健脾養(yǎng)榮片對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠的保護(hù)作用

1、健脾養(yǎng)榮片對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠的保護(hù)作用    【摘要】  【目的】觀察健脾養(yǎng)榮片對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠免疫功能的影響。【方法】取NIH小鼠60只隨機(jī)分為6組，即健脾養(yǎng)榮片低、中、高劑量組（劑量分別為4、8、16g?kg-1?d-1），鯊肝醇組（劑量為0.055g?kg-1?d-1），模型組和正常組，每組各10只，分別按設(shè)計(jì)劑量灌胃給藥，在第5天時(shí)用環(huán)磷酰胺200mg/kg腹腔注射復(fù)制小鼠免疫低下模型，至第9天檢測(cè)各組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、碳粒廓清實(shí)驗(yàn)、骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、脾指數(shù)和脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)?！窘Y(jié)果】健脾養(yǎng)榮片中、高劑量組

2、和鯊肝醇組小鼠白細(xì)胞數(shù)顯著高于模型組（P0.01）；健脾養(yǎng)榮片中劑量組白細(xì)胞數(shù)與鯊肝醇組比較顯著升高（P0.05）。健脾養(yǎng)榮片中、高劑量組廓清指數(shù)K顯著升高（P0.05），經(jīng)校正后，其校正廓清指數(shù)a值比較，健脾養(yǎng)榮片中劑量組高于模型組（P0.01）。健脾養(yǎng)榮片中劑量組骨髓有核細(xì)胞數(shù)與模型組比較顯著升高（P0.01），顯著高于健脾養(yǎng)榮片低劑量組和鯊肝醇組（P0.05）。健脾養(yǎng)榮片中劑量組和鯊肝醇組的脾指數(shù)顯著升高（P0.05）；健脾養(yǎng)榮片中、高劑量組和鯊肝醇組均能拮抗環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用（P0.01）?！窘Y(jié)論】健脾養(yǎng)榮片能增強(qiáng)免疫功能低下小鼠的免疫功能，升高小鼠外周血白細(xì)胞

3、數(shù)。 【關(guān)鍵詞】  健脾養(yǎng)榮片/藥理學(xué) 白細(xì)胞減少/中藥療法 白細(xì)胞減少/免疫學(xué) 疾病模型 動(dòng)物 小鼠健脾養(yǎng)榮片是廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院根據(jù)許鑫梅教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)方研制而成的治療脾胃氣血虧虛證的中成藥，對(duì)白細(xì)胞減少癥有良好的療效1。本研究觀察了健脾養(yǎng)榮片對(duì)免疫功能低下模型小鼠免疫功能的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物    NIH小鼠，68周齡，雌雄各半，體質(zhì)量1822g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，粵檢證字第0025458號(hào)。1.2  藥品    環(huán)磷酰胺注射劑由

4、上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：2006306），每瓶200g，用蒸餾水溶解，稀釋成10mg/mL；鯊肝醇片由廣東市橋制藥廠（番禺）生產(chǎn)（批號(hào)：051209），用蒸餾水溶解，稀釋成2.75mg/mL；健脾養(yǎng)榮片水煎劑由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院購(gòu)得飲片，用蒸餾水水煎濃縮，配制成濃度0.20、0.40、0.80g/mL；中華墨汁由北京一得閣制，使用時(shí)先高速離心去其下層液，再低速離心去其上清液，將中層液用生理鹽水配成濃度為250g/L的墨汁；RPMI?1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；脂多糖（LPS）、T細(xì)胞絲裂源刀豆蛋白A（ConA）、二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽（MTT）均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)

5、品。1.3  儀器    722分光光度計(jì)由上海儀器分析二廠生產(chǎn)；CX21奧林巴斯光學(xué)顯微鏡由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)。1.4  造模2、分組給藥    NIH小鼠60只，在動(dòng)物房適應(yīng)飼養(yǎng)3d后，將小鼠隨機(jī)分為6組：正常組，模型組，健脾養(yǎng)榮片低、中、高劑量組（劑量分別為4、8、16g?kg-1?d-1），鯊肝醇組（劑量為0.055g?kg-1?d-1），每組各10只。正常組按常規(guī)方法喂養(yǎng)，其他組小鼠均灌胃給予相應(yīng)藥液4d，于第5天腹腔注射0.2g/kg環(huán)磷酰胺1次，然后繼續(xù)灌胃給藥4d。1.5  小鼠血白細(xì)胞

6、計(jì)數(shù)    各組于實(shí)驗(yàn)第1天（給藥前）、第5天、末次給藥（第9天）后1h分別于眼眶靜脈叢取血測(cè)定白細(xì)胞。每次取血20L，吹入盛有0.38mL白細(xì)胞稀釋液的試管中，搖勻，將蓋玻片放在白細(xì)胞計(jì)數(shù)板正中，充液，靜置23min，計(jì)數(shù)白細(xì)胞，數(shù)4角大方格的白細(xì)胞總數(shù)，×50即為白細(xì)胞數(shù)/mm3，再×106即轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)單位×109?L-1。1.6  小鼠碳粒廓清試驗(yàn)3157    于末次給藥后1h尾靜脈注入250g/L中華墨汁10mL/kg，于注射后1、5min用吸管分別從眼球后靜脈叢取血20L，溶于1g/

7、LNa2CO32mL溶液中搖勻，置分光光度計(jì)在波長(zhǎng)675nm下比色，測(cè)定光密度（D）。將小鼠頸椎脫臼處死，稱取體質(zhì)量，取出小鼠肝臟、脾臟，分別稱肝脾質(zhì)量。按下列公式計(jì)算廓清指數(shù)K或校正廓清指數(shù)a：K=（LogD1-LogD2）/（t2-t1）;a=3K×mbody/（m肝+m脾）    其中，D1、D2為不同時(shí)間所取血的光密度；t2-t1為取2份血樣的時(shí)間差。1.7  小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)5253    于末次給藥后1h，頸椎脫臼處死小鼠，剝離股骨，取右肢股骨，用體積分?jǐn)?shù)3%的醋酸10mL沖出骨髓內(nèi)細(xì)胞，在血細(xì)胞計(jì)

8、數(shù)板上計(jì)數(shù)4個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù)，所得數(shù)×2.5×104，即為一根股骨中的骨髓有核細(xì)胞數(shù)。1.8  小鼠脾指數(shù)實(shí)驗(yàn)、脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)    小鼠活殺后，分別取出各組小鼠的脾臟，用扭力天平稱質(zhì)量，所得值×100/體質(zhì)量為脾指數(shù)（I脾）。取出脾臟后，無(wú)菌制成脾細(xì)胞懸液，并配制成5×106/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100L，再分別加入完全RPMI?1640+ConA（5g/mL）溶液或LPS（20g/mL）溶液各100L，置孵箱中培養(yǎng)72h，終止培養(yǎng)前4h摻入MMT，20L/孔，培養(yǎng)終止時(shí)，先輕輕吸出上清，每孔再加

9、入100L細(xì)胞裂解液，過(guò)夜培養(yǎng)以充分溶解MMT，最后于酶標(biāo)儀570nm處測(cè)D值。1.9  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2  結(jié)果2.1  各組小鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)    表1結(jié)果顯示，第1天和第5天時(shí)各組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)比較無(wú)顯著性差異（P0.05）。第9天經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后，模型組白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著低于正常組（P0.01）；健脾養(yǎng)榮片中、高劑量組和鯊肝醇組小鼠白細(xì)胞數(shù)與模型組比較顯著升高（P0.01），而健脾養(yǎng)榮片低劑量組則無(wú)顯著性差異（P0.05）；健脾養(yǎng)榮片中、高劑量組和鯊肝醇組白細(xì)胞計(jì)數(shù)與健脾養(yǎng)榮

10、片低劑量組比較顯著升高（P0.01）；健脾養(yǎng)榮片中劑量組白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于鯊肝醇組（P0.05）。2.2  各組小鼠骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、脾指數(shù)比較    表2結(jié)果顯示，模型組與正常組比較，骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、脾指數(shù)均顯著降低（P0.01）；健脾養(yǎng)榮片中劑量組與模型組比較，骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高（P0.01），且高于健脾養(yǎng)榮片低劑量組與鯊肝醇組（P0.05），但健脾養(yǎng)榮片高劑組與模型組比較無(wú)顯著性差異（P0.05）。健脾養(yǎng)榮片中劑量組和鯊肝醇組脾指數(shù)均高于模型組（P0.05），健脾養(yǎng)榮片低、高劑量組與模型組比較無(wú)顯著性差異（P0.05）；健脾養(yǎng)榮片中、高劑量

11、組和鯊肝醇組脾指數(shù)均高于健脾養(yǎng)榮片低劑量組（P0.05）。表1  各組小鼠外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（略）Table 1  Comparison of peripheral WBC count in mice of different groups統(tǒng)計(jì)方法：方差分析；P0.01，與正常組比較；P0.01，與模型組比較；P0.05，與鯊肝醇組比較；P0.01，與健脾養(yǎng)榮片低劑量組比較表2  各組小鼠脾指數(shù)、骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（略）Table 2  Comparison of spleen index and bone marrow nucleated cell

12、 count in different groups統(tǒng)計(jì)方法：方差分析；P0.01，與正常組比較；P0.05，P0.01，與模型組比較；P0.05，與鯊肝醇組比較；P0.05，與健脾養(yǎng)榮片低劑量組比較2.3  各組小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)    表3結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺可抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞對(duì)ConA和LPS增殖的反應(yīng)，而鯊肝醇組和健脾養(yǎng)榮片中、高劑量均能顯著拮抗環(huán)磷酰胺的抑制作用（P0.01），但3組間比較差異無(wú)顯著性意義（P0.05）。表3  各組對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響（略）Table 3  Comparison of proli

13、ferative reaction of spleen lymphocytes in different groups統(tǒng)計(jì)方法：方差分析；P0.01，與正常組比較；P0.01，與模型組比較；P0.05，與健脾養(yǎng)榮片低劑量組比較2.4  小鼠碳粒廓清試驗(yàn)    表4結(jié)果表明，健脾養(yǎng)榮片中、高劑量組和鯊肝醇組與模型組及健脾養(yǎng)榮片低劑量組比較，碳粒廓清指數(shù)K顯著升高（均P0.05），碳粒廓清指數(shù)經(jīng)校正為校正指數(shù)a值后，健脾養(yǎng)榮片中劑量組a值顯著高于模型組（P0.01）。表4  小鼠碳廓清指數(shù)K和校正廓清指數(shù)a值比較（略）Table 4  C

14、omparison of carbon clearance index K and corrected carbon clearance value統(tǒng)計(jì)方法：方差分析；P0.05，與正常組比較；P0.05，P0.01，與模型組比較；P0.05，與健脾養(yǎng)榮片低劑量組比較3  討論    腫瘤的放、化療治療對(duì)造血系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)有嚴(yán)重的抑制不良反應(yīng)，甚至可以出現(xiàn)因不能耐受放、化療毒副作用而不得不終止治療情況，有時(shí)這些毒副作用直接成為危及患者生命的主要原因4。近年來(lái)，運(yùn)用中藥配合放、化療綜合治療腫瘤在臨床上已取得明顯的效果5，而具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和造血功能的中

15、藥種類非常豐富，依據(jù)中醫(yī)藥理論組成的復(fù)方對(duì)臨床常見的白細(xì)胞減少和免疫功能低下有確切的療效6。中醫(yī)認(rèn)為，白細(xì)胞減少和免疫功能低下多屬"虛勞"之氣血虛范疇。為氣血虛弱，不能濡養(yǎng)全身所致的一組證候。脾為氣血生化之源，脾虛則氣血生化不足，脾旺則氣血充盈，故健脾可以生氣血，所以說(shuō)脾為后天之本。健脾養(yǎng)榮片即是以健脾益氣方藥為主組成的，主要由人參、白術(shù)、絞股藍(lán)等組成，共奏健脾養(yǎng)胃、益氣生血之功。有研究表明7，運(yùn)用健脾養(yǎng)榮片治療氣血兩虛之白細(xì)胞減少癥，效果與鯊肝醇片相似。    環(huán)磷酰胺屬于細(xì)胞周期非特異性化療藥物，對(duì)增殖周期中各期血細(xì)胞均有殺滅作用，但對(duì)GO

16、期細(xì)胞的作用較弱8。注入小鼠腹腔后在其有殺滅細(xì)胞活力的4h內(nèi)很快將骨髓中處于增殖池的各種血細(xì)胞殺滅或部分殺滅（取決于環(huán)磷酰胺的劑量），而對(duì)于處于GO期的血細(xì)胞或非增殖池（或稱成熟儲(chǔ)備池）血細(xì)胞作用較弱。小鼠注入環(huán)磷酰胺后496h外周血白細(xì)胞總數(shù)依靠骨髓非增殖池白細(xì)胞血液釋放得以維持，由于增殖池向成熟池補(bǔ)充能力下降，外周血白細(xì)胞象無(wú)源之水越來(lái)越少，經(jīng)4d降低至最低，到第5天時(shí)，小鼠的免疫狀態(tài)就開始有所恢復(fù)9，故本實(shí)驗(yàn)選擇在第5天時(shí)造模，再用藥4d的給藥方案，觀察在免疫功能最低時(shí)小鼠的免疫能力和白細(xì)胞等情況。    器官相對(duì)質(zhì)量的變化在免疫評(píng)價(jià)中占有重要地位，如研究結(jié)

17、果與其他免疫指標(biāo)所得結(jié)果（如外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)）相平行，則該結(jié)果更為可靠，常供藥物初篩實(shí)驗(yàn)時(shí)用3722。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，健脾養(yǎng)榮片中、高劑量組均能預(yù)防白細(xì)胞減少，加強(qiáng)白細(xì)胞中吞噬細(xì)胞功能，能刺激骨髓造血，促進(jìn)骨髓有核細(xì)胞的增生，增強(qiáng)造血功能，增強(qiáng)小鼠脾臟指數(shù)和脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，從而提高免疫功能低下小鼠的免疫功能。其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。【參考文獻(xiàn)】  1羅日永，許鑫梅，鄺衛(wèi)紅健脾養(yǎng)榮片治療白細(xì)胞減少癥32例臨床觀察J新中醫(yī)，1999，31（11）：14.2趙喜新，閻杜海，王和平，等環(huán)磷酰胺引致的小鼠白細(xì)胞減少模型及動(dòng)力學(xué)分析J.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，1998，18（1）：12.3李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)M第2版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2006.4楊冬梅,賈敏,周玲玲,等.芪棗顆粒對(duì)小鼠免疫功能