中藥壁虎抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、中藥壁虎抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究                            作者：劉菲，王建剛，席守民，馬曉娟【摘要】  目的探討中藥壁虎抗腫瘤作用及其作用機(jī)制。方法建立移植瘤小鼠S180肉瘤模型,將50只雌鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、壁虎高組、中組、低組共5組，分別給于生理鹽水灌胃1次/d，CTX（100

2、mg/kg）腹腔注射1次，壁虎高、中、低組（13.5，9，4.5 g/kg），每天灌胃1次。14 d后,稱取荷瘤小鼠瘤重、胸腺重、脾臟重，抑瘤率、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)，觀察腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞血紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指標(biāo)；用SABC免疫組化法檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的蛋白表達(dá)，TUNEL方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果中藥壁虎可抑制小鼠肉瘤S180 生長(zhǎng)，高、中、低組抑瘤率可達(dá)49.8%，52.8%，43.1%；對(duì)免疫器官無(wú)影響；可降低腫瘤組織VEGF，bFGF蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。結(jié)論中藥壁虎有抗腫瘤活性，其抗腫瘤的部分作用可能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡及抑制腫瘤血管

3、的生成而實(shí)現(xiàn)。 【關(guān)鍵詞】  中藥壁虎 小鼠肉瘤S180 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子Abstract：ObjectiveTo study the anti-tumor action of Gecko and its mechanism.MethodsThe transplanted tumor model of the mouse S180 sarcoma was established.Fifty mice were randomly divided into five groups,the control group,the CTX group,the Gecko

4、group(high dose,middle dose,low dose).They were treated respectively with oral administration of saline,and intraperitoneal injection of CTX 100 mg/kg only one time,oral administration of Gecko in doses of 13.5，9，4.5 g/kg,one time a day.After 14 days,the anti-tumor activity was evaluated by tumor ti

5、ssue weighing. The impact on immune organ was detected by accounting thymus index, spleen index and the number of peritoneal macrophage which phagocytose chicken red blood cells.The protein express of vascular endothelin growth factor(VEGF) and basic fibroblast growth factor(bFGF) were detected by S

6、ABC immunohistochemistry. The cell apoptotic rate was detected by TUNEL method.ResultsChinese medicine Gecko could obviously inhibit S180 sarcoma of mice,the inhibiting rate was 49.8%,52.8%,43.1% ,it had no impact on immune organ.It could reduce VEGF and bFGF protein expression in tumor tissue and i

7、nduce tumor cell apoptosis.ConclusionChinese medicine Gecko has anti-tumor activity and its mechanism might be related to induction of tumor cell apoptosis and the down-regulation of protein expression of VEGF and bFGF.Key words：Chinese medicine Gecko；  S180 sarcoma of mouse；  Vascular end

8、othelin growth factor；   Basic fibroblast growth factor壁虎又稱為守宮、天龍等。為壁虎科動(dòng)物無(wú)蹼壁虎或多痣壁虎，多疣壁虎及其它幾種壁虎的干燥全體，壁虎產(chǎn)于全國(guó)各地，性味寒，主要成分含馬蜂毒類物質(zhì)及組織胺類、蛋白質(zhì)等，有攻毒療瘡、散結(jié)止疼、活血化瘀之效。近年來(lái)多作丸、散、膏等劑型入藥，臨床多用于惡性腫瘤的1。本文旨在用移植性腫瘤整體動(dòng)物研究方法，觀察中藥壁虎的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制。1  材料與方法1.1  材料1.1.1  藥品與試劑中藥壁虎購(gòu)自安徽省亳州市永剛飲片廠有限公司。將壁虎干燥全體

9、研磨成細(xì)粉干燥保存。用0.2%羧甲基纖維素將壁虎粉稀釋成混懸液備用。環(huán)磷酰胺購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號(hào)H32020857)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（TUNEL法），VEGF、bFGF免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。1. 1. 2  動(dòng)物及瘤株試驗(yàn)所用昆明種小鼠由河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證：0001350 ），體重（26±2）g，均為雌鼠。小鼠S180肉瘤的種鼠由河南省醫(yī)科所提供。1. 2  方法1.2.1  中藥壁虎對(duì)小鼠S180移植瘤的抑制作用觀察無(wú)菌抽取接種7 d 的小鼠S180腹水，用生理鹽水稀釋成

10、8 ×106·L-1細(xì)胞懸液,每鼠右前腋皮下接種0.2 ml ，24 h 后將小鼠隨機(jī)分成生理鹽水對(duì)照組、CTX組、中藥壁虎高（13.5 g/kg）、中(9 g/kg)、低(4.5 g/kg)3個(gè)劑量組共5 組,每組各10 只，每日小鼠稱重后， 陰性對(duì)照組根據(jù)體重按0.2 ml/10 g用生理鹽水灌胃1次，環(huán)磷酰胺（CTX）按100 mg/kg第1天腹腔注射1次，壁虎組用0.2%羧甲基纖維素稀釋至高（0.675 g/ml）、中(0.45 g/ml)、低(0.225 g/ml)濃度混懸液，按0.2 ml/10 g根據(jù)體重每天灌胃一次，共14 d。14 d 后小鼠稱重， 眼眶取

11、血計(jì)數(shù)白細(xì)胞數(shù)，脫臼處死取瘤塊稱重。腫瘤抑瘤率= (對(duì)照組平均瘤重- 給藥組平均瘤重）/ 對(duì)照組平均瘤重×100 %21.2.2  中藥壁虎對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響 按上述方法對(duì)小鼠S180移植瘤的抑制作用觀察14 d 后，處死動(dòng)物取胸腺、脾臟稱重。胸腺指數(shù)=胸腺重/體重，脾臟指數(shù)=脾臟重/體重3；觀察荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響4，對(duì)小鼠S180移植瘤的抑制作用觀察第14天，用藥后2 h每鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞0.4 ml，12 h后處死動(dòng)物消毒腹部，剪開(kāi)皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2 ml，轉(zhuǎn)動(dòng)固定板1 min，然后抽取腹腔液1 ml滴涂于干凈載玻片，置于37度

12、的孵箱中溫育30 min，以丙酮-甲醇液（11）固定5 min，再用4%姬姆薩瑞特氏液染色5 min，用蒸餾水漂洗晾干。在油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)巨噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)及每個(gè)巨噬細(xì)胞中被吞噬的紅細(xì)胞數(shù)，按下公式計(jì)算：    吞噬百分率（%）=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞×100 %吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)/200個(gè)巨噬細(xì)胞1.2.3  小鼠S180肉瘤組織病變化 腫瘤組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片,常規(guī)HE染色,光鏡觀察肉瘤組織病理變化。1.2.4  VEGF，bFGF蛋白表達(dá)的檢測(cè) 用SA

13、BC免疫組化法，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，將已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，VEGF及bFGF判定與分析：凡細(xì)胞漿、細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆?；蚓|(zhì)樣棕黃色結(jié)構(gòu)者為VEGF或bFGF免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞。免疫組化染色評(píng)分按Rahman等5的方法進(jìn)行，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)是：根據(jù)著色細(xì)胞的比例（染色范圍）及染色強(qiáng)度，染色范圍（陽(yáng)性細(xì)胞比率）分為04級(jí)，陰性為0分；陽(yáng)性細(xì)胞1%25%為1分；25%50%為2分；51%75%為3分；76%100%為4分。染色強(qiáng)度劃分為03級(jí)，陰性為0分；弱陽(yáng)性為1分；中等強(qiáng)度為2分；強(qiáng)陽(yáng)性為3分；兩者得分相加為最后得分。1  

14、60;      1.2.5  細(xì)胞凋亡率檢測(cè)用原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)法檢測(cè)6，小鼠肉瘤石蠟切片常規(guī)脫蠟,操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，將已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照,以不含末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)記液處理的切片作陰性對(duì)照，細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞,隨機(jī)選10個(gè)視野,每個(gè)視野觀察100個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),凋亡指數(shù)(apoptoticIndex,AI)AI(%)=陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×100%。1.2.6  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±

15、;s表示,應(yīng)用SPASS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,多組間數(shù)據(jù)采用方差分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn)。2  結(jié)果2.1  壁虎對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用由表1可知壁虎組各組瘤重明顯降低，高、中、低組抑瘤率分別為49.8%，52.8%，43.1% ，與陰性對(duì)照組相比有顯著差異（P<0.01），說(shuō)明壁虎有抗腫瘤活性。從白細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示各用藥組白細(xì)胞數(shù)均有所降低，以環(huán)磷酰胺組降低明顯（P<0.05），壁虎各組也降低，但與對(duì)照組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。表1  各組對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用(略)2.2  壁虎對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響

16、見(jiàn)表2?？芍狢TX組與對(duì)照組相比，胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)明顯降低（P<0.05）,壁虎各劑量組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。吞噬百分率與吞噬指數(shù)方面，CTX組與對(duì)照組相比顯著降低（P<0.01）；壁虎組與對(duì)照組相比明顯降低（P<0.05）。說(shuō)明中藥壁虎沒(méi)有增強(qiáng)荷瘤小鼠的免疫功能作用。表2  各組對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響(略)2.3  小鼠S180肉瘤組織病變化 見(jiàn)圖1。經(jīng)HE染色后鏡下觀察，可見(jiàn)瘤組織呈巢狀或片狀生長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞密集排列，細(xì)胞大小不同,形態(tài)各異；細(xì)胞核大小不一，核質(zhì)比例增大；染色質(zhì)呈顆粒狀，分布不均勻，可見(jiàn)不對(duì)稱性，多極性核分裂等病理性核分裂

17、象。生理鹽水組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，核固縮較少，片狀壞死區(qū)面積較小，此外癌巢間微血管豐富。環(huán)磷酰胺組有大片的細(xì)胞壞死區(qū)。壁虎各組均可見(jiàn)不同程度的片狀壞死區(qū),瘤組織內(nèi)及其周?chē)⒀芫鶞p少。2.4  壁虎對(duì)小鼠S180組織VEGF，bFGF蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖23及表3。VEGF及bFGF免疫陽(yáng)性細(xì)胞在核周胞質(zhì)(包括核膜)及細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)特異性片狀或顆粒狀棕黃色著色, 由表3 免疫組化結(jié)果顯示：VEGF，bFGF蛋白在小鼠S180肉瘤組織中呈高表達(dá)，環(huán)磷酰胺及壁虎各劑量組可降低VEGF，bFGF蛋白表達(dá)，與對(duì)照組相比有顯著差異（P<0.05）。2.5  壁虎對(duì)小鼠S180肉瘤細(xì)胞

18、凋亡率的影響見(jiàn)圖4及表3。凋亡細(xì)胞因其3-OH斷裂的末端可被TUNEL試劑特異性原位標(biāo)記，表現(xiàn)為核陽(yáng)性染色，呈棕黃色，正常細(xì)胞不能被標(biāo)記。結(jié)果見(jiàn)表3環(huán)磷酰胺組的凋亡率最高，其次為壁虎治療組,兩組的凋亡率與對(duì)照組比較差異具有顯著性(P<0.01)。表3  各組小鼠S180肉瘤組織VEGF，bFGF蛋白表達(dá)及肉瘤細(xì)胞的凋亡率  (略)3  討論壁虎雖未載入藥典，但多年臨床實(shí)踐表明，壁虎的單味藥及復(fù)方治療腫瘤均有一定的療效，尤其對(duì)食道癌、胃癌、肝癌等惡性腫瘤的治療效果明顯。壁虎的炮制在圣惠方就有：“搗羅為末”。醫(yī)學(xué)綱目中有：“烘干”的記載7。但現(xiàn)在基本上為生用和制

19、用兩種壁虎炮制方法。有關(guān)單味壁虎的藥理作用研究很少，近幾年鮮壁虎的基礎(chǔ)研究已有報(bào)道8，但干壁虎的基礎(chǔ)研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以干壁虎為研究對(duì)象，建立移植性腫瘤動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明壁虎有抗腫瘤活性；研究同時(shí)我們又對(duì)壁虎3 個(gè)劑量組的白細(xì)胞數(shù)、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)與對(duì)照組進(jìn)行比較無(wú)明顯差異，而CTX組與對(duì)照組比較下降明顯。我們?cè)趯?duì)小鼠終末與開(kāi)始的體重進(jìn)行比較，壁虎各劑量的治療組與對(duì)照組體重均增加，而CTX組體重下降。說(shuō)明壁虎與CTX比較毒性反應(yīng)較低。傳統(tǒng)中藥抗腫瘤的機(jī)制為“扶正祛邪”?！胺稣痹鰪?qiáng)機(jī)體免疫力、“祛邪”殺傷腫瘤細(xì)胞9，現(xiàn)認(rèn)為中藥在抗腫瘤方面有多途徑，多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。本文通過(guò)對(duì)胸腺指數(shù)、脾臟

20、指數(shù)、荷瘤小鼠吞噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及吞噬百分率的研究統(tǒng)計(jì)表明壁虎不能增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，說(shuō)明壁虎的抗腫瘤機(jī)制不是通過(guò)提高機(jī)體免疫力實(shí)現(xiàn)的。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡和抑制腫瘤血管的生成是現(xiàn)在研究抗腫瘤作用最重要的兩條途徑。在抗腫瘤藥物治療過(guò)程中，細(xì)胞凋亡是一種重要機(jī)制，因?yàn)榇蠖鄶?shù)抗腫瘤藥物是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮它們的抗腫瘤效應(yīng)；血管生成與腫瘤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)，抗腫瘤生成的治療策略是對(duì)腫瘤血管調(diào)控因子及其作用環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)，因此抗血管生成現(xiàn)已成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)9。VEGF和bFGF是最重要的血管生成刺激因子， 其中VEGF是連接新生血管形成各個(gè)的樞紐，它是目前發(fā)現(xiàn)的最為強(qiáng)大、專一的刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生的

21、因子，VEGF表達(dá)增強(qiáng)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)和功能異常的血管；bFGF是另一種重要的促血管生長(zhǎng)因子，它由腫瘤細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生由細(xì)胞外基質(zhì)釋放,并以旁分泌或自分泌方式發(fā)揮作用，它可上調(diào)一些重要血管生成促進(jìn)因子,如VEGF、血纖維蛋白溶酶原激活物等的表達(dá)10。為了解壁虎抗腫瘤作用的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠腫瘤組織進(jìn)行細(xì)胞凋亡及VEGF、bFGF蛋白的測(cè)定，結(jié)果表明，壁虎可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，減少VEGF、bFGF蛋白的表達(dá)，說(shuō)明其機(jī)制可能與促進(jìn)凋亡，抗腫瘤血管新生有關(guān)。綜上所述，干壁虎有一定的抗腫瘤活性，毒性反應(yīng)小?？鼓[瘤機(jī)制可能與促進(jìn)凋亡，抗腫瘤血管新生有關(guān)?！尽?#160; 1陳明,黃堅(jiān)航.中藥壁虎的化研究進(jìn)展J.世界技術(shù)-中藥現(xiàn)代化,2001,3(4)：53.2劉建文.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)-新技術(shù)與新方法,第1版M.北京：化學(xué)出版社,2003：23.3孫燕.扶正中藥的臨床和實(shí)驗(yàn)研究J.中華微生物和免疫學(xué)雜志,1993,3(4)：211.4陳奇.中藥藥理研究方法學(xué),第2版M.北京：人民衛(wèi)生出版社,2006：704.5RohmanA,Dhar DK,Yam