牛病毒性腹瀉病毒SYBR,Green,Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

1、牛病毒性腹瀉病毒SYBR,GreenfI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用?D。令Z'csibaskets/all-3-l.htmlHtarget=blank"class="keylink”公司;LightCycler480n熒光定量PCR儀,羅氏公司;2xEasyTaqPCRSuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pCIone007BluntVectorKit,購自北京擎科生物技術(shù)有限公司。13引物的設(shè)計(jì)與合成參考GenBank中牛病毒性腹瀉病毒的全基因組核酸序列，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增BVDV的SYBRGreenI熒光定量PCR引物，由北京擎科生物技術(shù)有限

2、公司合成，引物序列如表1所示。1.4 病毒RNA提取和cDNA合成取200pLBVDV病毒原液，按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書，提取BVDV病毒基因組RNA,然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA01.5 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備以提取的BVDV病毒基因組cDNA為模板，BVDV-F/R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),回收目的片段，連接至pCIone007載體，鑒定正確的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，命名為pCIone007-E2o測(cè)定質(zhì)粒濃度,按照以下公式轉(zhuǎn)換成質(zhì)粒的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度x10-9x6.02x1023/（660x質(zhì)粒長度）,將pCI

3、one007-E2質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，放于-20冰箱備用。1.6 建立SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法以pCIone007-E2質(zhì)粒為模板，采用方陣法對(duì)引物濃度（520pmol/L）退火溫度（5562）進(jìn)行摸索，最終選取Ct最小值、熒光最高值、熔解曲線特異性明顯的PCR反應(yīng)條件。采用優(yōu)化完成的反應(yīng)條件，以10倍梯度稀釋后的陽性標(biāo)準(zhǔn)品pCIone007-E2為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.7 敏感性試驗(yàn)以稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，陽性對(duì)照以ddH20為模板，進(jìn)行BVDV的SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品做3個(gè)樣本檢測(cè)。同時(shí)

4、相同濃度下進(jìn)行常規(guī)PCR試驗(yàn)，分析對(duì)比兩種方法的敏感性。1.8 特異性獻(xiàn)用已建立的SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，分別以BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV的基因組作為模板,并以ddH20為陰性對(duì)照，分析該方法的特異性。1.9 重復(fù)性試驗(yàn)分別取等量的4份不同拷貝（4.87x103copies/pL,4.87x104copies/pL,4.87x105copies/pL,4.87x106copies/pL酌pCIone007-E2重組質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)（同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照），每份拷貝樣品做3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，通過計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差（S）和變異系數(shù)（CV

5、）驗(yàn)證熒光定量PCR的批內(nèi)重復(fù)性。另外，取以上4份樣品，在同一反應(yīng)條件下間隔7d重復(fù)一次獨(dú)立的熒光定量PCR檢測(cè)，共重復(fù)3次，然后計(jì)算Ct值的變異系數(shù)（CV）,驗(yàn)證此方法的批間重復(fù)性。1.10 臨床樣品的檢測(cè)采用本試驗(yàn)建立的IBRVSYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)5個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)送檢的67份奶牛腹瀉樣品，同時(shí)利用普通PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較二者的檢出率,并計(jì)算二者的符合率。2結(jié)果與分析2.1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定以BVDV基因組cDNA為模板，利用特異性弓|物BVDV-F和BVDV-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約185bp左右的目的片段，與預(yù)期片段大小相同，無其他非特異性條帶，陰性對(duì)照無條帶（圖

6、1%將目的基因進(jìn)行回收，然后連接至pCIone007載體上。提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與NCBI登錄的標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)比,片段插入位置正確，同源性為100%,表明標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pCIone007-E2構(gòu)建成功。pCIone007-E2的質(zhì)粒濃度為112ng/pL,總長度為2096bp,經(jīng)計(jì)算拷貝數(shù)為4.87x1010copies/pL.2.25 YBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立用優(yōu)化后的反應(yīng)條件建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其斜率為-3.1389,截距為30.19,相關(guān)系數(shù)為0.9931（圖2）,說明Ct值與10倍梯度稀釋后的陽性標(biāo)準(zhǔn)品之間有良好的線性關(guān)系。SYBRGreenI熒光定量PCR檢測(cè)BVDV的熔

7、解曲線顯示，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品均出現(xiàn)了單一波峰，而陰性對(duì)照未出現(xiàn)熔點(diǎn)峰（圖3）,表明試驗(yàn)過程中沒有出現(xiàn)引物二聚體及污染現(xiàn)象，且該引物為特異性擴(kuò)增。23特異性獻(xiàn)用建立的SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)BVDV、IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有BVDV檢測(cè)為陽性（圖4）,說明該方法有很強(qiáng)的特異性。2.26 感性試驗(yàn)將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pCIone007-E2作10倍梯度稀釋，用該方法對(duì)4.87x107copies/pL至4.87x100copies/瓜的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。由圖5可知，該方法檢出核酸的最低模板拷貝數(shù)為4.87x101copies/pLo

8、常規(guī)PCR能檢出的核酸最低陽性質(zhì)?？截悢?shù)為4.87x102copies/pL（圖61結(jié)果表明，本源筵立的SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的敏感性高于普通PCR檢測(cè)方法。2.27 復(fù)性試驗(yàn)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，批內(nèi)變異系數(shù)為0.07%0.33%，批間變異系數(shù)為0.54%0.71%,表明該方法具有良好的批內(nèi)、批間重復(fù)性。2.28 床樣本檢測(cè)采用建立的SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了5個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)送檢的67份奶牛腹瀉樣品,BVDV陽性31份，陽性檢出率為46.27%(31/67),而普通PCR陽性檢出率為43.28%(29/67),符合率為106.90%。3討論與結(jié)

9、論牛病毒性腹瀉病毒可引起患病牛呈現(xiàn)發(fā)熱、流涎、下痢、結(jié)膜炎、口腔黏膜糜爛潰瘍，孕牛出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎和胎兒畸形，還會(huì)引起牛的免疫抑制以及持續(xù)性感染等問題13。牛病毒性腹瀉病毒在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是影響?zhàn)B牛業(yè)健康發(fā)展的最重要疫病之一14。由于持續(xù)感染，?？梢蚤L期帶毒排毒，是非常危險(xiǎn)的傳染源15。因此，關(guān)于牛群的檢測(cè)、監(jiān)測(cè)與淘汰對(duì)于牛病毒性腹瀉的控制非常重要。本研究建立的牛病毒性腹瀉病毒SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法不僅兼具特異性好、敏感性高W重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，而且操作簡單，易于進(jìn)行大規(guī)模樣品檢測(cè)。此外，利用本方法檢測(cè)的樣品采樣方便，可直接檢測(cè)病原，為BVDV感染的早期診斷及病原流行病

10、學(xué)調(diào)查提供了有效可靠的技術(shù)手段。本研究通過對(duì)NCBI上收錄的多個(gè)BVDV序列進(jìn)行比對(duì)，針對(duì)E2基因上的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，建立了SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。用該方法檢測(cè)BVDV,最低檢測(cè)限為4.87x101copies/pL,敏感性比常規(guī)PCRB10倍;檢測(cè)IBRV、BPIV3、BEFV、BEV、ddH2O等均為陰性，只有檢測(cè)BVDV的結(jié)果為陽性，說明該方法的特異性強(qiáng)批內(nèi)變異系數(shù)為0.07%-0.33%,批間變異系數(shù)為0.54%-0.71%,表明該方法重復(fù)性高。用建立的熒光定量PCR方法對(duì)山東、江蘇和天津3個(gè)地區(qū)5個(gè)不同牛場(chǎng)的67份牛腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，建立的S

11、YBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法陽性樣本檢出準(zhǔn)確率高于常規(guī)PCR方法。本試驗(yàn)建立的牛病毒性腹瀉病毒E2基因的SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可以高效、準(zhǔn)確地確定牛群中是否存在BVDV感染，為今后BVDV的防控和凈化提供了有效的技術(shù)手段，也為BVDV的實(shí)驗(yàn)室研究提供了參考和理論支撐。參考文獻(xiàn)：lLiXP,ZhouWG,GuanPY,etal.ResearchprogressonpathogenesisofbovineviraldiarrhoeavirusJ.ChinaAnimalHusbandry&VeterinaryMedicine,2018.2Moe

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13、接ELISA方法的建立及臨床應(yīng)用C中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)第二十四次學(xué)術(shù)研討會(huì)、中國病理生理學(xué)會(huì)動(dòng)物病理生理學(xué)專業(yè)委員會(huì)第二十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)、中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)病理學(xué)專業(yè)委員會(huì)第三次學(xué)術(shù)研討會(huì)、中國獸醫(yī)病理學(xué)家第三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.2018.鐘發(fā)剛，王新華，沈敏，等.牛病毒性腹瀉病毒野毒株的分離鑒定切.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000,22(6):463-464.7趙丹，王建華，王萬萼.牛病毒性腹瀉-粘膜病的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展北檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2014,24(5):68-70.8王姝.牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及IPMA方法的建立與初步應(yīng)用D.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.9栗

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