來氟米特對膠原性關節(jié)炎大鼠CD4CD25調節(jié)性T細胞的影響.

1、來氟米特對膠原性關節(jié)炎大鼠 CD4+CD25調節(jié)性T細 胞的影響作者：王婷玉 李俊金芝貴 吳飛來源：畢業(yè)論文華 2011-11-23 9:56:41網摘要目的：探討來氟米特對膠原性關節(jié)炎中免疫抑制性 CD4+CD25調節(jié) 性T細胞的作用。方法：II型膠原誘導Wistar大鼠，建立膠原性關節(jié)炎模 型；檢測關節(jié)炎大鼠多發(fā)性關節(jié)炎評分，每周2次；流式細胞儀檢測脾淋巴細胞中CD4+CD25調節(jié)性T細胞的比例；RT-PCF檢測脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA勺 表達。結果：與模型組比較，來氟米特(2 mg/kg，灌胃給藥15 d )明顯降低 CIA大鼠多發(fā)性關節(jié)炎評分。與關節(jié)炎模型組比較，藥物干預組CD

2、4+CD25調節(jié)性T細胞的比例升高，轉錄因子 Foxp3 mRNA勺表達增高。結論：來氟米特具有 抑制關節(jié)炎大鼠關節(jié)腫脹的作用，該作用可能和促進CD4+CD25+Tre產生和增加Foxp3的表達有關。關鍵詞關節(jié)炎來氟米特CD25 中圖分類號：R392.5文獻標識碼：A文章編號：1006-1533(2011)11-0548-03Effect of leflu nomide on CD4+CD25+ regulatory T cells in collage n- in duced arthritis rats*WANG Ting-yu1, LI Jun2，JIN Zhi-gui1 ，WU Fei

3、-hua1，JIN Jian1 ，TANG Ting-ting3 ，4(1. Department of Pharmacy ，Shanghai Ninth People ' s Hospital ， School of Medicine at Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200011； 2. School of Pharmacy ，Anhui Medical University， Hefei，230032； 3. Shanghai Key Laboratory of Orthopaedic Implant，Shanghai，20001

4、1； 4. Department of Orthopaedic Surgery ，Shanghai Ninth People ' s Hospital ，School of Medicine at Shanghai Jiao Tong University，Shanghai，200011)ABSTRACTObjective: To i nvestigate the effect of leflu nomide on the immun osuppressive CD4+CD25+ regulatory T cells (CD4+CD25+ Tregs) in collage n-i n

5、duced arthritis (CIA). Methods: CIA was in duced by collage n type II in Wistar rats. Polyarthritis in dexes were checked twice a week. Im muno fluoresce nee flow cytometry and RT-PCR were used to determ ine the proporti on of CD4+CD25+ Tregs and the expressi on of Foxp3 mRNA in the splenocytes of C

6、IA rats， respectively. Results:Leflunomide (2 mg/kg , ig x 15 days , day 10-24) could significantly decrease the polyarthritis indexes in CIA rats. Compared with model CIA rats ， administration of leflunomide could significantly increase the number ofCD4+CD25+ Tregs and the expression of Foxp3 mRNA

7、in spleen lymphocytes of CIA rats. Conclusions: The results demonstrated that the inhibition of arthritis by leflunomide was related to changes in CD4+CD25+ Tregs.KEY WORDSarthritis ；leflunomide ；CD25類風濕性關節(jié)炎( rheumatoid arthritis, RA )存在著持續(xù)性滑膜炎癥及進展 性軟骨和骨破壞，是一種炎性、自身免疫性疾病。來氟米特是一種疾病調修藥 物，廣泛應用于RA的治療1。動物

8、實驗研究表明，來氟米特能抑制足趾腫脹 和關節(jié)破壞2。臨床研究發(fā)現(xiàn)，來氟米特能夠延緩 RA疾病進展、改善患者的 癥狀、提高患者的生活質量 1 。CD4+CD25調節(jié)性 T 細胞(CD4+CD25+ regulatory T cells, CD4+CD25+Tregs)是一種免疫抑制性T細胞，其表面高表達 CD25(IL-2R a ),占外周血CD4+ T 細胞的5%1% 3。大量動物實驗結果證實，CD4+CD25+Treg在維持自身免疫 耐受和預防自身免疫性疾病中起著關鍵作用4。轉錄因子Foxp3特異性表達于 CD4+CD25+ Tregs5,使之區(qū)別于活化的 CD4+ T細胞。Foxp3的表達

9、對于 CD4+CD25+Treg的產生和功能維持是必要的，是 CD4+CD25+Treg的特異性標 志物之一。鑒于來氟米特的免疫抑制性和 CD4+CD25+Treg的重要作用，本文將研究來氟米 特對膠原性關節(jié)炎大鼠CD4+CD25+Treg的影響，探討來氟米特是否通過上調 CIA大鼠體內的CD4+CD25+Tregs從而抑制大鼠體內過度增殖的 T淋巴細胞并 最終抑制關節(jié)炎癥的。1 材料和方法1.1 主要藥物及試劑來氟米特由美國欣凱公司上海代表處提供； II 型膠原( CII )、弗氏不完全佐 劑(IFA)購于Sigma公司；小鼠抗大鼠FITC-CD4抗體、小鼠抗大鼠PE-CD25 抗體及同型對

10、照購于 Caltag 公司； Trizol reagent 購于 Invitrogen 公司；逆 轉錄試劑盒購于Promega公司。1.2 膠原性關節(jié)炎大鼠模型的建立Wistar大鼠30只，體重(110 ± 20) g，隨機分成正常組、CIA模型組和來氟米 特用藥組。將CII溶入0.1 mol/L的乙酸中配成2 g/L，4 C攪拌過夜，與等 體積IFA混合，充分乳化。將乳劑0.5 ml分多點注射至大鼠背部皮內，1周后 同法繼續(xù)注射。正常組大鼠注射等量生理鹽水。第 1024天，用藥組灌胃給予2 mg/kg 來氟米特，正常組和模型組給予等體積生理鹽水。1.3 藥效學評價 采用多發(fā)性關節(jié)炎

11、指數(shù)評價來氟米特對 CIA大鼠的治療作用。1.4CD4+CD25+ P田胞的檢測致炎后第 35 天，股動脈放血處死大鼠，無菌制備大鼠脾淋巴細胞懸液（1X 106/ml），加入 FITC-CD4和 PE-CD25抗體，4 C避光孵育 30 min , PBS 洗滌后上流式細胞儀檢測，計算 CD4+CD25+ "細田胞占CD4+ T細胞的比例。1.5Foxp3 mRNA的檢測采用Trizol法提取脾淋巴細胞總 RNA AMV逆轉錄酶逆轉錄得到cDNA PCFgl 物委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。Foxp3 上游：5' - TAATATGCGGCCCCCTTTCACCT

12、A -Foxp3 下游：5'- GGCCCCCGTCCATGTTTTCTTG -B -actin 上游：5' - GATATCGCTGCGCTCGTCGTC-B -actin 下游：5'- GTCCCGGCCAGCCAGGTC'AG-PCR擴增35個循環(huán)，PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳。1.6 統(tǒng)計學處理計量資料數(shù)據以x±SEMI表示，組間比較采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件中One-Way ANOV分析。Pv 0.05為有統(tǒng)計學差異。2結果2.1來氟米特對CIA大鼠多發(fā)性關節(jié)炎評分的影響與正常組比較，CIA模型組大鼠造模10 d后大鼠關節(jié)腫脹度顯

13、著增加，肢體持 續(xù)紅腫，逐漸出現(xiàn)關節(jié)畸形。來氟米特（2 mg/kg ）可明顯抑制CIA大鼠多發(fā)性 關節(jié)炎指數(shù)（表 1）。2.2來氟米特對CIA大鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+細胞的影響結果如圖1所示，與正常組相比，CIA組CD4+CD25+細胞的比例明顯降低。 來氟米特能明顯提高CIA大鼠CD4+CD25+ T田胞的比例。2.3來氟米特對CIA大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNAfe達的影響與正常組相比，CIA大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA勺表達明顯降低，來氟米特 可明顯提高CIA大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA勺表達（圖2）。3 討論 疾病調修藥來氟米特在臨床上被廣泛用于類風濕性

14、關節(jié)炎的治療，其作用機制 可能與抑制淋巴細胞的活性有關 6 ，但是具體機制未明。本文選取多發(fā)性關節(jié) 炎指數(shù)進行評估，結果表明來氟米特能明顯減少 CIA 大鼠的多發(fā)性關節(jié)炎評 分，說明來氟米特對 CIA 大鼠的多發(fā)性關節(jié)炎具有治療作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg對自身反應性T細胞的抑制作用在維持自身 免疫耐受中起著關鍵作用。 Gonzalez-Rey 等7 發(fā)現(xiàn)，血管活性腸肽治療 CIA 與其促進CD4+CD25+Treg的產生有關，清除小鼠體內的 CD4+CD25+Treg有利 于關節(jié)炎的形成8?？筎NF-a抗體通過抑制炎癥上調功能性CD4+CD25+Tregs9。本文中，我們

15、發(fā)現(xiàn) CIA大鼠體內CD4+CD25+Treg數(shù)量降 低。CD4+CD25+Treg數(shù)量不足，引起CD4+CD25+Treg的免疫抑制功能不足， 導致CIA大鼠體內Th1細胞所致的免疫反應作用增強，最終致使 CIA大鼠體內 免疫功能失調，關節(jié)炎癥持續(xù)存在。來氟米特灌胃給予CIA大鼠后能明顯提高CIA大鼠脾淋巴細胞中CD4+CD25+細胞的比例。來氟米特治療 CIA可能與其 提高CIA大鼠CD4+CD25+Treg的數(shù)量有關。Foxp3基因最初是在Scurfy小鼠中發(fā)現(xiàn)的，小鼠Foxp3基因位于染色體 XA1.1,全長30 858 bp，編碼蛋白含431個氨基酸。人Foxp3基因位于染色體 Xp

16、11.23，有11個外顯子，編碼一個 48 kD的蛋白Scurfin。轉錄因子Foxp3 選擇性表達于CD4+CD25+Treg，是CD4+CD25+Treg的高度特異性標記，直接 參與CD4+CD25+Treg的發(fā)育和功能維持。在CD4+CD25- T細胞中異位表達 Foxp3能使其具有CD4+CD25+Treg的表型和功能10。Valencia等11研究發(fā) 現(xiàn)，給予RA患者抗TNF-a抗體治療后，患者 CD4+CD25+Treg中 Foxp3 mRNA 和蛋白的表達水平均提高，同時伴隨著 CD4+CD25+Treg抑制功能的提高。更重 要的是，CD4+ T細胞活化后并不能誘導Foxp3的表

17、達。因此，檢測Foxp3的水 平能較真實地反映CD4+CD25+Treg的水平和功能，是目前公認的反映 CD4+CD25+Treg的“金標準”。我們用 RT-PCR法檢測脾淋巴細胞中Foxp3 mRN的表達水平。結果表明，CIA大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA勺表達明顯低 于正常大鼠脾淋巴細胞中Foxp3 mRNA勺表達。這與前面流式細胞術分析的脾淋 巴細胞中CD4+CD25+ T田胞的比例結果是一致的，說明 CIA大鼠體內 CD4+CD25+Treg的數(shù)量和功能均較正常大鼠降低。重要的是，給予CIA大鼠來氟米特治療后，其脾淋巴細胞中 Foxp3 mRNA勺表達顯著升高，同時伴隨著 CD4

18、+CD25+Treg的數(shù)量提高。提示來氟米特能明顯提高 CIA大鼠體內 CD4+CD25+Treg的數(shù)量和功能，這可能是來氟米特治療 CIA的新的作用機制。參考文獻1 Sharp JT ， Strand V ， Leung H， et al. Treatment with leflunomide slows radiographic progression of rheumatoid arthritis：Results fromthree randomized controlled trials of leflunomide in patients with active rheumatoid

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