SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量

1、實驗教學(xué)教案首頁本次實驗項目：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量本次實驗課時：8 學(xué)時實驗類型：設(shè)計性教學(xué)要求：1 用 SDS PAGE 法測定樣品中蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量；2 熟悉操作過程；掌握實驗方法；明確實驗原理。3 夠根據(jù)實驗?zāi)康倪M(jìn)行整個實驗過程的設(shè)計與操作，如標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的選擇、分離膠與濃縮膠濃度的確定與制備、灌膠、樣品的處理、上樣量及方法的選擇、電泳時電壓的控制、染色與脫色時間的確定、并能夠?qū)﹄娪具^程中出現(xiàn)的問題加能解決，能夠獨立思考分析電泳結(jié)果，總結(jié)本實驗成功與失敗的原因。重點：實驗原理、 整個實驗過程的設(shè)計與操作， 如標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的選擇、 分離膠與濃縮膠濃度的確定與制備

2、、灌膠、樣品的處理、上樣量及方法的選擇。教學(xué)手段及教具：課堂講授，學(xué)生實驗操作。講授內(nèi)容及時間分配：課堂講授1相關(guān)知識 0.1學(xué)時2實驗?zāi)康?0.3學(xué)時3實驗原理0.3學(xué)時4實驗操作 0.3學(xué)時實驗教學(xué)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量實驗的操作技術(shù)7學(xué)時參考資料生物化學(xué)實驗SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量（設(shè)計性）相關(guān)知識1.電泳？2.影響電泳速率的因素？3.SDS 的作用？ 4. 乙醇的作用？2聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE）：丙烯酰胺TEMED甲叉丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠過硫酸銨3.分類：自然膠電泳、變性膠電泳、等電聚焦電泳、梯度膠電泳、雙向電泳、印跡轉(zhuǎn)移

3、電泳。4.不連續(xù)緩沖系統(tǒng)：SDSPAGE 電泳體系為不連續(xù)電泳體系。 Tris-Gly pH8.3濃縮膠 pH 6.8Gly -分離膠pH8.8PrCl Tris-Gly5分離膠濃度的選擇和配制方法SDS 聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量范圍分離膠的濃度 10420%30%1×1044× 10415%20%4×1041× 10510%15%1×1055× 1055%10% 5× 1052%5%* 雙丙烯酰胺丙烯酰胺摩爾比為1： 29。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的 Mr蛋白質(zhì)名稱Mr （ D）蛋白質(zhì)名稱Mr （ D）牛血清

4、清蛋白66200牛胰凝乳蛋白酶原25000雞卵清蛋白43000溶菌酶14300豬甲狀腺球蛋白669000豬胃蛋白酶35000馬心細(xì)胞色素 c12500馬肺鐵蛋白440000牛肝過氧化氫酶232000牛心乳酸脫氫酶140000兔磷酸化酶 B97400兔肌動蛋白43000胰蛋白酶抑制劑20100牛碳酸酐酶31000不同分離膠的配制方法分離膠的濃度20%!5%12%10%7.5%重蒸水0.752.353.354.054.851.5mol/L Tris-HCl(pH8.8)/ml2.52.52.52.52.5質(zhì)量濃度為 10%SDS/ml0.10.10.10.10.1凝膠貯備液 (Acr/Bis)/m

5、l6.65.04.03.32.5質(zhì)量濃度為 10% AP/ul0 0 0 0 0TEMED/ ul66666總體積 /ml10101010105%濃縮膠的配制方法重蒸水2.920.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)/ml1.25質(zhì)量濃度為 10%SDS/ml0.05凝膠貯備液 (Acr/Bis)/ml0.8質(zhì)量濃度為 10% AP/ul40TEMED/ ul6總體積 /ml5注意：根據(jù)實驗?zāi)康摹嶒炓?、實驗條件在實驗前寫出實驗設(shè)計方案一、實驗?zāi)康摹嶒炓?、實驗條件實驗?zāi)康? 用 SDS PAGE 法測定樣品中蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量；2 熟悉操作過程；掌握實驗方法；明確實驗原理。實驗要

6、求1.能夠根據(jù)實驗?zāi)康倪M(jìn)行整個實驗過程的設(shè)計與操作，注意幾個設(shè)計點:如標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的選擇依據(jù)；分離膠的確定與制備：濃度大小的依據(jù)是？分離膠配制量多少的依據(jù)是？灌膠方法的選擇？上樣量的確定：依據(jù)蛋白質(zhì)濃度大小確定上樣量，一般是樣品在含 16 種蛋白且各占比例相當(dāng)?shù)那闆r下濃度在12mg/ml 時、對凝膠大小在8× 8.2 時，上樣量為 1020ul ；電泳時電壓控制多大的選擇；能夠?qū)嶒炦^程中出現(xiàn)的問題加能解決，能夠獨立思考分析電泳結(jié)果，總結(jié)本實驗成功與失敗的原因。2利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測蛋白質(zhì)樣品的Mr 。實驗條件1實驗所需的實驗試劑和材料。2. 實驗所需的主要實驗儀器。二、實驗原理帶電

7、顆粒在單位電場中泳動的速度稱為遷移率或泳動度（mobility ）。泳動度與帶電顆粒所帶靜電荷的數(shù)量、顆粒大小和形狀有關(guān)。一般來說，顆粒所帶靜電荷的數(shù)量越多，顆粒越小，越接近球形，則泳動度越大。SDS 即十二烷基硫酸鈉（sodium dodycyl sulfate），是一種陰離子去污劑。由于SDS 帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，能使不同種類蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)原有電荷的差異。在蛋白質(zhì)溶解液中，加入SDS 和巰基乙醇，由于巰基乙醇具有還原性，因此可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原，從而使具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分成單個

8、亞基（subunit）；SDS 則可使蛋白質(zhì)的氫鍵、疏水鍵打開，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，形成近似雪茄形的長橢圓棒狀蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物，不同種類蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì) -SDS 復(fù)合物的短軸相同，約為1.8nm，而長軸則與蛋白質(zhì)的Mr 成正比。這樣，不同種類蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì) -SDS 復(fù)合物在凝膠電泳中的泳動度不再受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，而只與橢圓棒的長度，也就是蛋白質(zhì)的Mr 有關(guān)。蛋白質(zhì)的Mr 越大，遷移率越小。研究表明，在一定的條件下，蛋白質(zhì) Mr 的對數(shù)（ lgMr ）與其 Rf 成負(fù)相關(guān)。在測定未知蛋白質(zhì)的Mr 時，可選用一組合適的標(biāo)準(zhǔn)蛋白以及適宜的凝膠濃度，與待測蛋白質(zhì)樣品同時進(jìn)行SDS

9、-PAGE，然后根據(jù)已知Mr 蛋白質(zhì)的電泳遷移率與其 Mr的對數(shù)（ lgMr ）作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后根據(jù)未知Mr蛋白質(zhì)的電泳遷移率求得其Mr 。單體丙烯酰胺（ acylamide ， Acr）和交聯(lián)劑N， N-甲叉雙丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide ，Bis ）在加速劑和催化劑的作用下可以聚合聯(lián)結(jié)成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。常用的催化劑為過硫酸銨（ AP ），加速劑為四甲基乙二胺（TEMED ）。用途：亞基分子量測定、變性蛋白的分離。蛋白質(zhì)純化過程中的質(zhì)量控制。三、實驗儀器、材料與試劑（一）儀器：垂直板電泳槽；電泳儀；微量進(jìn)液器等（二）實驗材料自提取或市售蛋白質(zhì)（酶，含量在

10、2mg/ml ）樣品 3 種（號，號，號）2標(biāo)準(zhǔn)相對分子質(zhì)量（中）的蛋白質(zhì)：內(nèi)含已知相對分子質(zhì)量的5 種蛋白（各占比例相當(dāng)?shù)那闆r下濃度在 12mg/ml ）（三）實驗試劑 30%丙烯酰胺貯存液：稱取丙烯酰胺29.2g， N， N-甲叉雙丙烯酰胺 0.8g，加 dH 2O 至 100ml 。裝于棕色瓶中，置 4冰箱保存， 30 天內(nèi)使用。丙烯酰胺和N, N-亞甲雙丙烯酰胺。以溫?zé)幔ɡ谌芙怆p丙烯酰胺）的去離子水配制含有29%（ w/v ）丙烯酰胺和 1%（ w/v ） N, N -亞甲雙丙烯酰胺的貯存液，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過程中緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的

11、，故應(yīng)核實溶液的pH 值不超過 7.0。這一溶液置棕色瓶中貯存于室溫，每隔幾個月須重新配制。小心：丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚。 .分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCl緩沖液， pH8.818.15gTris （三羥甲基氨基甲烷） ，加約 80ml 重蒸水，用1mol/LHCl調(diào) pH 到 8.8，用重蒸水稀釋至最終體積為100ml ，置 4冰箱保存。3. 濃縮膠緩沖液：0.5mol/L Tris-HCl緩沖液， pH 6.86gTris ，加約 60ml 重蒸水，用1mol/L HCl調(diào) pH 到 6.8，用重蒸水稀釋至最終體積為100ml ，4冰箱保存

12、。4十二烷基硫酸鈉（SDS）： SDS 可用去離子水配成10%（ w/v ）貯存液保存于室溫。5 TEMED(N,N,N ,N -四甲基乙二胺)：市售溶液。 TEMED 通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。610%（ w/v ）過硫酸銨（ w/v）：提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基。須新鮮配制。7 Tris- 甘氨酸電極緩沖液：0.025mol/L Tris ， 0.192mol/L 甘氨酸，8 2 倍還原樣品緩沖液（2× reducing buffer ）：總體積10ml0.1%SDS ， pH8.3。0.5mol/L Tris-HCl(pH 6

13、.8)2.5ml甘油10% SDS4.0ml0.1% 溴酚藍(lán)0.5ml -巰基乙醇1.0ml9染色液：稱取 1g 考馬斯亮藍(lán)R250，溶于 250ml 甲醇，再加入100ml 冰乙酸，用dH2O 定容至1000ml 。10 脫色液：取250ml 甲醇、 100ml 冰乙酸用dH 2O 定容至 1000ml 。四、實驗操作步驟（每 67 人共做一個膠板，可進(jìn)行步驟分工合作，每人上一個樣）1凝膠模的準(zhǔn)備：清洗干凈，用紗布擦干。壓好膠條，固定好。2制備分離膠： ，每個膠板配制5ml ，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)相對分子量蛋白和待測蛋白樣品在一小燒杯中配制一定濃度（設(shè)計）一定體積的分離膠（每板配制5ml ）。最后一切準(zhǔn)

14、備好后再加入AP。問題：為什么一切準(zhǔn)備好后再加入AP ？注意移液器的使用方法？3灌注分離膠：迅速在兩玻璃板的間隙中灌注,留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長再加0.5cm) 。再在膠液面上小心注入一層水（約 23mm 高）。聚合約 30 分鐘，傾出覆蓋水層，再用濾紙條吸凈殘留水。問題：在膠液面上小心注入一層水？4制備 5%濃縮膠：每個膠板制備2.5ml。最后一切準(zhǔn)備好后再加入AP。5灌注濃縮膠：在聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠 ,立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。小心避免混入氣泡，將凝膠垂直放置于室溫下。聚合約 30 分鐘。6小心移出梳子。去掉膠條，把凝膠板固定于電泳裝置上，低面向內(nèi)。7. 內(nèi)外槽

15、各加入 Tris- 甘氨酸電極緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。問題：為什么設(shè)法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡8待測樣品的處理：待測樣品首先要測定蛋白質(zhì)濃度（2mg/ml ，本實驗已知） ，取一定量樣品中按1:1 體積比加入2 倍還原樣品緩沖液，在 100加熱3 分鐘。樣品處理集體處理，共用。問題：為什么用2 倍還原樣品緩沖液處理樣品？100加熱 3 分鐘的作用？9上樣：每板 10 個泳道，每組按予定設(shè)計的加樣順序上樣，每人設(shè)計好上樣量（從3種待測樣品中選擇 1 種），每個凝膠板留一個泳道上標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。注：上樣速度要快，不要串道。待測樣品蛋白質(zhì)濃度在2mg/ml ，一般上樣量 1020 ul10將電泳裝置與電源相接，穩(wěn)壓80V ，當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，調(diào)到120 V 。繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1cm，然后關(guān)閉電源。問題： 2 倍還原樣品緩沖液中溴酚藍(lán)的作用？11從電泳裝置上卸下玻璃板，取下凝膠：用刮勺撬開玻璃板。小心取出凝膠。12染色與脫色：凝膠進(jìn)行染色30 分鐘，