分子生物學(xué)大試驗(yàn)報(bào)告

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)專業(yè):學(xué)號(hào):實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒 DNADNA 提取實(shí)驗(yàn)三瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)四質(zhì)粒 DNADNA 酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定實(shí)驗(yàn)五聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCRPCR）技術(shù)體外擴(kuò)增 DNADNA實(shí)驗(yàn)六地高辛標(biāo)記的 SouthernSouthern 雜交實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌的培養(yǎng)一、目的學(xué)習(xí)細(xì)菌的培養(yǎng)方法及培養(yǎng)基的配置。二、原理在基因工程實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，細(xì)菌是不可缺少的實(shí)驗(yàn)材料。質(zhì)粒的保存、增殖和轉(zhuǎn)化；基因文庫的建立等都離不開細(xì)菌。特別是常用的大腸桿菌。大腸桿菌是含有長約3000kb的環(huán)狀染色體的棒狀細(xì)胞。它能在僅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的無機(jī)鹽的培養(yǎng)基上快速生長。當(dāng)大腸桿菌在培

2、養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其開始裂殖前，先進(jìn)入一個(gè)滯后期。然后進(jìn)入對數(shù)生長期，以2030min復(fù)制一代的速度增殖。 最后， 當(dāng)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和氧耗盡或當(dāng)培養(yǎng)基中廢物的含量達(dá)到抑制細(xì)菌的快速生長的濃度時(shí)，菌體密度就達(dá)到一個(gè)比較恒定的值，這一時(shí)期叫做細(xì)菌生長的飽和期。此時(shí)菌體密度可達(dá)到1M092Xl09/mL。培養(yǎng)基可以是固體的培養(yǎng)基，也可以是液體培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)室中最常用的是LB培養(yǎng)基。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與主要儀器（一）實(shí)驗(yàn)材料大腸桿菌（二）試劑1.胰蛋白陳2 .酵母提取物3 .氯化鈉4 .1mol/LNaOH5 .瓊脂粉6 .抗生素（氨葦青霉素、卡那霉素等）（三）儀器1 .培養(yǎng)皿2 .帶帽試管3 .涂布器

3、4 .滅菌鍋5 .無菌操作臺(tái)（含酒精燈、接種環(huán)、滅菌牙簽等）6.恒溫?fù)u床四、操作步驟（一）LB培養(yǎng)基的配制配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950m1去離子水中加入：細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白陳10g細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物5gNaCl10g搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)完全溶解，用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH位至7.0。加入去離子水至總體積為lL,在15lbf/in2（1.034105Pa）高壓下蒸氣滅菌20分鐘。這樣得到是LB液體培養(yǎng)基。LB固體培養(yǎng)基是在其液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另加瓊脂粉15g/L0（二）細(xì)菌的培養(yǎng)（1）在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 .過夜培養(yǎng)(1)先在LA液體培養(yǎng)基中加入氨葦青霉素，50叱l/50ml。(2)取34ml液體

4、培養(yǎng)基加入一只無菌的試管中。(3)用接種環(huán)或滅菌牙簽挑一個(gè)單菌落，接種于培養(yǎng)液中。(4)蓋好試管，在搖床上以60r/min速度，于37c過夜培養(yǎng)。2 .大體積培養(yǎng)(1)按1：100(V/V)的比例將過夜培養(yǎng)物加入到一無菌燒瓶中，燒瓶的體積應(yīng)該是培養(yǎng)液體積的5倍以上。(2)于37C,約200r/min劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)。(2)在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)主要是為了獲得單菌落和短期保存。平板劃線法分離單菌落(1)采用無菌技術(shù)，用接種環(huán)將接種物從平板的一側(cè)開始劃線。(2)重新消毒接種環(huán)，從第一劃線處將樣品劃線至平板的其余部分，重復(fù)劃線直至覆蓋整個(gè)平板。(見下圖)(3)于37c培養(yǎng)直至長出單菌落

5、。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論LB液體培養(yǎng)基是淡黃色清液，接種大腸桿菌過夜培養(yǎng)后，若有細(xì)菌生長，則培養(yǎng)基變渾濁(說明菌體復(fù)生長)。本次實(shí)驗(yàn)成功得到大腸桿菌培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)二質(zhì)粒DNA的提取一、目的學(xué)習(xí)堿裂解法提取質(zhì)粒的原理二、原理質(zhì)粒是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，具有雙鏈閉環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA分子。它具有自主復(fù)制能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達(dá)它攜帶的遺傳信息。目前，經(jīng)人工改造的質(zhì)粒已廣泛用作基因工程中目的基因的運(yùn)載工具一一載體。質(zhì)粒DNA的提取是依據(jù)質(zhì)粒DNA分子較染色體DNA分子小，且具有超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的特點(diǎn)，從而將質(zhì)粒DNA與大腸桿菌染色體DNA分離?，F(xiàn)在常用的方法有：堿裂解法、密度梯度離

6、心法、煮沸裂解法等。實(shí)驗(yàn)室普遍采用的堿裂解法具有操作簡便、快速、得率高的優(yōu)點(diǎn)。其主要原理：利用染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。在堿變性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋解開而變性，質(zhì)粒DNA氫鍵也大部分?jǐn)嗔?，雙螺旋也有部分解開，但共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)pH=4.8的乙酸鈉將其pH調(diào)到中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來的構(gòu)型，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏繞的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，離心后，由于浮力密度不同，染色體DNA與大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與主要儀器（一）實(shí)驗(yàn)材料含質(zhì)粒的大腸桿菌DH5x（二）

7、試劑1.LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白凍10g,酵母提取物5g,NaCl10g,溶解于1000mL蒸儲(chǔ)水中，用NaOH調(diào)pH至7.0。高壓滅菌20分鐘。2.LB平板培養(yǎng)基：在每1000mLLB液體培養(yǎng)基中中加入15g瓊脂，高壓滅菌20分鐘。（三）儀器1 .Eppendorf管、離心管架2 .10,100,1000小微量加樣器3 .臺(tái)式高速離心機(jī)4.搖床、高壓滅菌鍋四、操作步驟（一）培養(yǎng)細(xì)菌將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌接種于LB平板培養(yǎng)基上，37c培養(yǎng)24小時(shí)，然后從平板上挑取單菌落，接種于5ml液體培養(yǎng)基中，37c培養(yǎng)12小時(shí)。（二）提取步驟1、柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500NL

8、的平衡液BL,12,000rpm（13,400Xg）離心1min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（請使用當(dāng)天處理過的柱子）2、取1-5mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)，10000rpm（13,400 xg）離心1min,盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。3、向留有菌體沉淀的離心管中加入250仙L溶液P1（請先檢查是否已加入RNaseA）,使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀?！粳F(xiàn)象：均勻振蕩，直至看不見菌塊，菌液變?yōu)槿榘咨?。注意：如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低】4、向離心管中加入250NL溶液

9、P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解?！粳F(xiàn)象：此時(shí)菌體裂解，菌液變得清亮粘稠。注意：溫和地混合，不要?jiǎng)×艺鹗?，以免打斷基因組DNA,造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA斷裂片段。 該步驟操作應(yīng)快， 所用時(shí)間不超過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。如果未變得清亮，可能是由于菌體過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量?！?、向離心管中加入350NL溶液P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm(13,400 xg)離心10min,此時(shí)在離心管底部形成沉淀?！粳F(xiàn)象：產(chǎn)生白色絮狀物。注意：P3加入后應(yīng)立刻混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上

10、清。1 16、 將上一步收集的上清液(只轉(zhuǎn)移800仙L上清液)用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，注意盡量不要吸出沉淀。12,000rpm(13,400Xg)離心30-60sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。7、 向吸附柱CP3中力入600仙L漂洗液PW(請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000rpm(13,400Xg)離心30-60sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。8、重復(fù)操作步驟7。9、將吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm(13,400Xg)離心2min,目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除?！酒匆褐械囊掖?xì)堄鄷?huì)影響后續(xù)的

11、酶反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí)驗(yàn)。為確保下游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，將吸附柱CP3開蓋，置于超凈工作臺(tái)上風(fēng)干五分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液?！?0、將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100仙L洗脫緩沖液EB,室溫放置2min,12,000rpm(13,400Xg)離心2min將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。(三)瓊脂糖凝膠電泳法檢測提取的質(zhì)粒DNA五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析注：泳道5為Ladder,最上方條帶為2kb分析：由結(jié)果與Ladder比對可知，成功提取出3.5kb的質(zhì)粒。六、討論（一）P1,P2,P3的成分P1：葡萄糖（提供滲透壓，避免細(xì)胞破裂），RNA酶，鹽酸

12、，EDTA（螯合出核酸酶的金屬離子，避免DNA被降解）P2:SDS（一種去污劑，易起泡，溶解細(xì)胞膜），NaOH（堿性物質(zhì)，促進(jìn)肽聚糖水解，幫助裂解細(xì)胞膜）P3:醋酸和酉t酸鉀，PH=4.85.2（二）P1,P2,P3的作用P1:起著懸浮細(xì)菌的作用，PH值為中性。P2:起著裂解細(xì)菌的作用，為堿性，這一步又稱為堿裂解。P3為酸性，中合P3.P2加了一倍,P3也加一倍，同樣起到中和的作用.當(dāng)然，如果你用試劑盒提，最后離心上柱的液體量會(huì)多一些，一次加不完可兩次加入.電泳時(shí)在樣品中加入澳酚藍(lán)的目的，以及在澳酚藍(lán)中加入甘油和蔗糖的原因1、加入澳酚藍(lán)的目的：（1）澳酚藍(lán)呈藍(lán)色，而蛋白質(zhì)是白色，在凝膠中不明顯

13、。（2）澳酚藍(lán)的相對分子量比蛋白質(zhì)（絕大部分）小，電泳時(shí)速度比蛋白質(zhì)稍快，因此可用作指示。（3）可以根據(jù)澳酚藍(lán)電泳產(chǎn)生的藍(lán)色條帶位置判斷電泳結(jié)束時(shí)間（一般當(dāng)澳酚藍(lán)跑到末端時(shí)停止電泳）。若無澳酚藍(lán)，不好把握蛋白質(zhì)電泳到槽底的時(shí)間。如果所有的蛋白質(zhì)都電泳到了底部，就不能區(qū)別出具移動(dòng)速度對應(yīng)于相對分子質(zhì)量的關(guān)系。2、加入蔗糖和甘油的目的：跑膠前都會(huì)在Buffer（緩沖器）里的，并要和樣品充分混合，只是因?yàn)檎崽呛透视捅戎卮螅梢允箻悠烦恋近c(diǎn)樣孔中，在點(diǎn)樣孔底部鋪成一線，避免樣品漂逸，從而可以最大限度地跑到膠里去，得到更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)三瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA一.目的學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA

14、的純度，DNA的構(gòu)型，含量以及分子量的大小。二.原理瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中最常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，它簡單易行，只需少量的DNA就能檢測。其原理是澳化乙噬在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)， 瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡(luò)合物； 使得DNA發(fā)射的熒光，增強(qiáng)幾十倍。而熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品做瓊脂糖凝膠電泳的對照， 就可比較出待測樣品的濃度。 電泳后的瓊脂糖凝膠塊直接在紫外光下照射拍照， 只需510ngDNA,就可以從照片上比較鑒別。 如肉眼觀察， 可檢測至U0.010.1ng的DNA。在凝膠電泳中，DNA分子的遷移速度與分子量

15、的對數(shù)值成反比。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)，前者由分子所帶凈電荷的多少而定，后者則主要與分子大小及構(gòu)型有關(guān)。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷。 在電場中向著正極移動(dòng)，在用電泳法檢測DNA分子時(shí)，應(yīng)當(dāng)盡量減少電荷效應(yīng)。增加凝膠的濃度可以在一定程度上降低電荷效應(yīng)，使得分子的遷移速度主要由分子受凝膠阻滯程度差異所決定，提高分辨率。同時(shí)適當(dāng)降低電泳時(shí)的電壓，也可以使分子篩效應(yīng)相應(yīng)增強(qiáng)而提高分辨率。當(dāng)然也可以用同樣的方法檢測RNA。三、試劑與主要儀器（一）試劑1 .DNA樣品2 .TBE緩沖液（5的：用時(shí)需稀釋10倍（配制見附錄）3.點(diǎn)樣緩沖液Loadingbuffe

16、r（10R：0.25%澳酚藍(lán)，40%甘油4 .澳乙噬（EB）:10mg/ml澳乙呢（注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心）5 .瓊脂糖（二）儀器1 .電泳儀系統(tǒng)2 .紫外燈3.恒溫水浴箱四、操作步驟1.選擇合適的水平式電泳儀，調(diào)節(jié)電泳槽平面至水平，檢測穩(wěn)壓電源與正負(fù)極的線路。2.選擇孔徑大小適宜的點(diǎn)樣梳，垂直架在電泳槽負(fù)極的一端，使得點(diǎn)樣梳的底部與電泳槽水平面的距離為0.51.0mm。3.制備瓊脂糖凝膠：按照被分離的DAN分子的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。一般情況下可參考下表：瓊脂糖的含量（%）分離線裝DNA分子的有限圍（kb）0.360-50.620-10.7100.80.97-0.51

17、.26-0.41.54-0.22.03-0.1稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，一般配制約40ml凝膠液，置微波爐中或水浴加熱，至瓊脂糖融化均勻?！颈敬未髮?shí)驗(yàn)瓊脂糖含量主要為0.70.9%?！?.將凝膠槽洗凈擦干，兩端用膠布封好，并在一端插好梳子。待凝膠溶液冷卻至60C左右時(shí)，在凝膠溶液中加EB（EB最終濃度為0.5微克/毫升），搖勻，輕輕倒入電泳槽水平板上，除掉氣泡。待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽（槽中已加入TBE緩沖液），然后小心地拔掉梳子保持點(diǎn)樣孔完整。注意：緩沖液要高出凝膠面2mm05.待測的DNA樣品中，加入1/5體積的點(diǎn)樣緩沖液，混勻后小心的進(jìn)行點(diǎn)樣，記錄樣品點(diǎn)樣順

18、序和點(diǎn)樣量。6.開啟電源開關(guān)，最高電壓不超過5V/cmo7.泳時(shí)間看實(shí)驗(yàn)的具體要求而異，在電泳中途可用紫外燈直接觀察，DNA各條區(qū)帶分開后電泳結(jié)束。一般20分鐘至3小時(shí)，取出電泳凝膠塊直接檢測拍照?！咀⒁馐马?xiàng)：制膠過程中如果出現(xiàn)氣泡，應(yīng)及時(shí)挑破，以免影響后續(xù)的跑膠過程】實(shí)驗(yàn)四質(zhì)粒DNA酶切及瓊脂糖電泳分析鑒定一、目的學(xué)習(xí)質(zhì)粒的酶切及電泳分析。二、原理限制性切酶可以識(shí)別雙鏈DNA特定位點(diǎn)，并產(chǎn)生特異的切割，形成粘性末端或平末端，這樣有利于DNA片段再連接。限制性切酶對環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切點(diǎn)，酶切后就能產(chǎn)生多少個(gè)片段。因此，鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù)，就可以推斷切點(diǎn)的數(shù)目；從片段遷移率的

19、大小可以判斷酶切片段大小的差別。用已知相對分子量DNA為對照，通過電泳遷移率的比較，可以粗略地測出分子形狀相同的未知DNA的相對分子質(zhì)量。質(zhì)粒DNA在細(xì)胞有三種構(gòu)象：共價(jià)閉環(huán)DNA,常以超螺旋形式存在；如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的力，形成開環(huán)DNA;線狀DNA,雙鏈DNA斷開成線狀。電泳時(shí)，三種構(gòu)象中，共價(jià)閉環(huán)DNA遷移率最大，其次是線狀DNA和開環(huán)DNA。因此在本實(shí)驗(yàn)中，質(zhì)粒在電泳中呈現(xiàn)23條區(qū)帶。三、試劑與主要儀器（一）試劑1 .EcoRI酶2 .入DNA3 .TBE緩沖7夜（5X）:用時(shí)需稀釋10倍4.點(diǎn)樣緩沖液Loadingbuffer（10的：0.2

20、5%!酚藍(lán)，40%甘油5.澳乙噬（EB）:10mg/ml澳乙呢（注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心）6.瓊脂糖（二）儀器1.電泳儀系統(tǒng)2.紫外燈3.恒溫水浴箱四、操作步驟（一）質(zhì)粒DNA酶切1 .按下表將各種試劑分別加入每個(gè)Eppendorf管中：質(zhì)粒DNA15EcoRI/03酶切Buffer(10X)/jl2ddH2O/pl102 .加樣后混勻，置于37c水浴中，保溫2小時(shí)。然后每個(gè)管中加入2dLoadingbuffero（二）瓊脂糖凝膠電泳1.瓊脂糖凝膠的制備稱取0.4g瓊脂糖加入40ml0.5kBE緩沖液中，加熱熔解。冷卻至65c時(shí)加入2MEB,混勻。2.膠板制備將凝膠槽洗凈擦干，兩端用

21、膠布封好，并在一端插好梳子。然后倒入熔好的瓊脂糖，待凝膠完全凝固后，去掉兩端封條，將凝膠槽移至電泳槽（槽中已加入0.5XTBE緩沖液），拔掉梳子。注意：緩沖液要高出膠面2毫米。3 .加樣每個(gè)樣品中加入1/10體積點(diǎn)樣緩沖液，混勻后小心地加入樣品槽中，要避免相互污染。4 .電泳觀察接通電源，電壓為80V,電泳1小時(shí)左右，當(dāng)澳酚藍(lán)到達(dá)下沿1-2cm處時(shí)，停止電5 .觀察及照相將膠板拿出，用自來水小心地沖洗一下。在紫外燈下觀察結(jié)果，如果有條件也可用凝膠成像系統(tǒng)照相。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論分析注：泳道2為Marker,其余泳道為小組成員樣品，泳道6為我加的樣品。由電泳結(jié)果Ladder比較可知，500bp處

22、有一條較淺的條帶，含量十分少，是酶切得到的片段。上方較亮的的條帶是3kb,這是酶切后剩余的質(zhì)粒。由于酶切后產(chǎn)生的相同粘性末端，因此也可以發(fā)生互補(bǔ)連接，形成環(huán)狀。電泳結(jié)果說明成功得到酶切片段。2go出f產(chǎn)N/-MJUp250bo實(shí)驗(yàn)五聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)體外擴(kuò)增DNA一、目的1.學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2.了解引物設(shè)計(jì)的一般要求。二、原理聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreactionPCR）是體外酶促合成DNA片段的一種技術(shù)。利用PCR技術(shù)可在數(shù)小時(shí)之大量擴(kuò)增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。PCR進(jìn)行的基本條件：DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）

23、引物dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）TaqDNA聚合酶反應(yīng)緩沖體系PCR循環(huán)由三個(gè)步驟組成：變性使模板DNA解離成單鏈；退火使引物與模板DNA所需擴(kuò)增序列結(jié)合；延伸DNA聚合酶利用dNTP合成與模板堿基序列互補(bǔ)的DNA鏈。每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物可作為下一個(gè)循環(huán)的模板，通過30個(gè)左右循環(huán)后，目的片段的擴(kuò)增可達(dá)106 倍。引物設(shè)計(jì)：要保證PCR反應(yīng)能準(zhǔn)確，特異，有效的對引物DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通常引物設(shè)計(jì)要遵循以下原則：引物長度：1525個(gè)核甘酸；GC含量為40%60%;Tm值為55c（Tm=4（C+G）+2（A+T）計(jì)算；引物與非特異配對位點(diǎn)的配對率小于70%;引物自身配對形成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)

24、，莖的堿基對小于3,兩條引物間配對堿基數(shù)小于5個(gè)。由于影響引物的設(shè)計(jì)的因素比較多，所以常常利用計(jì)算機(jī)來輔助設(shè)計(jì)。本實(shí)驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)二中提取的質(zhì)粒DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大量得到目的DNA片段。三、試劑與儀器（一）試劑1.TaqDNA聚合酶2.10汶應(yīng)緩沖液（含25mmolMgC03 .dNTP4.引物（P1、P2）5.澳乙噬（EB）:10mg/ml澳乙%注意：該試劑具致癌作用，用時(shí)要小心。6.點(diǎn)樣緩沖液Loadingbuffer（10R：0.25%!酚藍(lán)，40%甘油。（二）儀器1 .PCR擴(kuò)增儀2.電泳儀3.臺(tái)式離心機(jī)4.紫外分析儀5.恒溫水浴6.凝膠成像系統(tǒng)四、操作步驟（一）PCR擴(kuò)增1.按

25、下表加入試劑，并小心混勻。模板為實(shí)驗(yàn)一中提取的質(zhì)粒DNA試齊體積(301)ddH2O9.5|xPrimerM13F(10pM)1dPrimerM13R(10pM)1d模板1M2xTaqMix12.50【2xTaqMix:Taq,TrisKel,dNTP（濃度為2.5mmol）,Mg2+/Mn2+【Mg2+濃度上升，擴(kuò)增增多但易出雜帶；濃度低擴(kuò)增慢但特異性高】2.設(shè)置PCR程序：94C180s994C45s33cycles:55c45sL72C45s72C600s3.運(yùn)行PCR程序（二）PCR產(chǎn)物鑒定反應(yīng)結(jié)束后，取20/PCFT物進(jìn)行1.2%瓊脂糖電泳分析。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：與Ladder比較可

26、知，主條帶位于500bp與750bp之間，大約為600bp,這是由于目標(biāo)DNA為500bp,擴(kuò)增后的產(chǎn)物為目標(biāo)DNA500bp和其兩端的引物片段長度，因此大于目標(biāo)DNA的長度。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，通過PCR擴(kuò)增成功得到了目標(biāo)DNA片段。實(shí)驗(yàn)六地高辛標(biāo)記的Southern雜交一、目的學(xué)習(xí)Southern雜交的原理及操作方法。二、原理1975年Southern發(fā)明了Southernblot分子雜交方法。這項(xiàng)技術(shù)包括在瓊脂糖凝膠上按片段大小電泳分離待檢的DNA;用NaOH對凝膠中的DNA進(jìn)行變性處理； 通過毛細(xì)管作用將單鏈DNA吸附到硝酸纖維素膜上；然后用標(biāo)記好的探針進(jìn)行雜交，洗掉沒有雜交的游離探針；經(jīng)

27、放射性自顯影（放射性標(biāo)記探針）或生化檢測（非放射性標(biāo)記）就可以證明基因片段與已知探針是否具有同源性，達(dá)到檢測樣品基因的目的。因此，Southern印跡雜交包括兩個(gè)步驟把電泳分級的DNA轉(zhuǎn)移到固定支持膜上。與標(biāo)記的DNA探針雜交。地高辛隨機(jī)引物法標(biāo)記的原理：在隨機(jī)引物法標(biāo)記的反應(yīng)液中，有隨機(jī)合成的六聚核甘酸作為引物，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和D1G-11-dUTP作為合成底物，以單鏈DNA作為模板，在Klenow酶的作用下，合成插入地高辛的DNA鏈。以地高辛標(biāo)記的探針與靶基因DNA鏈雜交后， 再通過免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測。 一般通過酶標(biāo)記地高辛抗體檢測， 就可以肯定雜交反應(yīng)的存在。免疫檢

28、驗(yàn)一般用堿性磷酸酶系統(tǒng)，BClP/NBT顯色,敏感性很高。所用的雜交膜可以選擇硝酸纖維素和尼龍膜。硝酸纖維素膜的優(yōu)點(diǎn)在于本底較低，但只能用于顯色性檢測，且不能用于重復(fù)雜交。尼龍膜分為帶正電的膜和不帶電的膜兩種。帶正電的膜對核酸結(jié)合力強(qiáng)，敏感性也高。不帶電的結(jié)合力低。敏感性差。尼龍膜的優(yōu)點(diǎn)在于雜交用過的膜，用洗脫液（0.1冶SC,0.1%SDS）煮沸5-10分鐘后去探針，可用于新的探針雜交。如果對雜交結(jié)果不滿意，如背景太高或顯色不強(qiáng)，也可洗去探針之后重新雜交。三、試劑與器材（一）試劑1.DIGRandomLabelingMix（高效）2. Anti-DIG-APConjugate3.BCIP/N

29、BTStockSolution4. BlockingReagent5.20SSC:0.3M檸檬酸鈉，3MNaCl6. 2SSC:0.03M檸檬酸鈉，0.3MNaCl7.0.2MEDTA8.變性液：0.5NNaOH,1.5MNaCl9.中和度：0.5MTris-HCl,pH7.4,3MNaCl10.Standardbuffer5SSC,0.1%（w/v）N-Lauroylsarcosine,0.02%（w/v）SDS,1%BlockingReagent11.Standardbuffer+50%formamide12. Anti-DIG-AP堿性磷酸酶標(biāo)記抗地高辛單抗體13. BCIP/NBT儲(chǔ)備

30、液：14.沖洗液：0.1MTris-HCl,0.15MNaCl.pH=7.5.15.封閉液：1%BlockingReagent/0.1MTris-HCl,0.15MNaCl.16.顯色緩沖液：0.1mMTris-HCl,0.1MNaCl,pH=9.5【堿性磷酸酶要在堿性條件下反應(yīng)】.17.TE緩沖液:10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.018. .WashSolutionI:2xSSC,0.1%SDS19.WashSolutionII:0.5xSSC,0.1%SDS（二）儀器1 .臺(tái)式離心機(jī)2.恒溫水浴3 .白磁盤4 .雜交爐5 .電泳系統(tǒng)6 .硝酸纖維素膜或尼龍膜7 .封口機(jī)四

31、、操作步驟（一）探針的標(biāo)記1.用滅菌去離子蒸儲(chǔ)水稀釋1仙gDNA總體積16仙J2 .DNA熱變性： 把DNA置于沸水中， 水浴10分鐘。 然后， 迅速地插入碎冰中3分鐘以上。3 .加4卜lDIGRandomLabelingMix（S效）,混勻后再2000RPM離心5分鐘。4 .置于37c反應(yīng)至少120分鐘。時(shí)間越長，產(chǎn)量越高。延長反應(yīng)時(shí)間至20小時(shí)可明顯增加地高辛標(biāo)記DNA的產(chǎn)量。應(yīng)根據(jù)需要控制反應(yīng)時(shí)間。5.加入2卜lEDTA以終止反應(yīng)，對于原位雜交和膜反應(yīng)雜交來說，標(biāo)記反應(yīng)可告結(jié)束，上述反應(yīng)液置于-20C保存至少一年以上。且可反復(fù)使用?？筛鶕?jù)下表估計(jì)標(biāo)記產(chǎn)量：單位（ng）DNA模標(biāo)記一小時(shí)標(biāo)

32、記二十小時(shí)10456003013010501002701500300450200010008502300300013502650（二）Southern轉(zhuǎn)移1 .將目的基因經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳的膠板從電泳槽中取出， 凝膠浸入0.25MHCl中10分鐘。HCl處理的作用主要是通過喋吟使DNA分子斷裂，因而有利于高分子量DNA的轉(zhuǎn)移，但不能處理時(shí)間過長。要轉(zhuǎn)移全部小于10kb的DNA片段時(shí)可省略此步驟。2.進(jìn)入變性液之前，用蒸儲(chǔ)水漂洗20-30分鐘。3.把凝膠浸入變性液中，室溫浸泡15分鐘X2次。4.蒸儲(chǔ)水漂洗凝膠2次。5.把凝膠浸入中和液中，室溫浸泡15分鐘X2次。6 .處理凝膠的同時(shí)，切一同樣大小的

33、尼龍膜或者硝酸纖維素膜。硝酸纖維素膜用2XSSC浸泡。剪兩Whatman3#8紙和吸水用的粗濾紙。（注意不要用手直接觸及膜面）7.準(zhǔn)備轉(zhuǎn)移用平器和支架，平器中放20代SC。支架上搭濾紙橋使得溶液能夠虹吸上來。8 .依次放：處理好的凝膠，硝酸纖維素膜，吸水紙，玻璃板，適量重物（500-1000g）o注意：檢查pH值，用硝酸膜時(shí)pH2次。（四）BCIP/NBT顯色檢測法1 .經(jīng)過雜交及雜交后的沖洗之后，膜置于沖洗液中平衡1分鐘。2 .封閉液室溫封閉至少60分鐘。【在雜交管中做效率會(huì)更高】3 .用封閉液1:2500-5000稀釋Anti-DIG-AP,例如20仙lAnti-DIG-AP加至20ml封閉液中（根據(jù)染況而調(diào)整）【加入體積少可以減少抗體和探針的稀釋】。稀釋液4c可穩(wěn)定12小時(shí)左右。4 .力口Anti-DIG-AP,37c反應(yīng)60分鐘。5