污染物高效降解微生物的分離培養(yǎng)

1、9.8 污染物高效降解微生物的分離培養(yǎng) 微生物是地球生態(tài)系統(tǒng)中最重要的分解者，也是人類生存環(huán)境的重要組成部分，同時也是人類極其寶貴的資源庫。它與人類的生產、生活，對人類的生存發(fā)展，有著十分密切的關系。人們在治理污染、保護環(huán)境的不懈努力中，在為遇到種種難題所困擾的同時，已經自覺或不自覺地利用并發(fā)揮著環(huán)境有益微生物的作用，而且在實踐中越來越認識到微生物在污染物降解、資源再生利用、綠色產品生產、生態(tài)環(huán)境保護等方面的重要作用和巨大潛力。獲取高效菌種是開發(fā)應用環(huán)境有益微生物、并進一步實現(xiàn)產業(yè)化的基礎，是該領域研究、開發(fā)工作的源頭，也是產業(yè)化發(fā)展的核心與關鍵。9.8.1 分離培養(yǎng)的基本原則和方法9.8.1

2、.1 確定分離培養(yǎng)目標 了解目標菌（微生物）的分布、營養(yǎng)、生長等特點，以及它們具有的或應具有的一些功能特性，并進而制定試驗方案。如用于生物脫氮或NH3-N去除、轉化的硝化細菌和反硝化細菌的分離，前者應是具有氨氧化作用的亞硝酸細菌和能氧化亞硝酸為硝酸的硝酸細菌。又如用于有機生活垃圾的快速處理與利用的高效微生物的分離，這些微生物的作用應能有效地使垃圾達到無害化、減量化、資源化，因此它們的發(fā)酵溫度應該很高，即應具有耐高溫的特性，以及對蛋白質、纖維素等有機物的很高的分解能力。9.8.1.2 選擇分離源 以目標微生物上述特征為依據(jù)，選擇并確定分離源。該分離源應具備以下條件：（1）所處的條件較有利于目標微

3、生物的生長。（2）存在有較大的數(shù)量。（3）有可能具備為目標菌設定的功能特性。9.8.1.3 分離“篩”的設定是選擇培養(yǎng)法的核心（1）選擇培養(yǎng)基的利用。 根據(jù)目標微生物特定的營養(yǎng)要求，設計相應的選擇培養(yǎng)基。例如，可利用不加氮源的培養(yǎng)基來分離固氮菌；解酚菌的培養(yǎng)基中應以酚作為碳源。（2）選擇培養(yǎng)條件的利用。 可利用目標菌對氧、光、pH、溫度、鹽分、壓力等的不同要求來設定選擇培養(yǎng)條件。例如，可用搖床培養(yǎng)來滿足好氧菌生長時對氧的要求；為分離芽孢桿菌，可利用芽孢耐高溫的特性，預先對樣品用800C水浴處理1020分鐘。（3）對毒物、抗菌素等特殊的敏感性或耐受性的利用。 例如，分離放線菌時可加重鉻酸鉀來抑制

4、細菌和霉菌生長，其加量為每300ml改良高氏一號培養(yǎng)基中加3%重鉻酸鉀1ml。9.8.1.4 分離樣品的破碎、分散處理進行微生物分離培養(yǎng)前，必須對分離樣品，如土壤、淤泥、活性污泥或生物膜等等充分破碎、分散，盡可能使著生在土壤粒子內外的微生物、組成污泥菌膠團的微生物都分散成單個細胞懸浮在樣品中。樣品分散程度關系到分離培養(yǎng)與計數(shù)結果的準確性，必須十分重視。具體可采用以下方法： 在放有少量玻璃珠的無菌三角瓶中加入樣品(土壤、淤泥、活性污泥、生物膜等)，再加入0.01%的焦磷酸鈉作為解絮劑，用旋渦振蕩器振蕩使樣品充分分散后，再用超聲波破碎（在冰浴中進行），然后以無菌水稀釋備用。9.8.1.5 富集培養(yǎng)

5、 利用目標微生物對營養(yǎng)、生長條件、毒物敏感性、生長速度等方面的特點，也即利用設定的篩子先進行富集培養(yǎng)，使分離源中的目標微生物數(shù)量增加，有用的性狀得到改善與提高。（1）增加目標微生物的數(shù)量，提高優(yōu)勢度。（2）與定向馴化培養(yǎng)相結合，提高、改善目標微生物某些特定的性狀。（3）減少非目標微生物的數(shù)量。（4）有利于獲得與特定環(huán)境相融性好的目標微生物群體。9.8.1.6 目標微生物的分離純化 （1）用稀釋平板法(混菌、涂布或劃線分離)或MPN法進行分離純化。 挑取單菌落，獲得一批菌株，并進一步作純化分離，最后得到純菌株。（2）性狀確認，并與篩選相結合，好中選優(yōu)。9.8.1.7 純化分離菌株的保存 菌種保存

6、時一般都要求不受雜菌污染，菌株變異很少，并能盡量保持細菌的形態(tài)和生理性狀不發(fā)生變化。同時，還應注意以下事項：（1）做好菌種保存記錄，注明菌株名稱、分離年月日、分離者姓名、 分離地點等，還應記錄有關菌株性質的數(shù)據(jù)。（2）為防止雜菌污染及意外事故，一種菌應保存23支試管備用。（3）原始菌株必須妥善保存。 具體保存方法請參考有關文獻。 9.8.2 細菌、放線菌、真菌和酵母菌的計數(shù)與分離9.8.2.1 計數(shù)用培養(yǎng)基 細菌、放線菌在清蛋白瓊脂培養(yǎng)基上，280C、培養(yǎng)10天計數(shù)。 清蛋白瓊脂培養(yǎng)基配方：蛋清蛋白 0.25 gFe2(SO4)3微量葡萄糖 1.0g 瓊脂 15 gK2HPO4 0.5g水 1

7、000 mlMgSO47H2O0.2 g pH6.87.0蛋清蛋白用0.1N NaOH數(shù)mL溶解，加一滴酚酞，使呈微紅色即可。該培養(yǎng)基適于營養(yǎng)貧瘠型類群計數(shù)使用。非貧營養(yǎng)型細菌的計數(shù)可采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基配方：牛肉膏35g瓊脂1520g蛋白胨10 g水1000 mlNaCl5 g pH7.07.2121， 20 min 若培養(yǎng)厭氧菌，則再加入：半胱氨酸-HCl 0.3g 真菌在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上，25、培養(yǎng)35天計數(shù). 孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基配方：KH2PO41.0g孟加拉紅0.033gMgSO47H2O0.5g 瓊脂20 g蛋白胨5.0g水1000 ml葡萄糖1

8、0.0gpH6.8100ml培養(yǎng)基中加入1/300孟加拉紅1ml，加壓滅菌，冷卻至4245時，無菌地加入經賽氏濾器過濾除菌的鏈霉素30微克/毫升或金霉素2微克/毫升。9.8.2.2 細菌、放線菌、霉菌和酵母菌的區(qū)別方法不論是何種培養(yǎng)基，除加有抑制劑外，一般三大類菌都可能生長，所以應了解它們菌落特征的基本區(qū)別。細菌：菌落小，細胞球狀（直徑0.51.0m），桿狀（寬0.51.5m，長1.04.0m)。放線菌：菌落較細菌干燥，不光滑，與培養(yǎng)基結合較牢.菌絲細（寬約1.0m），直徑與細菌相仿，分枝不分隔，可擴展成放射狀；一般有基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲之分，由孢子絲產生孢子。孢子的顏色、形狀大小和菌絲

9、體可溶性色素的有無等特征，是菌種鑒別的主要依據(jù)之一。 霉菌：霉菌是絲狀真菌的通稱。菌絲粗大，寬約4.08.0m，無色透明或呈現(xiàn)各種鮮艷的顏色，有營養(yǎng)菌絲與繁殖菌絲之分.多數(shù)霉菌菌絲有分隔，為多細胞分枝絲狀體.菌落疏松呈絮狀.孢子成熟時使菌落表面呈粉末狀或顆粒狀.孢子顏色因種而異，常與霉菌的水溶性色素不一而形成菌落正反面呈現(xiàn)不同顏色.各種霉菌在一定的培養(yǎng)基上生長形成的菌落大小、形狀、顏色等特征相對穩(wěn)定，是霉菌鑒定的主要依據(jù)之一。酵母菌：多數(shù)酵母菌菌落與細菌相似，但較大而厚，且多數(shù)不透明。大多菌落光滑、濕潤、粘稠，乳白色，少數(shù)干皺，呈紅色或粉紅色。菌體直徑410m，圓形、橢圓 形、卵形、檸檬形、黃

10、瓜形等，在液體培養(yǎng)中酵母菌體生長常會生成沉淀或形成菌膜。這些都是菌種鑒定的依據(jù)。9.8.2.3 放線菌的分離培養(yǎng) 放線菌為G+、單細胞原核微生物，菌體絲狀，分枝而不分隔，一般有基內菌絲、氣生菌絲及孢子絲之分。放線菌中有許多種類產抗生素，諾卡氏菌的某些種在石油脫蠟、烴類分解、丙烯腈廢水的處理中起作用，還有的種可分解纖維素、木質素。 放線菌分離方法如下：（1）樣品充分分散，并制成稀釋懸液，分純培養(yǎng)宜取高稀釋度。（2）在稀釋液中加細菌抑制劑：鏈霉素 2550/ml，或30%酚 10滴。再加霉菌抑制劑：制霉菌素 50/ml。（3）培養(yǎng)基：Waksman清蛋白培養(yǎng)基：蛋清蛋白0.25g瓊脂1520gFe

11、2(SO4)30.01gH2O1000 mlMgSO47H2O0.2 gpH6.87.0葡萄糖1 g 蛋清蛋白用0.1N NaOH數(shù)ml溶解，此培養(yǎng)基可供菌數(shù)測定及菌種純化分離使用。 改良高氏一號培養(yǎng)基：FeSO47H2O0.01gK2HPO4 0.5gMgSO47H2O0.5g淀粉(可溶性)20g NaCl0.5gH2O1000ml KNO31.0g 以少量水把淀粉調成糊狀后加入培養(yǎng)基中.每300ml培養(yǎng)基中加3%重鉻酸鉀1ml，以抑制細菌和霉菌的生長.（4）平板分離：平板涂布分離培養(yǎng)：接種菌懸液取0.1ml.推布均勻。平板混菌分離培養(yǎng)：接種菌懸液取0.51ml，加入無菌平皿，倒入 450C

12、左右的培養(yǎng)基，混勻。把接種好的平板置于25300C，培養(yǎng)715天。（5）在上述平板上挑取單菌落，接入高氏一號培養(yǎng)基平板，進行純化培養(yǎng)，280C，培養(yǎng)714天（一般7天）。9.8.2.4 酵母菌的分離培養(yǎng) 酵母菌與人類關系密切。菌體內蛋白質含量高，含多種氨基酸、VB、脂肪及其他生長因素。酵母菌許多種具有同化烴類化合物的能力，分解石油中的的蠟質，使凝固點降低，并獲得大量菌體；還可用于酒精廢水、屠宰廢水、糖蜜廢水等的處理與資源化，得到飼料酵母。另據(jù)研究，熱帶假絲酵母對含酚廢水有很好的處理效果。 酵母菌往往生長在含糖較高的環(huán)境中。多數(shù)為腐生，喜偏酸條件，最適pH為4.56。在酸性液體培養(yǎng)基中酵母菌比霉

13、菌生長快，酸性又可抑制細菌生長，故可用于酵母菌的富集培養(yǎng)。（1）培養(yǎng)基 乳酸-馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g乳酸5 mL 葡萄糖20 g水1000 Ml制法：馬鈴薯去皮、切片、稱取200g，加水煮沸30分鐘，紗布過濾，補足水至1000mL，成20% 馬鈴薯汁，加入其他成分即成。1150 C， 20分鐘， pH自然。 麥芽汁培養(yǎng)基制法： 發(fā)芽：大麥或小麥若干，洗凈，浸水612小時，150C，暗處發(fā)芽，上蓋紗布一塊，早、中、晚各淋水一次。當麥根長至麥粒兩倍時，停止發(fā)芽，曬干或烘干備用。 糖化：將麥芽磨碎，1份麥芽加4份水，650C水浴中糖化34小時，用碘液檢查糖化程度。 過濾：糖化液用46

14、層紗布過濾。若混濁，可用蛋清一只與20mL水調至生泡沫，加入糖化液中攪拌、煮沸，再過濾。 稀釋：將濾清的糖化液稀釋至56波美度，pH約6.4，加2% 瓊脂，1210C，20分鐘滅菌。（2）富集培養(yǎng) 將待分離樣品放入盛有無菌水與玻璃珠的三角瓶中，使樣品振蕩分散后取上清液，接種于乳酸-馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)液中（或酸性麥芽汁中），25280C，培養(yǎng)37天，培養(yǎng)液變混濁，產生菌膜或沉淀物。制片，用美蘭染液染色?；罱湍缚蛇€原美蘭染液，故菌體無色。（3）分離 取富集液，經適當稀釋，吸取0.2mL接入馬鈴薯-葡萄糖瓊脂平板或麥芽汁瓊脂平板，用玻璃棒涂布。正放于25280C，培養(yǎng)24小時，表面水份吸干后再倒置培

15、養(yǎng)。（4）純化與保存 挑取單菌落，用平板劃線分離、純化。純化后的菌株接種于麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2天后注入液體石蠟（無菌石蠟要滅菌2次以上）。45保存。9.8.2.5 絲狀真菌(霉菌)的分離培養(yǎng) 霉菌喜生存于偏酸性、有機質較豐富的環(huán)境。絕大多數(shù)為好氧菌。 霉菌中不少菌種被應用于發(fā)酵食品、制有機酸、抗生素、酶制劑。還有人利用鐮刀霉處理含氰廢水，利用根霉、毛霉處理酒精廢水，顯示了較強的分解有機質的能力。 霉菌分離的主要關鍵是選擇合適的培養(yǎng)基和控制適宜的培養(yǎng)條件。（1）培養(yǎng)基 馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g 蔗糖20 g瓊脂1520 g水1000 mLpH 自然，制法同酵母菌的乳酸-馬鈴薯-葡

16、萄糖培養(yǎng)基。 馬?。∕artin）培養(yǎng)基：蛋白質5gMgSO47H200.5g葡萄糖10gKH2PO41.0g瓊脂1820gH2O 1000 mL 加入1%孟加拉紅水溶液3.3mL.1210C，20分鐘滅菌. 臨用時每100mL培養(yǎng)基加入1%鏈霉素溶液0.3mL. 乳酸-馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基中的葡萄糖改成蔗糖，可用于霉菌培養(yǎng)。 查氏培養(yǎng)基：蔗糖30gFeSO40.01g NaNO32.0gMgSO47H200.5gKCl0.5 g瓊脂1820gK2HPO41.0gH2O1000mlpH自然，1150C，滅菌20分鐘。 其他： 利用一些特定的材料作培養(yǎng)基，如可利用新鮮橘皮培養(yǎng)青霉，利用甜酒曲培養(yǎng)

17、根霉等等。（2） 霉菌的分離與純化 將分離用的樣品，以無菌水制成一系列10倍稀釋懸液。 根據(jù)樣品來源選擇適當?shù)呐囵B(yǎng)基。分離土壤樣品較多采用馬丁（Martin）瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，霉變材料及河塘泥、生物膜等樣品中霉菌的分離多用查氏瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯-葡萄糖瓊脂、或馬丁氏瓊脂等。 用無菌吸管分別吸取0.51mL不同稀釋度的菌懸液，接入無菌平板，按常規(guī)的混菌法或涂布法進行分離操作.每個稀釋度一般做三個平皿. 置于23280C培養(yǎng)37天，待菌落長好作進一步分離純化. 依據(jù)菌落形狀、質地和正反面顏色，判斷是否為純培養(yǎng)物。如有細菌或其他雜菌污染，則可挑取霉菌孢子或菌絲，用平板劃線法重復分

18、離純化。對于形成固定菌落的如青霉、曲霉等，可用稀釋平板混菌法分離純化。菌落不定形、蔓延繁殖的如根霉、毛霉等，因兩個菌落極易接觸混雜，故分離時需采用較高的稀釋度或以培養(yǎng)1624小時內生長的菌絲接種。 9.8.3 特定微生物的分離培養(yǎng)9.8.3.1 芽孢菌的分離培養(yǎng) 芽孢菌參與許多有機物的轉化及生物降解，多數(shù)為好氧或兼性厭氧微生物，菌體桿狀或球狀。芽孢是在菌體內形成的圓形或橢圓形的內生孢子。芽孢的代謝活力弱，對不良環(huán)境如高溫、干燥、化學藥品等的抵抗力強。 分離步驟如下：（1）將水樣接種于刺激芽孢生長的培養(yǎng)基中，350C培養(yǎng)1824小時。將培養(yǎng)好的菌懸液置于800C水浴中加熱1020分鐘以殺死不能形

19、成芽孢的菌體。 刺激芽孢生長的培養(yǎng)基如下：蛋白胨10gKH2PO41.5g酵母膏3gNa2HPO42 g淀粉3gH2O1000 mlMgSO47H2O0.1gpH7.81210C，15分鐘（2）將加熱處理過的菌懸液稀釋為10-3、10-4、10-5，分別取0.5mL接入無菌平板，倒入芽孢菌分離培養(yǎng)基，混勻，置于35，培養(yǎng)1824小時。 芽孢菌分離培養(yǎng)基如下： 用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與70Bx麥芽汁培養(yǎng)基，溶化后以1:1的量混勻即成.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配方為：肉膏35gNaCl5 g 蛋白胨10 g瓊脂1520g H2O1000mlpH 7.07.2121，20分鐘 （3）挑取單菌落作分離純化培養(yǎng)： 單菌

20、落液體培養(yǎng)基菌懸液劃線分離，經數(shù)次重復，直至由單個細胞形成單獨的菌落。9.8.3.2 硝化細菌的分離培養(yǎng) 在污水、污泥或土壤中，有機氮化合物經氨化細菌作用，分解成氨，硝化細菌又將氨氧化成硝酸鹽，此過程為硝化作用。它包括兩個連續(xù)的階段：首先，氨經亞硝酸細菌作用氧化為亞硝酸；亞硝酸又經硝酸細菌作用氧化為硝酸。亞硝酸細菌與硝酸細菌合稱為硝化細菌。它們都為好氧化能自養(yǎng)菌。此外，還有一些異養(yǎng)細菌和放線菌、真菌中的某些種類，也能將氨轉化成亞硝酸或硝酸。硝化細菌的分離純化比較困難，主要是因為硝化細菌生長緩慢，而伴生的異養(yǎng)細菌生長迅速。在選擇性較強的硅膠平板上長出的菌落很小，直徑僅有100m，分離難度很大。（

21、1）亞硝酸細菌的分離培養(yǎng) 樣品采集 作為亞硝酸細菌的分離源，可采取湖泊中的表層淤泥、溝渠軟泥或城市污水廠的活性污泥。 亞硝酸細菌富集培養(yǎng)基：(NH4)2S042gK2HPO4 1gMgSO4 7H200.5gCaCO35gFeSO47H2O0.4gH2O1000mL NaCl2gpH 7.2 除CaCO3外，其余成分溶解于水中，裝瓶后按0.5%的比例加入CaCO3，1210C，滅菌20分鐘。 若培養(yǎng)硝酸細菌，則以KNO2 2g代替(NH4)2S04。 亞硝酸細菌富集培養(yǎng) 目的是大量淘汰異養(yǎng)細菌，增加亞硝酸細菌的菌數(shù)。具體方法如下： a. 取泥樣0.51g，投加于富集培養(yǎng)液中，混勻，置于280C

22、下培養(yǎng)23天后，開始檢測NO2-鹽的生成，通常在7天左右NO2-鹽大量出現(xiàn)。 b. 當檢出NO2-鹽后，取0.1mL富集培養(yǎng)液接種到新鮮的富集培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)并檢測NO2-鹽。 c. 經7次重復富集培養(yǎng)后，開始連續(xù)供給能源，即每隔35天，添加5%硫酸銨溶液23mL，并加入適量碳酸鈣。 硅膠平板培養(yǎng)基的制備 將硅酸鉀或硅酸鈉配制成比重為1.10的溶液，過濾澄清。取比重為1.09的鹽酸，與等體積的上述溶液混合。操作時將硅酸鈉緩慢加入鹽酸內，攪拌均勻，倒入培養(yǎng)皿內。每皿2025mL，靜置24小時，待凝固成平板后用緩流水沖洗23天，以除去氯離子，直至Cl-完全消失。滴加1%硝酸銀溶液測試，如呈白色，

23、表明有Cl-需繼續(xù)沖洗。沖洗后的平板用煮沸的蒸餾水沖洗三次以滅菌。或用紫外線照射滅菌。操作時將培養(yǎng)皿置于距紫外燈20cm處，照射30分鐘，皿蓋置于一邊同時滅菌。然后，在每個硅膠平板上加亞硝酸菌富集培養(yǎng)基2mL和5%(NH4)2S04 溶液1mL。輕輕轉動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)液分布均勻。打開皿蓋在500C烘箱內烘至平板無水流動為止。 .亞硝酸細菌的分離純化 用無菌吸管吸取0.10.2mL富集培養(yǎng)液，接種到上述制成的硅膠平板上。用無菌玻璃推棒將菌液均勻涂布在平板上。置于底部盛水的干燥器內（防水分蒸發(fā)，免使平板干裂），在28300C下培養(yǎng)1530天。當硅膠平板出現(xiàn)亞硝酸細菌菌落后，挑起菌落再接種到液體培養(yǎng)

24、基中，通過測定NO2-的生成來確定亞硝酸細菌的增殖情況。同時，取少量培養(yǎng)物接種到肉湯蛋白胨培養(yǎng)基中，如觀察到培養(yǎng)液中有異養(yǎng)細菌生長，則必須重復以上的純化分離操作。也可用接種環(huán)挑取富集培養(yǎng)液，點種于硅膠平板分離培養(yǎng)基表面。在皿蓋上放一張濕濾紙或如前法培養(yǎng)。由于硅膠平板有高度的選擇性，在點樣周圍的菌落均是亞硝酸細菌。 (2) 硝酸細菌的分離培養(yǎng) 取污泥或土壤少量，分別接種于硝酸細菌富集培養(yǎng)液中，混勻，30培養(yǎng)。在富集培養(yǎng)時要連續(xù)供給5%亞硝酸銨溶液數(shù)毫升，以代替硫酸銨，也有利于抑制其他菌的繁殖。 硝酸細菌的分離純化方法，原則上與亞硝酸細菌相同，可采用硅膠平板法。但在硅膠平板上要加5%亞硝酸銨溶液1

25、mL以替代硫酸銨溶液，還要投加硝酸細菌培養(yǎng)基2mL。培養(yǎng)后，在硅膠平板深層形成針頭狀菌落。也可利用硝酸細菌富集培養(yǎng)基中投加1.52%瓊脂，制成固體平板，用此平板進行分離純化。9.8.3.3 纖維素分解菌的分離培養(yǎng) 纖維素是組成植物細胞壁的主要成分，是地球上存在量最為豐富的有機物。它性狀比較穩(wěn)定，不易分解。因此，它是一類數(shù)量龐大的環(huán)境污染物，同時又是一項可開發(fā)利用的寶貴資源，它的綜合利用具有廣闊前景。自然界有一部分細菌、放線菌和真菌能誘導產生纖維素酶，進行纖維素的分解。能分解纖維素的好氧細菌主要有： 噬纖維黏菌屬(Cytophaga)、 生孢噬纖維黏菌屬(Sporocytophaga)、 纖維弧

26、菌屬(Cellvibrio)， 分解纖維素的厭氧細菌有： 奧氏梭菌(Clostridium omelianski)、 高溫溶纖維梭菌(C. Thermocelluloseum)等。 真菌中主要有以下屬的一些種： 木霉(Trichoderma)、 葡萄狀穗霉(Stachybotrys)、 葡萄孢霉(Botrytis)、 曲霉(Aspergillus)、 青霉(Penicillium)、 毛殼霉、 好熱霉 (Thermomyces)。 放線菌的諾卡氏菌屬（Nocardia）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、小單胞菌屬（Micromonospora）中也都有一些能分解纖維素的種。(1) 好氣性

27、纖維素分解菌的分離 分離源 草地表層土壤、堆腐爛植物體、湖水等可作為好氣性纖維素分解菌的分離源 培養(yǎng)基 Dubos纖維素培養(yǎng)基：NaNO30.5gK2HPO41gFe2(SO4)37H2O微量H2O1000mLMgSO47H2O0.5gpH7.5KCl0.5g 濾紙剪成小條，放入試管中，使略露出液面. Hutchison培養(yǎng)基：KH2PO41gFeCl30.01gMgSO47H2O0.3gNaNO32.5gCaCl20.1gH2O1000mLNaCl0.1gpH7.27.4 若制平板，加瓊脂1820g，1210C，滅菌15分鐘. 操作方法 a. 將采取的待分離樣品，用無菌水制成10-110-3

28、不同稀釋度的懸液。 b. 用無菌移液管吸取上述樣品懸液，接種于裝有10mL Dubos纖維素培養(yǎng)基的試管內 c. 置于25270C條件下培養(yǎng)。 每天觀察培養(yǎng)管內的變化，注意液面附近的濾紙變薄或出現(xiàn)斑點。如果分解旺盛甚至可見濾紙條被完全切斷。 d. 將無菌的Hutchison培養(yǎng)基融化，注入滅菌培養(yǎng)皿內，制成平板。把上述試管內正在破碎的濾紙適當稀釋制成懸液，吸取0.5mL接入平板上，用玻璃推棒涂布均勻，再在瓊脂表面覆蓋一張無菌濾紙，用玻璃棒（或玻璃刮刀）壓平，使濾紙緊貼在瓊脂表面。 e. 把上述平板置于底部盛水的干燥器隔板上，28300C，培養(yǎng)710天。 f. 純化分離 用接種環(huán)挑取濾紙上的菌落

29、，在含0.1%葡萄糖（過濾除菌）的赫氏平板上劃線分離。重復數(shù)次，直至分純。 g. 將濾紙剪成小片，滅菌后放到無碳源的赫氏培養(yǎng)基平板上。把在葡萄糖赫氏平板上生長的菌落，移接到濾紙片上，并在皿底相對應地編號。經培養(yǎng)后確認分解濾紙的菌種，從相應的葡萄糖赫氏平板上移接到赫氏液體培養(yǎng)基（不加瓊脂）的濾紙條上保存。 厭氣性纖維素分解菌的分離 取1g土壤（或稀釋到10-2的菌懸液1mL），接種到已滅菌的磷酸銨鈉培養(yǎng)基中，28300C，嚴格厭氧培養(yǎng)。培養(yǎng)2周左右，濾紙溶解后，再重復移殖34次，或取濾紙上生長的斑點，黃色部分，經稀釋后在平板上涂布分離。 磷酸銨鈉培養(yǎng)基配方如下：Na(NH4)HPO42gCaCO

30、35gKH2PO41gCaCl26H2O0.3gMgSO47H2O0.5g蛋白胨1gH2O1000mL 分裝試管，液層要較高，以利于深層培養(yǎng)。同時，插入濾紙條，一端露出液面。1210C滅菌20分鐘。 注意：濾紙使用前必須檢查是否有淀粉?？稍跒V紙上滴加 稀碘液，如顯蘭色，示有淀粉存在。則可用1%稀醋酸浸泡 一晝夜，用碘液檢查確認無淀粉后，再用2%蘇打水沖洗至中性，干熱滅菌后備用。 9.8.3.4 解酚菌的分離培養(yǎng) 在工業(yè)廢水的生物處理中，針對一些特定的污染物，分 離、選育高效降解菌 并接種到活性污泥或生物膜中，往往可 使處理效果明顯提高。酚是多種工業(yè)廢水中大量存在的有機 污染物，含酚廢水的排放量

31、相當大，而且較高濃度的酚對生 物具有毒性。因此，提高含酚廢水的處理效果，或使發(fā)生故 障的系統(tǒng)及時恢復處理效果，一直是該領域有關人員十分關 注的問題。而高效解酚菌的分離培養(yǎng)和應用是解決上述問題 的有效途徑。這里就酚分解微生物的分離培養(yǎng)方法作一簡要 介紹。 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基肉膏35gNaCl5g蛋白胨10gH2O1000mlpH7.07.21210C，20 營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基 肉膏35gNaCl5g蛋白胨10g瓊脂1520gH2O1000ml pH 7.07.2，1210C，20 尿素培養(yǎng)基10%尿素5mlMgSO40.05g葡萄糖1gH2O995mLK2HPO40.1gpH77.5 配

32、制時，除尿素外，其它成分混合在蒸餾水中，調pH至77.5，1150C滅菌10分鐘，待培養(yǎng)基稍冷，以無菌操作加入事先滅菌（過濾除菌）的尿素溶液，備用。 步驟 采樣： 在高濃度含酚廢水流經的場所采樣。采取排放含酚廢水下水道的淤泥、沉渣等，也可在處理含酚廢水的活性污泥或生物膜中取樣分離。 單菌株分離： 按常規(guī)稀釋平板法，對上述樣品進行單菌株分離。 解酚能力的測定： a 將所分得的菌株，在營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期（280C，約1216小時）。 b 培養(yǎng)物中加入少量濃酚液，使培養(yǎng)液酚濃度達到10mg/L左右，進行解酚酶的誘發(fā)。 c 繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2小時后再次加入濃酚液，使培養(yǎng)液酚濃度提高到

33、50mg/L左右，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4小時。 d 測定培養(yǎng)液中殘留酚的濃度，并計算酚的去除率。 菌膠團形成能力的測試： a將已選得的解酚能力較強的菌株，分別接種在盛有50mL滅菌的尿素培養(yǎng)基內 b 28，搖床上振蕩培養(yǎng)1216小時，凡能形成菌膠團的菌株，其培養(yǎng)物形成絮狀顆粒，靜置后沉于瓶底，液體澄清。凡解酚能力較強，且又能形成菌膠團的菌株即為入選菌株經擴大培養(yǎng)后即可提供生產上使用。9.8.3.5 石油降解菌的分離培養(yǎng) 石油降解菌是自然界存在的一大類能以石油為唯一碳源的微生物。它們對環(huán)境中碳氫化合物的降解、轉化，起著重要作用。隨著石油的大量開采、應用以及石油化工生產的發(fā)展，大量石油及其制品因油船觸礁、

34、油井漏油、井噴等事故進入環(huán)境；隨石油化工生產排放的廢水而進入環(huán)境的碳氫化合物量也相當可觀。從自然界分離、篩選并應用高效的石油降解菌，是提高石油化工廢水處理效果和消除環(huán)境石油污染的有效途徑之一。 分離石油降解菌用的培養(yǎng)基 石油瓊脂基礎培養(yǎng)基： 葡萄糖 2g 輕柴油或煤油 10mL 酪蛋白水解物 5g 瓊脂 20g 酵母膏 1g 陳海水 1000mL 調pH至7.0，121滅菌20分鐘，冷卻到450C，加入10mg/L過濾除菌的制霉菌素，制成平板，供分離石油降解細菌用。 上述培養(yǎng)基調pH至5.5，1210C滅菌20分鐘，冷卻到450C，加入50mg/L鏈霉素及50mg/L四環(huán)素（均預先過濾除菌），

35、制成平板，供分離石油降解真菌及酵母菌用。 石油鹽培養(yǎng)基： KNO3 2g 輕柴油或煤油 10mL MgSO47H20 1g 陳海水 1000m 121滅菌20分鐘，備用。 石油鹽硅膠平板培養(yǎng)基： a. 配制硅酸鉀溶液：在100mL加熱到近于沸騰的7%KOH溶液中，加入10g硅膠即成。在250mL錐形瓶中倒入50mL硅酸鉀溶液，1210C滅菌20分鐘，備用。 b. 在250mL錐形瓶中加入50mL石油鹽培養(yǎng)基，按0.003%濃度加入酚紅指示劑，1210C滅菌20分鐘。 c. 當石油鹽培養(yǎng)液冷卻至室溫時，加入0.5mL1%KH2PO4溶液及1mL20%磷酸溶液。 d. 將50mL硅酸鉀溶液（pH6

36、7，指示劑紅-橙色）倒入上述50mL石油鹽培養(yǎng)液中，迅速混合均勻，倒入5個培養(yǎng)皿，每皿約20mL，1分鐘后即可凝固成平板。 e. 該平板應使表面干燥后才能使用。 石油降解菌分離操作步驟 選取石油污染近海水域，使用采水器采集水樣，用采泥器采集泥樣。 吸取1mL水樣或1g泥樣，分別加到盛有9mL無菌海水的試管中，混勻后制成10-2、10-3、10-4稀釋液。 分別吸取0.1mL原始水樣及各稀釋度的水樣，接入加有制霉菌素的石油瓊脂基礎培養(yǎng)基平板和添加有鏈霉素、四環(huán)素的石油瓊脂基礎培養(yǎng)基平板上。前者分離石油降解細菌，后者分離石油降解真菌和酵母菌。 用無菌玻璃推棒將水樣均勻涂布在培養(yǎng)基表面。 倒置培養(yǎng)皿

37、，在200C條件下培養(yǎng)。 培養(yǎng)7天后，計數(shù)降解石油細菌菌數(shù)。14天后計數(shù)降解石油真菌和酵母菌菌數(shù)。同時，挑取單菌落進行各石油降解菌的純化培養(yǎng)。 將分純的個菌株，分別接種到石油鹽培養(yǎng)液中，在200C培養(yǎng)10天后，觀察培養(yǎng)液渾濁程度和液面上菌膜的厚薄，以判斷各菌株利用石油進行生長的狀況。 由于海洋中分布有瓊脂分解菌，在分離降解石油微生物時，可能有瓊脂分解菌在上述培養(yǎng)基上生長。為了避免可能出現(xiàn)的干擾，可在分離中采用石油鹽硅膠平板。操作步驟不變。9.8.3.6 光合細菌的分離培養(yǎng) 光合細菌（Photosynthetic Bacteria，略作PSB）是一大類能進行光合作用的原核生物的總稱。除藍細菌外，

38、都能在厭氧光照條件下進行不產氧的光合作用。研究與應用的實踐表明，光合細菌在高濃度有機廢水處理與資源化、水產養(yǎng)殖的水質調控與促進健康生長、在農業(yè)生產中作為高效活性菌肥等方面，發(fā)揮著十分有益的和令人矚目的作用。關于光合細菌的類群、形態(tài)與生理特征、在生態(tài)系統(tǒng)中的地位和作用等內容，請參考有關文獻與專著。這里僅就光合細菌的分離、培養(yǎng)方法作一介紹。 光合細菌的富集培養(yǎng)的一般方法 分離源 光合細菌四個科紅螺菌科（Rhodospirillaceae）、著色菌科（Chromatiaceae）、綠菌科（Chlorobiaceae）、綠色絲狀菌科（Chloroflexaceae）的各種菌，廣泛分布于地球生物圈的各處

39、。作為光合細菌的分離源 ，一般可從富營養(yǎng)化的湖泊、池沼、海灘、以及水田、硫黃泉、灌水土壤、和污水廠活性污泥、畜牧場水溝等厭氧或缺氧環(huán)境采樣。在較深的水體，可使用采水器采取厭氧層的水。在較淺的地方，可直接用吸管吸取帶底泥的水。采樣的同時記錄水溫、pH、有無H2S氣味等項內容。將采集到的水樣或泥樣放在厭氧、低溫條件下，帶回實驗室進行分離。 光合細菌富集培養(yǎng)基 用于光合細菌富集培養(yǎng)用的培養(yǎng)基有許多配方，這里僅介紹日本星野氏推薦的基本培養(yǎng)基I和基本培養(yǎng)基II。前者適合于紅螺菌科的光合細菌，后者適用于著色菌科和綠菌科的菌。 基本培養(yǎng)基I：KH2PO40.5g，K2HPO40.6g，(NH4)2SO41.

40、0g，MgSO47H2O0.2g，NaCl0.2g，CaCl22H2O0.05g，酵母浸出汁0.1g， 微量元素溶液（見后）1mL，生長因子溶液（見后）1mL，蒸餾水1000ml。 以上配制成的培養(yǎng)基pH值約6.7。 根據(jù)需要，可在上述培養(yǎng)基中添加一些成分，如富集的是缺少同化型硫酸還原系的菌種，則可在基本培養(yǎng)基I中加入0.01%硫代硫酸鈉；如是海洋性菌種，可加入3%NaCl等等。另外，如分離源中含有較多的硫酸還原菌時（尤其是采自海洋的樣品），為了抑制硫酸還原菌的生長，可把基本培養(yǎng)基I中的(NH4)2SO4、MgSO47H2O替換成NH4Cl和MgCl26H20。 含單一有機化合物的基本培養(yǎng)基I

41、配置方法如下： 在容積為20mL的螺口試管中，加入最終濃度為一定量（0.050.1%）的有機物。 加入基本培養(yǎng)基I至1/2試管的量，松松地旋上螺蓋。 1210C，滅菌15分鐘。 冷卻后加入過濾除菌的10%抗壞血酸鈉溶液0.1mL（最終濃度為0.05%），作為還原劑。 用另行滅菌的基本培養(yǎng)基I注滿試管，旋緊螺蓋。 用同樣方法可配制含各種不同的單一有機化合物的基本培養(yǎng)基I。 基本培養(yǎng)基II：KH2PO4 1.0g，NH4Cl 1.0g，MgCl26H2O 0.2g，CaCl22H2O 0.05g，微量元素溶液（見后）1mL，生長因子溶液（見后）1mL，蒸餾水 1000mL，根據(jù)需要，可在該培養(yǎng)基中

42、加入0.1%硫代硫酸鈉、3% NaCl或0.05%乙酸鈉等。 含一定濃度的H2S和CO2，并有特定pH的基本培養(yǎng)基II的配制，可參照表55進行。 例如，要配制No.1的基本培養(yǎng)基II，其中含0.1%Na2S9H2O和0.2%NaHCO3，pH=6.4，具體方法如下：在螺口試管（容積為20mL）中加入半管量的基本培養(yǎng)基II，松松地旋上螺蓋。1210C，滅菌15分鐘。冷卻后依次加入0.3mL1NHCl、0.5mL8%的NaHCO3溶液（過濾除菌）和1.0mL2%的Na2S9H2O溶液（高壓滅菌）。用另行滅菌的基本培養(yǎng)基II注滿試管，旋緊螺蓋。用同樣方法可配制含所需H2S濃度和pH值的各種基本培養(yǎng)基

43、II。將制得的裝有培養(yǎng)基的試管充分振蕩后，在冷暗處放置1晝夜，使培養(yǎng)基內完全呈厭氧狀態(tài)。在這種狀態(tài)下可保存1個月左右。表55 各種基本培養(yǎng)基II的配制方法培養(yǎng)基編號培養(yǎng)基中的濃度（%）*最終培養(yǎng)基20mL中應加入的mL數(shù)培養(yǎng)基的pHNaHCO3Na2S9H201NHCl1NaOH10.20.10.36.420.20.10.26.730.20.10.156.940.20.10.17.150.20.10.057.360.20.17.670.20.10.057.980.20.050.156.690.20.050.16.9100.20.050.057.0110.20.057.2120.20.050.0

44、57.5130.20.050.157.8140.20.0250.056.9150.20.0257.1160.20.0250.057.3170.20.0250.17.5180.20.0250.157.9 * 最終培養(yǎng)基量20mL中，加入8%NaHCO3溶液0.5mL時，其最終濃度為0.2%；若分別加入2%Na2S9H2O溶液1.0、0.5、0.25mL，它們的最終濃度分別為0.1%、0.05%、0.025%。 微量元素溶液：EDTA-2Na 2000mg， FeSO47H2O 2000mg， H3BO3 100mg，CoCl26H2O 100mg，ZnCl2 100mg， MnCl24H2O 1

45、00mg，Na2MoO42H2O 20mg，NiCl26H2O 20mg，CuCl22H2O 10mg， Na2SeO3 1mg， 蒸餾水 1000mL，保存于暗處。 生長因子溶液：維生素B1 50mg， 煙酸（維生素PP） 50mg， 對氨基苯甲酸 30mg，維生素B12 5mg， 吡多酸（維生素B6） 10mg， 生物素 5mg，蒸餾水 100mL， 保存于冷暗處。 接種 適當?shù)慕臃N量對于有效地富集到目標菌種十分重要。因為過多的接種量會使培養(yǎng)基條件發(fā)生變化，導致富集培養(yǎng)失敗。合適的接種量為：20mL富集培養(yǎng)基中加入分離用樣品12滴。 培養(yǎng) 接種后的富集培養(yǎng)管，一般先在室內暗處放置數(shù)小時至1

46、晝夜，然后移至光照下開始光合成培養(yǎng)。培養(yǎng)時間因條件而異，大約需要1星期至1個月。如果一次富集培養(yǎng)光合細菌尚未充分生長，則應繼續(xù)進行富集培養(yǎng)。即把上一次的富集培養(yǎng)物移接少量至無菌的富集培養(yǎng)液中，重復上述的培養(yǎng)過程，直至獲得有光合細菌大量生長的富集培養(yǎng)物。 光源 進行光合成培養(yǎng)時使用的光源，以白熾燈為好。因為與熒光燈相比，白熾燈不僅發(fā)出光合細菌的類胡蘿卜素吸收的短波光（450550nm），而且大量發(fā)出細菌葉綠素（Bchl）吸收的長波光（7151050nm）。 由于不同的光合細菌菌種所含有的細菌葉綠素種類不同（見表56），因此也可利用特定波長的光源來進行相應菌種的富集培養(yǎng)（van Niel，1971

47、）。 光合成培養(yǎng)的合適光照強度為5002000Lux，把培養(yǎng)管放在距白熾燈（4060W）1550cm處即可。另外，由于白熾燈會發(fā)出大量的熱，故因注意培養(yǎng)裝置內溫度的控制。表56 各種Bchl及其主要吸收光波Bchl最大吸收波長（nm）Bchl a830890Bchl b10151035Bchl c745760Bchl d725745Bchl e715725 防止藻類生長 富集培養(yǎng)中若有藻類生長，會因其光合產氧而使培養(yǎng)基內呈好氧狀態(tài)，從而引起光合細菌的生長受抑制。為了阻止藻類的生長，Swoager和Lindstrom（1971）提出可在培養(yǎng)基中加入光化學反應系II的抑制劑。另外，也可利用濾波器得

48、到波長700nm以上的光作為光源，在這樣的光照條件下，光合細菌因含有Bchl（吸收波長為700nm以上）而能夠生長，藻類則因所含Chl的吸收波長為700nm以下而不能生長。（2）各科光合細菌的富集培養(yǎng) .紅螺菌科（Rhodospirillaceae）光合細菌的富集培養(yǎng)該科光合細菌包括4屬17種1亞種。這些菌種都能利用有機物作為碳源和光合成反應的氫供體進行生長。因此，紅螺菌科的菌可用含單一有機物的基本培養(yǎng)基I，并在20300C，10002000Lux 條件下進行富集培養(yǎng)。培養(yǎng)物因菌種不同而呈現(xiàn)紅、紫、茶色等色澤。為富集紅螺菌科中的特定菌種，一般的方法是依據(jù)該菌種對某種有機物的特異利用性，配制成以

49、該有機物為單一碳源的培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)。此外，可利用不同菌種對培養(yǎng)基pH、生長因子以及光源波長范圍的不同要求，來對特定菌種進行富集培養(yǎng)。實際應用時，常根據(jù)需要把上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件組合起來，將能更有效地富集到所需的特定菌種。 以下就幾種紅螺菌科細菌的富集培養(yǎng)法作一簡要介紹。 aRhodobacter sphaeroides（球形紅菌）（原為Rhodopseudemonas sphaeroides，球形紅假單胞菌）的富集培養(yǎng)： 首先，在含有0.1%乙醇或醋酸鈉的培養(yǎng)基中進行第一次富集培養(yǎng)。然后，將一部分富集培養(yǎng)物接種到含0.1%酒石酸鈉的培養(yǎng)基中，進行第二次富集培養(yǎng)。用此法可選擇性地富集到球形紅

50、菌（R. Sphaeroides）（van Niel，1971）。但是，在R. Sphaeroides中也有些菌株不能利用酒石酸鈉為碳源。據(jù)星野氏的研究，對這些菌株的富集培養(yǎng)可在含3%NaCl的蘋果酸鈉培養(yǎng)基中進行。 bRhodopseudomonas acidophila（嗜酸紅假單胞菌）的富集培養(yǎng)： 根據(jù)Pfennig（1969）的研究，可采用不含生長因子的琥珀酸鈉培養(yǎng)基（pH=5.1）進行嗜酸紅假單胞菌的富集培養(yǎng)。 cRhodopseudomonas viridis（綠色紅假單胞菌）的富集培養(yǎng)： 采用乙醇或醋酸鈉培養(yǎng)基，并利用該菌含Bchl b而以紅外濾色器獲得1000-1050nm波長

51、的光進行照射，可有效地富集到綠色紅假單胞菌。其培養(yǎng)物呈綠色。（Drews and Giesbrecht，1966） dRhodospirillum fulvum（黃褐紅螺菌）的富集培養(yǎng)： 采用只含對-氨基苯甲酸為生長因子的0.05%苯甲酸鈉培養(yǎng)基，可有效地富集黃褐紅螺菌。（Pfennig，Eimhjellen and Liaaen，1965） 著色菌科（Chromatiaceae）光合細菌的富集培養(yǎng)法 該科光合細菌包括10屬27種。該科菌種在以CO2為碳源、H2S為光合反應氫供體的堿性培養(yǎng)基中生長良好。因此，可采用基本培養(yǎng)基II No.5或No.11，并在15300C，5002000Lux條件

52、下，對該科光合細菌進行富集培養(yǎng)，其培養(yǎng)物呈紅、紫等顏色。 盡管著色菌科的各菌種，都能在上述同樣的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下生長，但還是能夠通過適當改變培養(yǎng)條件，如改變培養(yǎng)基的pH、H2S濃度、維生素B12的有無、光強度或培養(yǎng)溫度的改變等，來富集一些特定的菌種。研究表明，高濃度H2S（0.10.2%Na2S9H2O）和強光照（10002000Lux）條件，可用于Chromatium（著色菌屬）、Thiospirillum（硫螺旋菌屬）、Thiocapsa（莢硫菌屬）和Thiocystis（囊硫菌屬）等的富集培養(yǎng)。而低濃度H2S（0.05%Na2S9H2O）、弱光照強度（200500Lux）以及低溫（10200C）條件，可用于Lamprocystis（閃囊菌屬）、Amoebobacter（可變桿菌屬）和Thiodictyon（網硫菌屬）等具有氣胞的菌種的富集培養(yǎng)（Pfennig，1967）。 在上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下進行著色菌科光合細菌的富集培養(yǎng)時，往往在培養(yǎng)基中會出現(xiàn)綠菌科（Chlorob