜上包被有 HPV24 種亞型的檢測探針，如果擴增產物中含有目的基因則能夠被芯片上的探針捕獲，再加入酶液和顯色液后在雜交膜的特定位置由現(xiàn)藍色的斑點，可判斷由感染人乳頭瘤病毒核酸及感染的亞型，如果不含目的基因，則在特定的位置不會由現(xiàn)藍色斑點。項目檢測原理：PCR 體外擴增和 DNA 反相斑點雜交法相結合的 DNA 芯片技術；檢測情況：全部手工操作僅需 2 分鐘，全自動分子檢測平臺，一鍵

4、式操作，完成“從樣本到結果”的全程檢測；DNA矩陣與微流控芯片產品一體化，真正實現(xiàn)了核酸提取、純化、擴增和基因分型檢測的全程自動化；每個測試平均耗用時間：12 分鐘/人份；通量：4-24通道；樣本量：宮頸脫落細胞，200ul;可以實現(xiàn)：一個樣本，多重檢測，24 亞型：18 種高危型，6 種低危型對高危16、18 亞型進行加強，防止漏檢。18 種高危 16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、型 56、58、59、66、68、73、82、836 種低危 6、11、42、43、44、81型2 特點該項目應用反向斑點雜交 PCR 方法， 快速靈敏檢測 HPV24 種亞型分型檢測。一

5、臺芯片控制儀+一次性試劑盒+一次性芯片，實現(xiàn)了全部分子診斷實驗室的功能，節(jié)省了實驗室空間，降低了分子診斷的應用門檻。多重檢測，精確分型，便于對患者進行分層管理。采用世界上獨特的微流控技術進行基因分型檢測。操作者無需專業(yè)知識，只要將芯片、樣本和試劑盒置于控制儀內，檢測過程全自動一鍵操作。無需專業(yè)培訓即可上手。a.檢測時全封閉，在整個檢測過程中，樣本、核酸、檢測用試劑和廢液均封閉保留在芯片內；極大減少了生物廢物污染；從開始檢測到結束，控制器一直關閉，最大限度避免了內/外界污染；b.三維運動系統(tǒng)：X、Y、Z 軸在運動范圍內誤差不超過土 0.25mm；c.信息采集：全自動攝像進行結果采集；d.檢測限：

6、能穩(wěn)定檢由的 HPV 的病原體最小拷貝數(shù)為 1000copies/ml;e.質控：球蛋白（GB 點）質控樣本的采集及核酸提取過程，SP點質控反向雜交過程，在全自動檢測的條件下保證了結果的可追溯性。f.數(shù)據管理：樣品管上的條形碼可被芯片控制儀自動識別，連接醫(yī)院 LIS 系統(tǒng)，輕松實現(xiàn)檢測結果的自動化存儲與調用。g.降低人員要求，只需在實驗前進行槍頭檢查，試劑、芯片、樣本倉的安放即可。3 .開展情況4 .效益和價值a.HPV 檢測作為初篩手段可濃縮高風險人群，比通常采用的細胞學檢測更有效。對細胞學和 HPV 檢測均為陰性者，可將篩查間隔延長到 3-5 年。細胞學陰性而高危型 HPV 陽性者，應定期

7、隨訪。如間隔一到兩年，前后兩次 HPV 檢測為同一高危HPV 型別，則可以界定為是高危 HPV 持續(xù)感染，該人群需進行密切隨訪和診治。b,對于未明確診斷意義的不典型鱗狀細胞（ASC-US）和鱗狀上皮內低度病變（LSIL）的分層管理，HPV 檢測是一種有效的再分類方法。NCCN子宮頸癌篩查臨床實踐指南（源自英文版 V1.2009 脂由：對發(fā)生在成年人的 ASC-US 和 LSIL 有 3 個可供選擇的處理方案，可選擇 HPV-DNA 檢測將患者分流、6 個月復查細胞學或立即陰道鏡檢查。可以減少陰道鏡過度診治。而重復的細胞學檢查，依然會有 25%失訪率。采用 HPV 檢測將患者分流是很好的風險管控

8、路徑。c.HPV 分型檢測可以用于陰道鏡適應癥。2009 年，美國陰道鏡和宮頸病理學會 （簡稱 ASCCP） 發(fā)布了 HPV 基因分型檢測指南， 明確指由：30 婦女，細胞學未見上皮內病變和惡性細胞，HPV16,18 陽性建議陰道鏡； 其他 HPV 高危型陽性， 則在 12 個月后重復 HPVDNA 檢測和細胞學檢查。d.用于手術后的追蹤，治療后的隨訪，提供給病人和醫(yī)生豐富的臨床信息。消融或切除治療后6個月HPV檢測鑒別復發(fā)和持續(xù)性CIN的敏感性達90%,而且保持這種水平到 24 個月。與此相比，細胞學的敏感性大約為 70%o在治療或手術前先進行一次 HPV 分型檢測，術后或治療后的 6 個月

9、再行 HPV 分型檢測。e.通過對 HPV 基因分型檢測，可以將不同 HPV 型別感染與宮頸病變的關系研究的更深入，同時還可應用到 HPV 分子流行病學的研究中。HPV 感染基因型和宮頸病變的級別存在一定關系，表明各個型別對宮頸上皮致病力不同。研究表明，HPV的多重感染與宮頸癌之間，不存在顯著性的關系。對于在 CIN2 以上高級別病變中，多重感染并不常見，而以單一感染為主。HPV 感染除了可以導致宮頸癌之外，還可導致其他癌癥。f.指導 HPV 疫苗的研究及使用。g.可用于對宮頸癌治療方法選擇的研究。5.起止時間6.應用數(shù)量7.應用情況8.殄英文獻：1. Berkhof,J.,deBruijne

10、,M.C.,Zielinski,G.D.,Meijer,C.J.,2005.Naturalhistoryandscreeningmodelforhigh-riskhumanpapillomavirusinfection,neoplasiaandcervicalcancerinTheNetherlands.Int.J.Cancer115,268275.2. vandenBrule,A.J.,Pol,R.,Fransen-Daalmeijer,N.,Schouls,L.M.,Meijer,C.J.,Snijders,P.J.,2002.GP5+/6+PCRfollowedbyreverseline

11、blotanalysisenablesrapidandhigh-throughputidentificationofhumanpapillomavirusgenotypes.J.Clin.Microbiol.40,779-787.3. 趙銀鈴，耿曉星.高危 HPV 檢測在宮頸癌篩查防治及判斷預后中的意義J.實用腫瘤學雜志.2008,22(5),497.同類技術之比較微流控芯片法雜父捕狀法導流雜交檢測特點1.占地面積?。簩⑷齾^(qū)或四區(qū)的PCR實驗室整合于一個芯片上，整個操作臺只需要/、到2平米的面積。1.手工操作繁瑣，會造成交叉污染。2.只檢測13種高危，不具體分型，且不包含中國人常見的型1.全手

12、工操作，工序繁瑣，容易造成交叉污染2.不能監(jiān)控采樣效果3.人力物力消耗大。2.操作簡單：DNA提取、擴增和雜交均在同一封閉芯片上進行。3.所有的廢液均排放與芯片中的廢液池中，一方面可避免氣溶膠污染，另一方面可減少醫(yī)用垃圾的二次污染。4.全自動封閉系統(tǒng)，人為零干預，樣本進，結果出05.磁珠提取法，純度局 , 不 容 易 發(fā) 生PCR卬制反應導致假陰性。6.人力物力消耗少。7.防 污 染 ： 加 入UNGB,可防止假陽性。實驗人員要求無特殊要求，大即可上崗別。3.成本大。4.人力物力消耗大。5.廢液造成醫(yī)療廢物污染。6.對抗體捕獲信號的放大，假陰性率局；交叉污染，易誤判。4.廢液造成醫(yī)療廢物污染。

13、5.占地回積大： 需要嚴格的三區(qū)或四區(qū)PCR實驗室06.煮沸法提取DNA,純度不高，會導致假陰性的出現(xiàn)。7.無防污染體系。1.培訓時間長，一周左右才可1.需要PCR上崗證。實驗流程時間1.磁珠提取時間：1h2.擴增：1.5h3.雜交時間：1h儀器不間斷操作，全程時間/、到4h既可完成。后期維護1,用84擦拭儀器。2.紫外線定期照射消毒上崗操作。2.實驗人員實驗操作經驗要求Mi。2.學習時間長，需要一周左右時間才可上崗。3.實驗結果判讀需要豐曷操作經驗，否則會出現(xiàn)人為判讀錯誤現(xiàn)象。4.對操作人員要求較高，否則會產生交叉污染。1.裂解時間：45min2.雜交：1h3.捕狀：1h4.信號放大：30min5.化學發(fā)光檢測：15min由于是手工操作，全程時間為5h左右。1.煮沸法DNA提?。?.5h2.擴增：2h3.雜交：1h由于人工操作誤差，則全程時間約為56h1.84消毒液擦拭所有儀器和移液槍進行消毒。2,酒精擦拭操作臺面。3.每天紫外線1.84消毒液擦拭所有儀器和移液槍進行消毒。2,酒精擦拭操作臺面。3.每天紫外線照射進行消毒。4.定期通風，防止氣溶膠污染。照射進行消毒。4.定期通風，防止氣溶膠污染。科學依據和解決的關鍵技術問題細胞學和 HPV 聯(lián)合篩查做為推薦篩查方案，但存在 TCT 檢測專業(yè)人員缺乏，同時缺乏專業(yè) PCR 實驗室的困難，在基層醫(yī)院尤其突生。博暉微流