高效液相實驗報告

1、篇一 ： 高效液相色譜實驗報告高效液相色譜實驗報告一 、 實驗?zāi)康? 了解液相色譜的發(fā)展歷史及最新進展2 學(xué)習液相色譜的基本構(gòu)造及原理3 掌握液相色譜的操作方法和分析方法， 能夠通過hplc 分離測定來對目標化合物的分析鑒定。二 、 實驗原理液相色譜法采用液體作為流動相 ， 利用物質(zhì)在兩相中的吸附或分配系數(shù)的微小差異達到分離的目的 。 當兩相做相對移動時， 被測物質(zhì)在兩相之間進行反復(fù)多次的質(zhì)量交換 ， 使溶質(zhì)間微小的性質(zhì)差異產(chǎn)生放大的效果， 達到分離分析和測定的目的 。 液相色譜與氣相色譜相比， 最大的優(yōu)點是可以分離不可揮發(fā)而具有一定溶解性的物質(zhì)或受熱后不穩(wěn)定的物質(zhì)， 這類物質(zhì)在已知化合物中占

2、有相當大的比例 ， 這也確定了液相色譜在應(yīng)用領(lǐng)域中的地位。高效液相色譜可分析低分子量、 低沸點的有機化合物 ， 更多適用于分析中 、 高分子量 、 高沸點及熱穩(wěn)定性差的有機化合物 。 80%的有機化合物都可以用高效液相色譜分析， 目前以已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物工程、 制藥工程 、 食品工業(yè) 、 環(huán)境檢測 、 石油化工等行業(yè)。三 、 高效液相色譜的分類吸附色譜法、 分配色譜法、 空間排阻色譜法、 離子交換色譜法、 親和色譜法、 化學(xué)鍵合相色譜法四 、 高效液相色譜儀的基本構(gòu)造高效液相色譜至少包括輸液系統(tǒng)、 進樣器 、 分離柱 、 檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等幾部分。 1 輸液系統(tǒng) ：包括貯液及脫氣裝置、 高

3、壓輸液泵和梯度洗脫裝置。 貯液裝置用于存貯足夠量、 符合 hplc 要求的流動相 。 高效液相色譜柱填料顆粒比較小 ， 通過柱子的流動相受到的流動阻力很大， 因此需要高壓泵輸送流動相 。 2 進樣系統(tǒng) ：將待測的樣品引入到色譜柱的裝置。 液相色譜進樣裝置需要滿足重復(fù)性好、 死體積小 、 保證柱中心進樣 、 進樣時引起的流量波動小 、 便于實現(xiàn)自動化等多項要求。 進樣系統(tǒng)包括取樣、 進樣兩項功能 。 3 分離柱 ：色譜柱是色譜儀的心臟、 柱效高 、 選擇性好 、 分析速度快是對色譜柱的一般要求。 商品化的hplc 微粒填料， 如硅膠和以硅膠為基質(zhì)的鍵合相 、 氧化鋁 、 有機聚合物微球（ 包括離

4、子交換樹脂）等的粒度通常在 3 dm、5 dm、7 dm、以及10 dm。采用的固定相粒度甚至可以達到1dm,而制備色譜所采用的固定相粒度通常大于10 dm。hplc填充柱效的理論值可以達到50000/m160000/m 理論板，一般采用100-300mm 的柱長可滿足大多數(shù)樣品的分析的需要。 由于柱效內(nèi) 、 外多種因素的影響， 因此為使色譜柱達到其應(yīng)有的效率。 應(yīng)盡量的減小系統(tǒng)的死體積 。 4 檢測系統(tǒng) ：hplc 檢測器分為通用型檢測器和專用型檢測器兩類 。 通用型檢測器可連續(xù)測量色譜柱流出物（ 包括流動相和樣品組分） 的全部特性變化 。 這類檢測儀器包括示差折光檢測器、 介電常數(shù)檢測器

5、、 電導(dǎo)檢測器和磁光旋轉(zhuǎn)檢測器。 這類檢測器適用范圍廣 ， 但是對于流動相有響應(yīng)， 受溫度變化 、 流動相流速和組成變化的影響 ， 檢測靈敏度低 ， 不能用于梯度洗脫的分離模式。 專用型檢測器對樣品中組分的某種物理或化學(xué)性質(zhì)敏感， 可用于測量被分離組分某類特性的變化 。這類檢測器包括紫外檢測器、 熒光檢測器 、 質(zhì)譜檢測器 、 放射性檢測器 。 5 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可以分為數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和專用智能處理系統(tǒng)兩類， 前者可以完成一般的色譜數(shù)據(jù)處理任務(wù) ， 有些軟件可以實現(xiàn)部分儀器的控制功能。 前者即一般的色譜工作站 ， 后者通常稱之為專家系統(tǒng)。五 、 實驗數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)一 ： 數(shù)據(jù)二 ：11 h

6、 p 1 c 1六 、 高效液相色譜的使用中的注意事項流動相 ：1 . 、 流動相應(yīng)選用色譜純試劑 、 高純水或雙蒸水， 酸堿液及緩沖液需經(jīng)過濾后使用 ， 過濾時注意區(qū)分水系膜和油系膜的使用范圍 ；2 、 水相流動相需經(jīng)常更換（ 一般不超過2 天 ）， 防止長菌變質(zhì)； 樣品 ：1 、 采用過濾或離心方法處理樣品 ， 確保樣品中不含固體顆粒 ；2 、 用流動相或比流動相弱 （ 若為反相柱， 則極性比流動相大； 若為正相柱 ， 則極性比流動相小 ） 的溶劑制備樣品溶液， 盡量用流動相制備樣品液；手動進樣時，進樣量盡量小，使用定量管定量時，進樣體積應(yīng)為定量管的35倍；色譜柱：1 、 使用前仔細閱讀色

7、譜柱附帶的說明書 ， 注意適用范圍 ， 如 ph 值范圍 、 流動相類型等；2 、 使用符合要求的流動相 ； 3 、 使用保護柱 ；4 、 如所用流動相為含鹽流動相 ， 反相色譜柱使用后 ， 先用水或低濃度甲醇水（ 如 5 甲醇水溶液 ）， 再用甲醇沖洗。5 、 色譜柱在不使用時， 應(yīng)用甲醇沖洗， 取下后緊密封閉兩端保存； 6 、 不要高壓沖洗柱子；7 、 不要在高溫下長時間使用硅膠鍵合相色譜柱； 篇二 ： 分析實驗報告高效液相色譜華南師范大學(xué)實驗報告學(xué)號 ： 專業(yè) ： 年級班級 ： 課程名稱 ： 儀器分析實驗實驗項目 ： 液相色譜分析混合樣品中的苯和甲苯實驗時間 ：一 、 實驗?zāi)康?:1 、

8、 掌握高效液相色譜定性和定量分析的原理及方法 2 、 了解高效液相色譜的構(gòu)造、 原理及操作技術(shù) 二 、 實驗原理 :高效液相色譜法： 以液體作為流動相的色譜法。 它是在經(jīng)典液相色譜實驗基礎(chǔ)上， 引入氣相色譜的理論 ， 在技術(shù)上采用高壓輸液泵， 高效固定相和高靈敏的檢測器， 而發(fā)展起來的快速分離分析技術(shù) 。 具有分離效能高 ， 檢出限低 ， 操作自動化和應(yīng)用范圍廣的特點 。其基本原理： 利用欲分配的諸組分在固定相和流動相間的分配有差異（ 即由不同的分配系數(shù) ）， 當兩相做相對運動時， 這些組分在此兩相中分配反復(fù)進行， 從幾千次到百萬次， 即使組分的分配系數(shù)只有微小差異， 隨著液體流動相卻可以有明

9、顯的差異， 最后使這些組分都得到分離， 通過檢測器時， 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀。 三、 儀器和試劑 :1.主要儀器：島津液相色譜儀（lc-10at）配有紫外檢測phenomenexo 柱;10科1微量注射器 2 、 試劑 ： 甲醇 、 水苯和甲苯混合待測溶液苯標準溶液：2.0科l/ml甲苯標準溶液：2.0科l/ml苯、甲苯混合標準溶液：1.0科l/ml、2.0科l/ml、5.0科l/ml、10.0科l/ml 四、實驗步驟1 、 按操作規(guī)程開機。2 、 . 選擇合適的流動相配比 ， 優(yōu)化色譜條件通過調(diào)節(jié)溶劑甲醇和水的混合比例 ， 從而來優(yōu)化色譜調(diào)劑 。調(diào)好最佳色譜條件， 控制流速為

10、1ml/min 。 柱溫 30 ， 檢測波長 354nm 3 、 苯 、 甲苯定性分析在最佳條件下，待基線走穩(wěn)后，用10 dl微量注射器分別進樣10 "苯和 甲 苯混合待測溶 液，10 "苯標準溶液（2.0科l/ml ）和10 dl甲苯標準溶液（2.0科l/ml ）（微量注射器用甲 醇潤洗35遍），觀察并記錄色譜圖上顯示的保留時間，確定苯和甲苯的峰。4、苯、甲苯定量分析在最佳條件下，待基線走穩(wěn)后，用10 dl微量注射器分別進樣1.0科l/ml、2.0科l/ml、5.0 “/ml 10.0“/ml的苯和甲苯混合標準溶液10”。觀察并記錄各色譜圖上的保留時間和峰面積 。 繪制苯

11、和甲苯混合標準溶液峰面積與相應(yīng)濃度的標準曲線5 、 苯和甲苯混合待測溶液分析根據(jù)得到的苯和甲苯混合待測溶液的液相色譜圖上顯示的峰面積值， 從繪制的標準曲線上查出苯和甲苯混合待測溶液中苯和甲苯的各自的濃度。 六 、 實驗數(shù)據(jù)處理及分析1 、 色譜條件優(yōu)化2.00色譜 1.75 70% 1.50 1.251.00 0.75 0.50 0.250.00 min分析 ： 本次實驗分別選擇了甲醇： 水=60% ： 40%， 70% ： 30%， 80% ： 20%的溶劑配比 ， 通過比較不同溶劑配比條件下， 甲苯和苯的峰寬 、 保留時間從而確定采用甲醇： 水=80% ： 20%作為本次實驗的最佳色譜條件

12、。 2 、 定性分析5.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0-0.5min分析 ： 在同一色譜操作條件和進樣量下， 分別測定試樣溶液中苯和甲苯組分及已知苯和甲苯純物質(zhì)的保留時間 ， 并將其色譜峰、 保留時間與對應(yīng)的已知苯和甲苯純物質(zhì)進行比較， 兩者基本相同 ， 從而確定混合樣品中含有苯和甲苯。 3 、 定量分析苯 、 甲苯混合標準溶液濃度分別為 ： 1 ul/ml, 2 ul/ml, 5 ul/ml, 10 ul/ml。4 、 未知樣品濃度七 、 結(jié)果討論1 、 實驗中為什么采用標準曲線法作為定量的方法 ？答： 因為實驗中待測溶液的組分只有苯和甲苯兩種物質(zhì)， 組分比較

13、簡單 。 只要在實驗過程中 ，嚴格控制且定量進樣， 就能采用操作、 計算簡便的標準曲線法得出準確的實驗結(jié)果。 若采用歸一化法或內(nèi)標法， 雖然能得到準確更高的實驗結(jié)果， 但由于實驗操作、 計算復(fù)雜 ， 不能快速分析， 故實驗中采用標準曲線法作為定量的方法 。2 在選擇溶劑時， 溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。采用正相液- 液分配分離時： 首先選擇中等極性溶劑 ， 若組分的保留時間太短 ， 降低溶劑極性， 反之增加 。 也可在低極性溶劑中 ， 逐漸增加其中的極性溶劑 ， 使保留時間縮短。 3 選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題（ 1 ） 盡量使用高純度試劑作流動相 ， 防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測

14、器噪聲增加。（ 2 ） 避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子 。 如使固定液溶解流失； 酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（ 3 ） 試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度， 防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（ 4 ） 流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。 當使用紫外檢測器時， 流動相不應(yīng)有紫外吸收。4 影響分離的因素與提高柱效的途徑1 ） 液體的黏度比氣體大一百倍， 密度為氣體的一千倍， 故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑， 降低固定相粒度可提高柱效。2 ） 液相色譜中 ， 不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)；（ 恒溫 ） 3 ） 改變淋洗液組成、 極性是改善分離的最直接的因素。 5. 高效液相色譜與氣相色譜的

15、主要區(qū)別可歸結(jié)于以下幾點 ：（1） 進樣方式的不同 ： 高效液相色譜只要將樣品制成溶液， 而氣相色譜需加熱氣化或裂解；（2） 流動相不同 ， 在被測組分與流動相之間 、 流動相與固定相之間都存在著一定的相互作用力；（3） 由于液體的粘度較氣體大兩個數(shù)量級， 使被測組分在液體流動相中的擴散系數(shù)比在氣體流動相中約小45 個數(shù)量級 ；（4） 由于流動相的化學(xué)成分可進行廣泛選擇， 并可配置成二元或多元體系 ， 滿足梯度洗脫的需要， 因而提高了高效液相色譜的分辨率(柱效能 )；（5） 高效液相色譜采用 510lm 細顆粒固定相 ， 使流體相在色譜柱上滲透性大大縮篇三 ： 高效液相實驗報告化學(xué)與環(huán)境化學(xué)科

16、學(xué)學(xué)院分析化學(xué) 駱洪偉 20144015016高效液相實驗報告一、 實驗?zāi)康?. 了解高效液相的實驗原理。2. 學(xué)習并掌握高效液相色譜儀 (hplc) 的操作步驟 。二、 實驗原理高效液相色譜由儲液器， 泵 、 進樣器 、 色譜柱 、 檢測器 、 記錄儀等幾部分組成， 儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng)， 樣品溶液經(jīng)進樣器進入流動相 ， 被流動相載入色譜柱內(nèi) ， 由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)， 在兩相中作相對運動， 經(jīng)過反復(fù)多次的吸附解吸的分配過程， 各組分在移動速度上產(chǎn)生較大的差別 ， 被分離成單個組分依次從柱內(nèi)流出 ， 通過檢測器時， 樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號傳送到記錄儀。

17、三 、 hplc 的介紹及操作步驟高效液相色譜儀主要包括高壓輸送系統(tǒng)、 進樣系統(tǒng) 、 分離系統(tǒng) 、 檢測系統(tǒng) 、 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及梯度洗脫等輔助裝置。 其工作流程如圖 1 所示 。 1. 高壓輸液系統(tǒng)高壓進樣系統(tǒng)的作用是提供足夠恒定的高壓， 使流動相以穩(wěn)定的流量快速滲透通過固定相 。 高壓輸液系統(tǒng)由貯液器、 高壓泵 、 過濾器和梯度洗脫裝置組成 ， 其核心部件是高壓泵， 要求高壓泵具有輸出壓力(1.5 X 1074.5 x 107pa),輸出流量恒定(精度0.1ml min-1),流量設(shè)定范圍可調(diào) 。 梯度洗脫裝置的作用是在分離過程中 ， 按一定程序連續(xù)改變流動相中多種不同性質(zhì)溶劑的配比 ， 以

18、改變流動相的極性、 離子強度或酸度等， 從而提高試樣的分離效率 ， 縮短分析時間 ， 使色譜峰形得到改善， 提高測定的靈敏度和定量的準確度 。 此外 ， 還附有加熱脫氣、 超聲波脫氣等裝置， 以排除溶解在流動相或試樣中的氣體 。3. 進樣系統(tǒng)在高效液相色譜中 ， 一般采用旋轉(zhuǎn)式六通閥于高壓下進樣。 采用旋轉(zhuǎn)式六通閥進樣的優(yōu)點是進樣量可變范圍大， 耐高壓 ， 宜于進樣自動化 ， 但易造成色譜峰柱前擴展。4. 分離系統(tǒng)液相色譜柱一般采用內(nèi)壁拋光的優(yōu)質(zhì)不銹鋼管或厚壁玻璃管。 為使工作壓力不致過高 ， 柱長都比較短，一般在530cm,柱徑為45mm=柱子的填充取決于柱填料的性能，對于生物膠或離子交換樹

19、脂等， 因遇到溶劑會膨脹， 所以必須采用勻漿濕法填充。 為防止顆粒大的填料先沉降而產(chǎn)生分層現(xiàn)象， 可采用等密度溶劑 ( 四氯乙烷和四氯乙烯混合物 ) 配成勻漿 。 用高壓泵將其快速壓入裝有流動相的色譜柱中 ， 經(jīng)沖洗后 ， 即可使用 。5. 檢測記錄系統(tǒng)高效液相色譜檢測器要求具有靈敏度高 、 噪聲低 、 線性范圍寬 、 響應(yīng)快 、 死體積小等特點 ， 且對溫度和流量的變化不敏感。 目前 ， 液相色譜常用檢測器有紫外光度檢測器、 示差折光檢測器、 熒光檢測器和電化學(xué)檢測器等。6. hplc 操作步驟(1) 過濾流動相 ， 根據(jù)需要選擇不同的濾膜。(2) 對抽濾后的流動相進行超聲脫氣10-20 分

20、鐘 。(3) 打開 hplc 工作站 ( 包括計算機軟件和色譜儀)， 連接好流動相管道 ， 連接檢測系統(tǒng)。(4) 進入 hplc 控制界面主菜單， 點擊 manual ， 進入手動菜單 。(5) 有一段時間沒用 ， 或者換了新的流動相 ， 需要先沖洗泵和進樣閥 。 沖洗泵 ， 直接在泵的 出水口 ， 用針頭抽取。 沖洗進樣閥 ， 需要在 manual 菜單下 ， 先點擊 purge ， 再點擊start ,沖洗時速度不要超過10ml min-1 。(6) 調(diào)節(jié)流量 ， 初次使用新的流動相 ， 可以先試一下壓力 ， 流速越大 ， 壓力越大 ， 一般不要 超過 2000 。 點擊 injure ，

21、 選用合適的流速， 點擊 on ， 走基線 ， 觀察基線的情況。(7) 設(shè)計走樣方法。 點擊 file ， 選取 select?users?and?methods ， 可以選取現(xiàn)有的各種走樣方法。 若需建立一個新的方法， 點擊 new?method 。 選取需要的配件， 包括進樣閥 ，泵， 檢測器等 ， 根據(jù)需要而不同 。 選完后 ， 點擊 protocol 。 一個完整的走樣方法需要包括：a. 進樣前的穩(wěn)流， 一般 2-5 分鐘 ； b. 基線歸零 ； c. 進樣閥的 loading-inject 轉(zhuǎn)換 ； d. 走樣時間 ， 隨不同的樣品而不同 。(8) 進樣和進樣后操作。 選定走樣方法，

22、 點擊 start 。 進樣 ， 所有的樣品均需過濾 。 方法走完后 ， 點擊 postrun ， 可記錄數(shù)據(jù)和做標記等。 全部樣品走完后， 再用上面的方法走一段基線， 洗掉剩余物 。(9) 關(guān)機時 ， 先關(guān)計算機， 再關(guān)液相色譜。(10) 登記 。四、 注意事項1. 泵的使用和維護注意事項為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性， 必須按照下列注意事項進行操作： 防止任何固體微粒進入泵體 ， 因為塵?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都會磨損柱塞、 密封環(huán) 、 缸體和單向閥 ， 因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒 。 流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾， 而常用的方法是濾過，可采用millipore 濾膜(0.2

23、2或0.45 ”)等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒 ( 或片 ) 。 輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換 。 流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)， 含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi) ， 尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。 如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi) ， 由于蒸發(fā)或泄漏， 甚至只是由于溶液的靜置， 就可能析出鹽的微細晶體 ， 這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。 因此 ， 必須泵入純水將泵充分清洗后 ， 再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑( 對于反相鍵合硅膠固定相 ， 可以是甲醇或甲醇- 水 ) 。 泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完 ， 否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、 缸體或密封

24、環(huán)， 最終產(chǎn)生漏液。 輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力 ， 否則會使高壓密封環(huán)變形， 產(chǎn)生漏液 。 流動相應(yīng)該先脫氣， 以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡 ， 影響流量的穩(wěn)定性， 如果有大量氣泡， 泵就無法正常工作。如果輸液泵產(chǎn)生故障， 須查明原因 ， 采取相應(yīng)措施排除故障： 沒有流動相流出 ， 又無壓力指示。 原因可能是泵內(nèi)有大量氣體 ， 這時可打開泄壓閥 ， 使泵在較大流量（ 如 5ml/min ） 下運轉(zhuǎn) ， 將氣泡排盡， 也可用一個50ml 針筒在泵出口處幫助抽出氣體 。 另一個可能原因是密封環(huán)磨損， 需更換 。 壓力和流量不穩(wěn) 。 原因可能是氣泡， 需要排除 ； 或者是單向閥內(nèi)有異物 ， 可卸下單向閥 ，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。 有時可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡， 或被鹽的微細晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?， 這時 ， 可卸下砂濾棒浸入流動相內(nèi)超聲除氣泡， 或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如 4mol/l 硝酸） 內(nèi)迅速除去微生物 ， 或?qū)Ⅺ}溶解， 再立即清洗。 壓力過高的原因是管路被堵塞， 需要清除和清洗。 壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應(yīng)逐段進行。2. 梯