華科同濟醫(yī)學(xué)院生化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能PPT課件

1、n什么是蛋白質(zhì)? ?蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵(peptide bond)相連形成的高分子含氮化合物。第1頁/共104頁n蛋白質(zhì)研究的歷史18331833年，從麥芽中分離淀粉酶；隨后從胃液中年，從麥芽中分離淀粉酶；隨后從胃液中分離到類似胃蛋白酶的物質(zhì)。分離到類似胃蛋白酶的物質(zhì)。18641864年，血紅蛋白被分離并結(jié)晶。年，血紅蛋白被分離并結(jié)晶。1919世紀末，證明蛋白質(zhì)由氨基酸組成，并合成世紀末，證明蛋白質(zhì)由氨基酸組成，并合成了多種短肽。了多種短肽。2020世紀初，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；完成胰島世紀初，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；完成胰島素一級結(jié)構(gòu)測定。

2、素一級結(jié)構(gòu)測定。第2頁/共104頁2020世紀中葉，各種蛋白質(zhì)分析技術(shù)相繼建立，世紀中葉，各種蛋白質(zhì)分析技術(shù)相繼建立，促進了蛋白質(zhì)研究迅速發(fā)展；促進了蛋白質(zhì)研究迅速發(fā)展；19621962年，確定了血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)。年，確定了血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)。2020世紀世紀9090年代，功能基因組與蛋白質(zhì)組研究地年代，功能基因組與蛋白質(zhì)組研究地展開。展開。第3頁/共104頁n蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性分布廣：分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細胞的各個部分都含有蛋白所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。質(zhì)。含量高：含量高：蛋白質(zhì)是細胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的蛋白質(zhì)是細胞內(nèi)最豐富的有機

3、分子，占人體干重的4545，某，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達8080。1. 蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分第4頁/共104頁作為生物催化劑（酶）作為生物催化劑（酶）代謝調(diào)節(jié)作用代謝調(diào)節(jié)作用免疫保護作用免疫保護作用物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲物質(zhì)的轉(zhuǎn)運和存儲運動與支持作用運動與支持作用參與細胞間信息傳遞參與細胞間信息傳遞2. 蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能3. 氧化供能第5頁/共104頁蛋白質(zhì)的分子組成蛋白質(zhì)的分子組成The Molecular Component of Protein第一節(jié)第一節(jié)第6頁/共104頁n組成蛋白質(zhì)的元素主要有C、H、O、N和 S。

4、有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質(zhì)還含有碘 。第7頁/共104頁 各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16。 由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：100克樣品中蛋白質(zhì)的含量克樣品中蛋白質(zhì)的含量 (g %)= 每克樣品含氮克數(shù)每克樣品含氮克數(shù) 6.251001/16%n蛋白質(zhì)元素組成的特點第8頁/共104頁一、組成人體蛋白質(zhì)的20種氨基酸均屬于L- -氨基酸 存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬 L-氨基酸（甘氨酸除外）。第9頁

5、/共104頁H甘氨酸甘氨酸CH3丙氨酸丙氨酸L-L-氨基酸的通式氨基酸的通式RC+NH3COO-H第10頁/共104頁非極性脂肪族氨基酸非極性脂肪族氨基酸極性中性氨基酸極性中性氨基酸芳香族氨基酸芳香族氨基酸酸性氨基酸酸性氨基酸堿性氨基酸堿性氨基酸二、氨基酸可根據(jù)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進行分類第11頁/共104頁( (一一) )側(cè)鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族側(cè)鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸氨基酸第12頁/共104頁( (二二) )側(cè)鏈有極性但不帶電荷的氨基酸是極性側(cè)鏈有極性但不帶電荷的氨基酸是極性中性氨基酸中性氨基酸第13頁/共104頁( (三三) )側(cè)鏈含芳香基團的氨基酸是芳香族氨基酸

6、側(cè)鏈含芳香基團的氨基酸是芳香族氨基酸第14頁/共104頁( (四四) )側(cè)鏈含負性解離基團的氨基酸是酸性氨基酸側(cè)鏈含負性解離基團的氨基酸是酸性氨基酸第15頁/共104頁( (五五) )側(cè)鏈含正性解離基團的氨基酸屬于堿性側(cè)鏈含正性解離基團的氨基酸屬于堿性氨基酸氨基酸第16頁/共104頁n幾種特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸（亞氨基酸）（亞氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2第17頁/共104頁 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫鍵二硫鍵-HH-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-

7、CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3第18頁/共104頁三、20種氨基酸具有共同或特異的理化性質(zhì)n兩性解離及等電點兩性解離及等電點氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。處溶液的酸堿度。等電點等電點(isoelectric point, pI) 在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶

8、液的中性。此時溶液的pH值值稱為該氨基酸的稱為該氨基酸的等電點等電點。（一）氨基酸具有兩性解離的性質(zhì)第19頁/共104頁pH=pI+OH-pHpI+H+OH-+H+pHpI氨基酸的兼性離子氨基酸的兼性離子 陽離子陽離子陰離子陰離子CHNH2COOHR CHNH2COOHRCHNH3+COO-R CHNH3+COO-RCHNH2COO-R CHNH2COO-RCH COOHRNH3+CH COOHRNH3+第20頁/共104頁（二）含共軛雙鍵的氨基酸具有紫外吸收性質(zhì)色氨酸、酪氨酸色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在的最大吸收峰在 280 nm 附近。附近。大多數(shù)蛋白質(zhì)含大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，

9、有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。的快速簡便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收第21頁/共104頁（三）氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成藍紫色化合物氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍藍紫色紫色化合物，其最大吸收峰在化合物，其最大吸收峰在570nm處。處。由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關(guān)系，因此可作為氨基酸定量分析方法。比關(guān)系，因此可作為氨基酸定量分析方法。第22頁/共104頁四、蛋白質(zhì)是由許多氨基酸殘基

10、組成的多肽鏈肽鍵肽鍵( (peptide bond) )是由一個氨基酸的是由一個氨基酸的 - -羧基與另一個氨基酸的羧基與另一個氨基酸的 - -氨基脫水縮合而形成氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵。的化學(xué)鍵。（一）氨基酸通過肽鍵連接而形成肽 (peptide)第23頁/共104頁NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH2-CH-CHOOH甘甘氨氨酸酸NH-CH-CHOHO OH甘甘氨氨酸酸+-HOH甘氨酰甘氨酸甘氨酰甘氨酸肽鍵NH2-CH-C-N-CH-COOHHHHONH2-CH-C-N-CH-COOHHHHO第24頁/共104頁肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合

11、物。合物。兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽酸縮合則形成三肽肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽稱多肽(polypeptide)。第25頁/共104頁N 末端：多肽鏈中有末端：多肽鏈中有游離游離-氨基氨基的一端的一端C 末端：多肽鏈中有末端：多肽鏈中有游離游離-羧基羧基的一端的一端n

12、多肽鏈有兩端：多肽鏈多肽鏈(polypeptide chain)是指許多是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。第26頁/共104頁N末端末端C末端末端牛核糖核酸酶牛核糖核酸酶第27頁/共104頁（二）體內(nèi)存在多種重要的生物活性肽 1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH)第28頁/共104頁GSH過氧過氧化物酶化物酶H2O2 2GSH 2H2O GSSG GSH還原酶還原酶NADPH+H+ NADP+ nGSH與與GSSG間的轉(zhuǎn)換間的轉(zhuǎn)換 第29頁/共104頁 體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽 神經(jīng)肽神經(jīng)肽(neuropepti

13、de)2.多肽類激素及神經(jīng)肽多肽類激素及神經(jīng)肽第30頁/共104頁蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)The Molecular Structure of Protein 第二節(jié)第二節(jié)第31頁/共104頁n蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括: 高級高級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)(primary structure)二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)(secondary structure)三級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)(tertiary structure)四級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)(quaternary structure)第32頁/共104頁n定義:蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指在蛋白質(zhì)分子從蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指在蛋白質(zhì)分子從N-端至端至C-端

14、的端的氨基酸排列順序氨基酸排列順序。一、氨基酸的排列順序決定蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)n主要的化學(xué)鍵:肽鍵肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。 第33頁/共104頁一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能功能的基礎(chǔ)的基礎(chǔ)，但不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的但不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的唯一因素唯一因素。第34頁/共104頁二、二、多肽鏈的局部主鏈構(gòu)象為蛋白質(zhì)多肽鏈的局部主鏈構(gòu)象為蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基

15、側(cè)鏈的構(gòu)象間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象 。n定義: : n主要的化學(xué)鍵：氫鍵氫鍵 第35頁/共104頁（一）參與肽鍵形成的6個原子在同一平面上參與肽鍵的參與肽鍵的6個原子個原子C 1、C、O、N、H、C 2位于同一位于同一平面，平面，C 1和和C 2在平面上所處的位置為反式在平面上所處的位置為反式(trans)構(gòu)型，此構(gòu)型，此同一平面上的同一平面上的6個原子構(gòu)成了所謂的個原子構(gòu)成了所謂的肽單元肽單元 (peptide unit) 。第36頁/共104頁（一）參與肽鍵形成的6個原子在同一平面上參與肽鍵的參與肽鍵的6個原子個原子C 1、C、O、N、H、C 2位于同一位于同一平面，平面，C

16、1和和C 2在平面上所處的位置為反式在平面上所處的位置為反式(trans)構(gòu)型，此構(gòu)型，此同一平面上的同一平面上的6個原子構(gòu)成了所謂的個原子構(gòu)成了所謂的肽單元肽單元 (peptide unit) 。第37頁/共104頁 - -螺旋螺旋 ( -helix) - -折疊折疊 ( -pleated sheet) - -轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角 ( -turn) 無規(guī)卷曲無規(guī)卷曲 (random coil) （二）-螺旋結(jié)構(gòu)是常見的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)n蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)第38頁/共104頁n - -螺旋第39頁/共104頁（三） - -折疊使多肽鏈形成片層結(jié)構(gòu)第40頁/共104頁（四）（四） - -轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲在蛋白質(zhì)分子

17、中轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲在蛋白質(zhì)分子中普遍存在普遍存在 - -轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部無規(guī)卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。分肽鏈結(jié)構(gòu)。第41頁/共104頁（五）模體是具有特殊功能的超二級結(jié)構(gòu)在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個個有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)組合，被稱為有規(guī)則的二級結(jié)構(gòu)組合，被稱為超二級結(jié)構(gòu)超二級結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)組合形式有二級結(jié)構(gòu)組合形式有3 3種：種：， 。第42頁/共104頁二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段

18、，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構(gòu)象，稱為上相互接近，形成一個特殊的空間構(gòu)象，稱為模體模體(motif) 。模體是具有特殊功能的超二級結(jié)構(gòu)。模體是具有特殊功能的超二級結(jié)構(gòu)。第43頁/共104頁鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體鈣離子的模體鋅指結(jié)構(gòu)鋅指結(jié)構(gòu)- -螺旋螺旋-轉(zhuǎn)角（或轉(zhuǎn)角（或環(huán)）環(huán)）-螺旋模體螺旋模體鏈鏈-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角- -鏈模體鏈模體鏈鏈-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角-螺旋螺旋-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)角- -鏈模體鏈模體n模體常見的形式第44頁/共104頁（六）氨基酸殘基的側(cè)鏈對二級結(jié)構(gòu)形成的影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是以一級結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側(cè)鏈適合形成一段

19、肽鏈其氨基酸殘基的側(cè)鏈適合形成 - -螺旋螺旋或或-折疊，它就會出現(xiàn)相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)。折疊，它就會出現(xiàn)相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)。 第45頁/共104頁三、在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上多肽鏈進一步折疊形成蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)疏水鍵、離子鍵、氫鍵和疏水鍵、離子鍵、氫鍵和 Van der Waals力等。力等。n主要的化學(xué)鍵:整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。n定義:（一）三級結(jié)構(gòu)是指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置第46頁/共104頁第47頁/共104頁 肌紅蛋白肌紅蛋白 (Mb) N 端端 C端端第

20、48頁/共104頁纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域纖連蛋白分子的結(jié)構(gòu)域（二）結(jié)構(gòu)域是三級結(jié)構(gòu)層次上的局部折疊區(qū)分子量較大的蛋白質(zhì)?？烧郫B成多個結(jié)構(gòu)較為緊分子量較大的蛋白質(zhì)常可折疊成多個結(jié)構(gòu)較為緊密的區(qū)域，并各行其功能，稱為結(jié)構(gòu)域密的區(qū)域，并各行其功能，稱為結(jié)構(gòu)域 ( (domain) ) 。第49頁/共104頁（三）分子伴侶參與蛋白質(zhì)折疊分子伴侶分子伴侶(chaperon)通過提供一個保護環(huán)境從而通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質(zhì)折疊成天然構(gòu)象或形成四級結(jié)構(gòu)。加速蛋白質(zhì)折疊成天然構(gòu)象或形成四級結(jié)構(gòu)。分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結(jié)合隨分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結(jié)合隨后松開，如此重復(fù)進行可防

21、止錯誤的聚集發(fā)生，后松開，如此重復(fù)進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。使肽鏈正確折疊。 分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結(jié)合，使之解聚分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結(jié)合，使之解聚后，再誘導(dǎo)其正確折疊。后，再誘導(dǎo)其正確折疊。 分子伴侶在蛋白質(zhì)分子折疊過程中二硫鍵的正確分子伴侶在蛋白質(zhì)分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。形成起了重要的作用。 第50頁/共104頁伴侶蛋白在蛋白質(zhì)折疊中的作用伴侶蛋白在蛋白質(zhì)折疊中的作用第51頁/共104頁亞基之間的結(jié)合主要是氫鍵和離子鍵。亞基之間的結(jié)合主要是氫鍵和離子鍵。四、四、含有二條以上多肽鏈的蛋白質(zhì)含有二條以上多肽鏈的蛋白質(zhì)具有四級結(jié)構(gòu)具有四級結(jié)構(gòu)蛋

22、白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)。有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱為蛋白每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的質(zhì)的亞基亞基 (subunit)。第52頁/共104頁由由2個亞基組成的蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)中，若亞基分子個亞基組成的蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)中，若亞基分子結(jié)構(gòu)相同，稱之為結(jié)構(gòu)相同，稱之為同二聚體同二聚體(homodimer)，若亞基分，若亞基分子結(jié)構(gòu)不同，則稱之為子結(jié)構(gòu)不同，則稱之為異二聚體異二聚

23、體(heterodimer)。 血紅蛋白的血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)第53頁/共104頁五、蛋白質(zhì)的分類n根據(jù)蛋白質(zhì)組成成分:單純蛋白質(zhì)單純蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì) = = 蛋白質(zhì)部分蛋白質(zhì)部分 + + 非蛋白質(zhì)部分非蛋白質(zhì)部分n根據(jù)蛋白質(zhì)形狀:纖維狀蛋白質(zhì)纖維狀蛋白質(zhì)球狀蛋白質(zhì)球狀蛋白質(zhì)第54頁/共104頁六、蛋白質(zhì)組學(xué)（一）蛋白質(zhì)組學(xué)基本概念蛋白質(zhì)組是指一種細胞或一種生物所表蛋白質(zhì)組是指一種細胞或一種生物所表達的全部蛋白質(zhì)，即達的全部蛋白質(zhì)，即“一種基因組所表達的一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì)全套蛋白質(zhì)”。 第55頁/共104頁（二）蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)平臺 蛋白質(zhì)組學(xué)是高通量，高效率的研究

24、蛋白質(zhì)組學(xué)是高通量，高效率的研究: :雙向電泳分離樣品蛋白質(zhì)雙向電泳分離樣品蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)點的定位、切取蛋白質(zhì)點的定位、切取 蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜分析 （三）蛋白質(zhì)組學(xué)研究的科學(xué)意義第56頁/共104頁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系The Relation of Structure and Function of Protein第三節(jié)第三節(jié)第57頁/共104頁（一）一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ)一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)是高級結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)牛核糖核酸酶的牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)二二硫硫鍵鍵第58頁/共104頁 天然狀態(tài)，天然狀態(tài)，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巰基乙

25、醇巰基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巰基乙醇巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性非折疊狀態(tài)，無活性第59頁/共104頁（二）一級結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)具有相似的高級結(jié)構(gòu)與功能一級結(jié)構(gòu)相似的多肽或蛋白質(zhì)，其空間構(gòu)象一級結(jié)構(gòu)相似的多肽或蛋白質(zhì)，其空間構(gòu)象以及功能也相似。以及功能也相似。 氨基酸殘基序號氨基酸殘基序號胰島素胰島素 A5 5 A6 6 A10 10 A3030 人人 Thr Ser Ile Thr 豬豬 Thr Ser Ile Ala 狗狗 Thr Ser Ile Ala 兔兔 Thr Gly Ile Ser 牛牛 Ala Gly Val Ala 羊羊 Ala Ser Val Ala 馬馬 Thr Se

26、r Ile Ala第60頁/共104頁（三）氨基酸序列提供重要的生物化學(xué)信息一些廣泛存在于生一些廣泛存在于生物界的蛋白質(zhì)如細胞色物界的蛋白質(zhì)如細胞色素素(cytochrome C)，比，比較它們的一級結(jié)構(gòu)，可較它們的一級結(jié)構(gòu)，可以幫助了解物種進化間以幫助了解物種進化間的關(guān)系。的關(guān)系。 第61頁/共104頁（四）重要蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變可引起疾病n例：鐮刀形紅細胞貧血N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽鏈肽鏈HbA 肽肽 鏈鏈N-val his leu thr pro val glu C(146) 這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，這種由蛋白質(zhì)

27、分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為稱為“分子病分子病”。第62頁/共104頁n肌紅蛋白肌紅蛋白/ /血紅蛋白血紅蛋白含有血紅素輔基含有血紅素輔基血紅素結(jié)構(gòu)血紅素結(jié)構(gòu) 二、蛋白質(zhì)的功能依賴特定空間結(jié)構(gòu)（一）血紅蛋白亞基與肌紅蛋白結(jié)構(gòu)相似第63頁/共104頁n肌紅蛋白( (myoglobin，Mb) ) 肌紅蛋白是一個只有三級肌紅蛋白是一個只有三級結(jié)構(gòu)的單鏈蛋白質(zhì)，有結(jié)構(gòu)的單鏈蛋白質(zhì)，有8 8段段 - -螺螺旋結(jié)構(gòu)。旋結(jié)構(gòu)。血紅素分子中的兩個丙酸血紅素分子中的兩個丙酸側(cè)鏈以離子鍵形式與肽鏈中的側(cè)鏈以離子鍵形式與肽鏈中的兩個堿性氨基酸側(cè)鏈上的正電兩個堿性氨基酸側(cè)鏈上的正電荷相連，加之肽鏈中的荷相連，加之

28、肽鏈中的F8F8組氨組氨酸殘基還與酸殘基還與FeFe2+2+形成配位結(jié)合，形成配位結(jié)合，所以血紅素輔基與蛋白質(zhì)部分所以血紅素輔基與蛋白質(zhì)部分穩(wěn)定結(jié)合。穩(wěn)定結(jié)合。 第64頁/共104頁n血紅蛋白( (hemoglobin，Hb) )血紅蛋白具有血紅蛋白具有4個亞個亞基組成的四級結(jié)構(gòu)，基組成的四級結(jié)構(gòu)，每每個亞基可結(jié)合個亞基可結(jié)合1 1個血紅素個血紅素并攜帶并攜帶1 1分子氧分子氧。Hb亞基之間通過亞基之間通過8對鹽鍵，使對鹽鍵，使4個亞基緊密個亞基緊密結(jié)合而形成親水的球狀結(jié)合而形成親水的球狀蛋白。蛋白。 第65頁/共104頁Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合， Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合H

29、b占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。（二）血紅蛋白亞基構(gòu)象變化可影響亞基與氧結(jié)合第66頁/共104頁肌紅蛋白肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線的氧解離曲線第67頁/共104頁n協(xié)同效應(yīng)( (cooperativity) )一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。 如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應(yīng) ( (positive cooperativity) )如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應(yīng)( (negative cooperativity) )第68頁/共104頁第69頁/共104頁O2血紅素與氧結(jié)

30、血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟變小，就能進入卟啉環(huán)的小孔中，繼啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的而引起肽鏈位置的變動。變動。第70頁/共104頁n變構(gòu)效應(yīng)(allosteric effect)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變伴隨其功能的變化，稱為變構(gòu)效應(yīng)。第71頁/共104頁（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變可引起疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生：若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導(dǎo)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生。致疾病發(fā)生。第72頁/共104頁蛋白質(zhì)構(gòu)象改變

31、導(dǎo)致疾病的機理蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機理：有些蛋：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。第73頁/共104頁瘋牛病是由朊病毒蛋白瘋牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的

32、正常的PrP富含富含-螺旋，稱為螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為為-折疊的折疊的PrPsc，從而致病。，從而致病。PrPc-螺旋螺旋PrPsc-折疊折疊正常正常瘋牛病瘋牛病n瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變第74頁/共104頁第四節(jié)第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)The Physical and Chemical Characters of Protein第75頁/共104頁一、蛋白質(zhì)具有兩性電離的性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液氨基酸殘基側(cè)鏈中

33、某些基團，在一定的溶液pH條條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。 當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一當?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的荷為零，此時溶液的pH稱為稱為蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)的等電點。n蛋白質(zhì)的等電點( isoelectric point, pI)第76頁/共104頁二、蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至萬至100萬之巨，其分子的直徑可達萬之巨，其分子的直徑可達1100n

34、m，為膠粒范圍之內(nèi)。為膠粒范圍之內(nèi)。 顆粒表面電荷顆粒表面電荷 水化膜水化膜n蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素:第77頁/共104頁+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸酸堿堿酸酸堿堿酸酸堿堿脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉第78頁/共104頁三、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)破壞而引起變性在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無空間構(gòu)象被破壞

35、，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。物活性的喪失。n蛋白質(zhì)的變性(denaturation)第79頁/共104頁n造成變性的因素造成變性的因素: :如如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等重金屬離子及生物堿試劑等 。 n變性的本質(zhì)變性的本質(zhì): :破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。第80頁/共104頁n 應(yīng)用舉例應(yīng)用舉例: :臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌

36、。滅菌。此外此外, , 防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。制劑（如疫苗等）的必要條件。 第81頁/共104頁若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為象和功能，稱為復(fù)性復(fù)性(renaturation) 。第82頁/共104頁 天然狀態(tài)，天然狀態(tài)，有催化活性有催化活性 尿素、尿素、 -巰基乙醇巰基乙醇 去除尿素、去除尿素、-巰基乙醇巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性非折疊狀態(tài)，無活性第83頁/共104頁在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露

37、在外，肽在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。淀，但并不變性。 蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。 n蛋白質(zhì)沉淀n蛋白質(zhì)的凝固作用(protein coagulation)第84頁/共104頁四、蛋白質(zhì)在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨

38、酸，因此在和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。此可作蛋白質(zhì)定量測定。第85頁/共104頁蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。三酮反應(yīng)。 蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙雙縮脲反應(yīng)縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。程度。五、應(yīng)用蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)可測定蛋白質(zhì)溶液含量1.茚

39、三酮反應(yīng)(ninhydrin reaction)2. 雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction)第86頁/共104頁第五節(jié)第五節(jié)蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein第87頁/共104頁一、一、透析及超濾法可去除蛋白質(zhì)溶液中的透析及超濾法可去除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物小分子化合物應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。的目的。n透

40、析(dialysis)n超濾法利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法物分開的方法。第88頁/共104頁二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質(zhì)沉淀方法的蛋白質(zhì)沉淀方法使用使用丙酮沉淀丙酮沉淀時，必須在時，必須在04低溫下進行，低溫下進行，丙酮用量一般丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。也可用乙醇沉淀。 鹽析鹽析(salt precipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉是將硫酸銨、硫酸鈉或

41、氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。 第89頁/共104頁免疫沉淀法：免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。蛋白質(zhì)混合溶液中分離獲得抗原蛋白。 第90頁/共104頁三、利用荷電性質(zhì)可用電泳法將蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)在高于或低于其蛋白質(zhì)在高于或低

42、于其pIpI的溶液中為帶電的的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù)術(shù), , 稱為稱為電泳電泳(elctrophoresis) 。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。電泳等。 第91頁/共104頁SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。量的測定。等電聚焦電泳等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而分離蛋白質(zhì)的電泳方法。離蛋白質(zhì)的

43、電泳方法。雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)。n幾種重要的蛋白質(zhì)電泳:第92頁/共104頁四、應(yīng)用相分配或親和原理可將蛋白質(zhì)進行層析分離待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固待分離蛋白質(zhì)溶液（流動相）經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的 。n層析(chromatography)分離蛋白質(zhì)的原理第93頁/共104頁離子交換層析：離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進行分離。性質(zhì)不同進行分離。凝膠過濾凝膠過濾(gel filtration)又稱分子篩層析又稱分子篩層析，利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。利用各蛋白質(zhì)分子大小不同分離。n蛋白質(zhì)分離常用的層析方法第94頁/共104頁第95頁/共104頁第96頁/共104頁五、利用蛋白質(zhì)顆粒沉降行為不同可進行超速離心分離 超速離心法超速離心法(ultracentrifugation)既可以既可以用來分離純化蛋白質(zhì)也可以用作測定蛋用來分離純化