低密度脂蛋白受體相關蛋白基因、丁基膽堿酯酶基因與Alzhei

1、    低密度脂蛋白受體相關蛋白基因、丁基膽堿酯酶 基因與Alzheimer病的相關性研究        【摘要】目的探討中國漢族人低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)基因、丁基膽堿酯酶(BCHE)基因多態(tài)性與Alzheimer病(AD)的相關情況。方法 應用PCR-RFLP方法，在38例AD患者和40名正常人中觀察LRP和BCHE基因多態(tài)性的分布，進行關聯(lián)分析。結果AD患者LRP基因C/C純合子基因型頻率及等位基因C頻率均高于對照組(P<0.05)，AD患者B

2、CHE基因各基因型頻率及等位基因頻率與對照組比較均無顯著性差異。結論中國人群中，LRP基因多態(tài)性與AD呈正相關；BCHE基因多態(tài)性與AD發(fā)病無關?！娟P鍵詞】Alzheimer病低密度脂蛋白受體相關蛋白基因丁基膽堿酯酶基因 Study on the relationship between LRP gene,BCHE gene and Alzheimer diseaseBi Sheng, Zhang Yu,Wu JiangDepartment of Neurology,the First Clinical College of Harbin Medical University,Harbin 1

3、50001【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship between LRP gene,BCHE gene polymorphism and Alzheimer disease(AD) in Chinese.MethodsThe gene polymorphism distribution of LRP and BCHE was observed in 38 AD patients and 40 controls with PCR-RFLP methods,and was analysed relatedly as well.Resul

4、tsThe frequencies of LRP gene C/C homozygote genotype and C allele in AD patients were higher than in the controls (P<0.05),There was no remarkable difference between each genotype frepuency of BCHE gene,the frepuency of allele in AD patients and the controls.ConclusionsIn Chinese LRP gene polymo

5、rphism was positive correlation to AD.There was no association between BCHE gene polymorphism and AD.【Key words】Alzheimer diseaseLRP geneBCHE gene Alzheimer病(AD)具有遺傳異質(zhì)性。在腦組織中，低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)作為載脂蛋白E(apoE)的主要受體，參與神經(jīng)修復過程中脂類的修復作用。近年發(fā)現(xiàn)，在AD患者腦內(nèi)老年斑、神經(jīng)原纖維纏結和淀粉樣血管病變中發(fā)現(xiàn)有丁基膽堿酯酶(BCHE)活性的改變1，2。因此，作為AD的兩種病理伴隨性物

6、質(zhì)，LRP基因、BCHE基因與AD的相互關系受到了普遍關注。我國尚未見這方面的報道。本研究應用聚合酶鏈反應-限制性片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術，觀察AD患者LRP基因和BCHE基因多態(tài)性的分布，并對它們與AD的相互關系及在AD患者中的相互影響進行探討。1對象與方法1.1對象AD組38例，男21例，女17例，年齡6079歲，平均70.2±6.7歲；均為1997年10月1999年2月在哈醫(yī)大一院和白求恩醫(yī)大一院神經(jīng)科門診和住院治療的AD患者，根據(jù)美國精神病學會診斷和統(tǒng)計手冊第4版癡呆診斷標準(DSM-IV)作出癡呆的診斷，再根據(jù)美國國立神經(jīng)病語言障礙卒中研究所和AD及相關疾病協(xié)

7、會(NINCDS-ADRDA)3標準作出AD的診斷。對照組40名，男24名，女16名，年齡6081歲，平均68.1±4.3歲。均為健康老年人，兩組研究對象均為隨機選擇，無血緣關系。1.2方法1.2.1基因組DNA的提取按常規(guī)方法提取外周血白細胞基因組DNA。1.2.2LRP基因型檢測4引物為5'-GGGGTCCAGGACTGCATGTA-3'和5'-AAGT-CCGTACCTCGGCAGTG-3'。PCR反應體積為25 l，內(nèi)含50 ng基因組DNA，1.25 U Taq DNA聚合酶，200 mol/L dNTPs，引物各0.25 mol/L，反應程

8、序為943分鐘，32周期(9430秒，5430秒，7230秒)，723 分鐘。取PCR產(chǎn)物(59 bp) 5 l，加5 U RsaI內(nèi)切酶，37酶切過夜后，12非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，產(chǎn)生兩種不同長度的片段，只有51 bp片段的可視為純合基因型T/T，只有32 bp片段的可視為純合基因型C/C，有51 bp和32 bp兩個片段的可視為雜合基因型C/T（1）。1LRP基因型檢測結果1純合基因型T/T；2純合基因型C/C;3雜合基因型C/T;4PCR產(chǎn)物(分子量大小為59 bp)；M核苷酸分子量標準為pBR322DNA/Hae1.2.3BCHE基因型檢測5引物為5'-ATAT

9、TTTACAGGAAATATTGATGTA-3'和5'-ATTAGAGACCCACACAACTT-3'。PCR反應體積為25 l，內(nèi)含50 ng基因組 DNA，1.5U Taq DNA聚合酶，200 mol/L dNTPs，引物各0.25 mol/L，反應程序為941 分鐘，35周期(9420秒,5320秒，7220秒)。取PCR產(chǎn)物(137 bp) 5 l，加5U Mae內(nèi)切酶，37酶切過夜后，2瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，產(chǎn)生兩種不同長度的片段，只有137 bp片段的（無酶切位點）可視為純合基因型 W/W，只有115 bp片段的可視為純合基因型 K/K，有115 b

10、p和137 bp兩個片段的可視為雜合基因型 K/W（2）。2BCHE基因型檢測結果1純合基因型W/W;2、3純合基因型K/K;4雜合基因型K/W；M核苷酸分子量標準pBR322DNA/Msp1.2.4統(tǒng)計學處理計算各等位基因和基因型頻率的分布；吻合度檢驗確定是否符合Hardy-Weinberg平衡；計算相對危險率(RR)；對AD與LRP基因或BCHE基因多態(tài)性進行關聯(lián)分析。2結果2.1AD患者與正常人LRP各等位基因和基因型頻率分布見表1。結果表明：AD與等位基因C正關聯(lián)(RR=2.648，P<0.05)；與基因型C/C正關聯(lián)(RR=2.952，P<0.05)。表1各組低密度脂蛋白

11、受體相關蛋白(LRP)基因型和等位基因頻率分布組別例數(shù)基因型等位基因C/CC/TT/TCTAD組380.816*0.1580.0260.895*0.105對照組400.6000.3250.0750.7630.237與對照組比較*P<0.052.2AD患者與正常人BCHE各等位基因和基因型頻率分布見表2。結果表明：AD與BCHE各等位基因、基因型均無關聯(lián)(均P>?0.05)。表2各組丁基膽堿酯酶(BCHE)基因型和等位基因頻率分布組別例數(shù)基因型等位基因W/WW/KK/KWKAD組380.6320.3420.0260.8030.197對照組400.6250.3250.0500.7880

12、.2122.3BCHE基因多態(tài)性在LRP基因各基因型中的分布見表3。結果表明：在3種LRP基因型中，BCHE基因多態(tài)性均與AD無關聯(lián)。表33種BCHE基因型在LRP基因各基因型中的分布(例）基因型LRP C/CLRP C/TT/TAD組對照組AD組對照組W/W191659W/K11726K/K11013討論在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，LRP是apoE的主要受體。LRP基因位于第12號染色體上，全長92 Kb，由89個外顯子組成。LRP基因外顯子3的多態(tài)性位點位于LRP cDNA的第766核苷酸，由鹼基C或T構成，相應地產(chǎn)生3種LRP基因型：C/C、C/T和T/T。這種多態(tài)性變化不改變氨基酸的序列，不產(chǎn)生

13、或破壞限制酶切位點6。本研究在中國漢族人群中檢測了LRP基因多態(tài)性與AD的相互關系，并對AD患者中兩者間的相互影響進行了探討，發(fā)現(xiàn)LRP等位基因C、基因型 C/C與AD正關聯(lián)，此與文獻6,7報道一致；表明中國人LRP基因多態(tài)性與AD關聯(lián)是由LRP基因C/C型所致，C/C型在AD患者中過度表達，導致AD組與對照組比較產(chǎn)生顯著性差異(P?0.05)。BCHE基因位于第 3號染色體上，至少存在7種以上的遺傳變異。BCHE基因的多態(tài)性位點位于BCHE cDNA的第1615核苷酸，由鹼基G或A構成，相應地產(chǎn)生3種BCHE基因型：W/W、K/W和K/K。當該位點發(fā)生由G到A的替代時，會發(fā)生Ala 539

14、Thr氨基酸替代，同時使得BCHE的活性降低。Lehmann等8報道攜帶有較高頻率的BCHE-K的患者易患AD，而本研究發(fā)現(xiàn)BCHE-K多態(tài)與AD無關聯(lián)；表明在中國人群中，BCHE基因多態(tài)性并不構成AD的危險因子。這與文獻9，10報道相符，可能由于BCHE基因多態(tài)受很多因素，如種族、地理環(huán)境等的影響，值得進一步探討。 另外，在AD患者中，BCHE基因多態(tài)性與LRP基因多態(tài)性之間無明顯的相互影響。目前的實驗結果證實 LRP基因多態(tài)性是AD發(fā)病的一個危險因子，初步顯示BCHE基因與AD遺傳易感性無關。我們擬在有關研究基礎上，進一步深入探索AD的病因及與診斷或預測有關的分子生物學指標。作者單位：畢勝

15、（150001哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經(jīng)內(nèi)科）王德生（150001哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經(jīng)內(nèi)科）盛雨辰（150001哈爾濱醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經(jīng)內(nèi)科）張昱（白求恩醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經(jīng)內(nèi)科）吳江（白求恩醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經(jīng)內(nèi)科）王守春（白求恩醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院神經(jīng)內(nèi)科）參 考 文 獻1.Geula C,Mesulam MM.Cholinesterases and the pathology of Alzheimer's disease.Alzheimer Dis Assoc Disord,1995,9:232.Gomez-Ramos P, Bouras

16、C, Moran MA. Ultrastructural localization of butyrylcholinesterase on neurofibrillary degeneration sites in the brains of aged and Alzheimer's disease patients.Brain Res,1994,640:173.McKhann G,Drachman D,Folstein M,et al.Clinical diagnosis of Alzheimer's disease:report of the NINCDS-ADRDA Wo

17、rk Group under the Auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's disease.Neurology ,1984,34:9394.Hollenbach E, Ackermann S, Hyman BT, et al. Confirmation of an association between a polymorphism in exon 3 of the low- density lipoprotein receptor-related protein ge

18、ne and Alzheimer's disease .Neurology,1998,50:19055.Jensen FS, Nielsen LR, Schwartz M. Detection of the plasma cholinesterase K variant by PCR using an amplification-created restriction site.Hum Hered,1996,46:266.Kang DE,Saitoh T,Chen X,et al.Genetic association of the low-density lipoprotein receptor-related protein gene(LRP) , an apolipoprotein E receptor,with late-onset Alzheimer's disease.Neurology,1997,49:567.Lambert JC,Wavrant-de Vrieze F,Amouyel P, et al. Association at LRP locus with spo