木質(zhì)纖維素糖平臺基質(zhì)組成結(jié)構(gòu)的分析表征技術(shù)研究進(jìn)展

1、進(jìn)展與述評木質(zhì)纖維素糖平臺基質(zhì)組成結(jié)構(gòu)的分析表征技術(shù)研究進(jìn)展孫付保 1，王亮 1，2，譚玲 1，2，曹鈺 1，劉健權(quán) 1，張震宇 1（1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2 華南理工大學(xué)制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）摘要：纖維質(zhì)原料復(fù)雜的理化組成和多級結(jié)構(gòu)的致密不均一性，以及不同種屬原料經(jīng)不同方法預(yù)處理后的基質(zhì)差異性，導(dǎo)致了分析檢測問題的復(fù)雜性。當(dāng)前的一系列研究資料顯示，借助現(xiàn)代分析表征技術(shù)全方位多尺度地 解析天然植物細(xì)胞壁組成結(jié)構(gòu)、預(yù)處理后組成結(jié)構(gòu)變化和酶解時底物-酶構(gòu)效關(guān)系等，已經(jīng)成為普

2、遍利用的技術(shù) 手段。本文首先綜述一些代表性儀器分析方法（掃描電鏡、傅里葉紅外、X 射線衍射和核磁共振）用于表征木質(zhì) 纖維素原料預(yù)處理前后組成結(jié)構(gòu)變化和比較不同方法預(yù)處理效果的研究狀況，然后對新近出現(xiàn)的一些分析表征 技術(shù)（原子力顯微鏡、原位原子顯微鏡、多尺度顯譜和時實(shí)相關(guān)成像）和用于研究預(yù)處理及酶解時基質(zhì)動態(tài)變 化情況進(jìn)行敘述，最后對預(yù)處理和酶解領(lǐng)域獲得的進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，并對未來木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理及其酶解 研究趨勢進(jìn)行了一些展望。關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素；預(yù)處理；酶解；組成結(jié)構(gòu)；分析表征中圖分類號：TK 6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：10006613（2014）04088309DOI：10.3969/j

3、.issn.1000-6613.2014.04.016Analytic technology of characterizing the substrate architecture in theLignocellulose-to-sugar platformSUN Fubao1，WANG Liang1，2，TAN Ling1，2，CAO Yu1，LIU Jianquan1，ZHANG Zhenyu1（1Key Laboratory of Industrial Biotechnology & Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Bi

4、otechnology， Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2State Key Laboratory ofPulp and Paper Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）Abstract：A complex chemical composition and recalcitrant heterogenic architecture of lignoce

5、llulosicbiomass feedstock makes analysis and detection difficult. Meanwhile the situation is aggravated due tosubstrate diversity from different species pretreated by different methods. According to extensive literatures，modern analysis technique characterizing the composition-structure of native pl

6、ant cell wall and its change after pretreatment，as well as conformation of substrate to enzyme has become anincreasingly important tool for elucidating mechanisms of lignocellulose-to-sugar conversion. In this paper，several common analytic techniques（SEM，F(xiàn)T-IR，XRD，NMR） characterizing changes ofvario

7、us lignocellulosic cell wall architectures modified by different pretreatments were reviewed. Then recent emerging techniques in this field （AFM，in-suit AFM，multi-scale visualization，correlative imagining in real time） were discussed. Then conclusions based on the present progress ofcharacterization

8、 technique applied in dissecting lignocellulosic cell wall architectures were made. Future work in improving lignocellulose-to-sugar conversion was suggested，which gave a new insight收稿日期：2013-09-18；修改稿日期：2013-11-27?；痦?xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（20906041）、面上項(xiàng)目（21176106）及制漿造紙工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（201231）項(xiàng)目。第一作者：孫付保（197

9、5），男，博士，副教授，從事纖維質(zhì)糖化 學(xué)和能源生物技術(shù)方面的研究。E-mail fubaosun。·884·化工進(jìn)展2014 年第 33 卷to enhance the efficiency and reduce the cost of pretreatment and enzymatic hydrolysis for lignocellulosic biorefinery.Key words：lignocelluloses；pretreatment；enzymatic hydrolysis；composition and structure；analyticalchar

10、acterization在當(dāng)今社會，以可再生生物質(zhì)資源作為原料，利用生物煉制技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)生物能源和生物基產(chǎn) 品（生物燃料、生物基化學(xué)品和生物基材料）已成 為國際上的研究熱點(diǎn)，以生物質(zhì)資源為基本原料的 生物煉制已漸漸凸顯其優(yōu)勢，一個全球性的產(chǎn)業(yè)革 命正在朝著以碳水化合物為基礎(chǔ)的經(jīng)濟(jì)時代發(fā) 展1-2。然而，真正的生物質(zhì)經(jīng)濟(jì)時代尚未到來，由 于木質(zhì)纖維素復(fù)雜的理化組成和多級結(jié)構(gòu)的致密不 均一性，致使當(dāng)前在推進(jìn)纖維質(zhì)生物煉制工業(yè)化過 程中仍面臨一系列問題3-4，如 Wyman 等在分析生 物煉制纖維素乙醇時認(rèn)為，纖維素乙醇的過程成本 占到總成本的 67%，其中原料預(yù)處理的成本最高， 其次是酶生產(chǎn)和酶

11、水解過程5-7。因此，探索簡單經(jīng) 濟(jì)、安全高效和環(huán)境友好的木質(zhì)纖維素新型預(yù)處理 過程仍然是當(dāng)前和今后一段時期值得關(guān)注的重點(diǎn)研 究方向8-10。在生物質(zhì)原料方面，適合于生物煉制的原料來 源不是單一的，它涉及許多纖維質(zhì)廢棄物，這些不 同種屬的原料不僅在纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三 大組成含量不同，而且在每種組分內(nèi)部及組分之間 連接結(jié)合結(jié)構(gòu)上也有很大的差異。在生物質(zhì)預(yù)處理 方面，目前已經(jīng)涌現(xiàn)了很多技術(shù)11-15，這些預(yù)處理 技術(shù)從不同方面破壞木質(zhì)纖維素的致密結(jié)構(gòu)。而不 同種屬生物質(zhì)原料經(jīng)不同方法預(yù)處理后的差異性就 更大。因而，有必要采用現(xiàn)代分析手段從組織細(xì)胞、 微觀和納米分子等水平上，多尺度全方位地對

12、木質(zhì) 纖維素原料在預(yù)處理前、預(yù)處理后、酶解前和酶解 后等各個階段進(jìn)行深入系統(tǒng)的分析表征，不僅有助 于了解不同來源（種屬和預(yù)處理）纖維基質(zhì)的差異 性，而且有益于理解預(yù)處理機(jī)制和優(yōu)化預(yù)處理工藝， 同時對后續(xù)纖維素酶選擇、酶解工藝優(yōu)化和酶解機(jī) 理都有指導(dǎo)意義。在木質(zhì)纖維素基質(zhì)分析表征方面，目前針對木 質(zhì)纖維素組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表征的方法很多，如： 纖維素表面質(zhì)地結(jié)構(gòu)的光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡（掃 描和透射）和原子力顯微鏡觀察，化學(xué)結(jié)構(gòu)里關(guān)鍵 性化學(xué)鍵和官能團(tuán)的（近）紅外光譜法和拉曼光譜 分析，晶體特征的 X 射線衍射（XRD）和核磁共振（NMR）檢測等。這些分析表征方法不同程度地探究了纖維素的微觀納米結(jié)

13、構(gòu)、功能性化學(xué)基團(tuán)和結(jié)晶結(jié)構(gòu)，因此分別從某個方面表征了木質(zhì)纖維素基 質(zhì)復(fù)雜的組成和多級不均一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，反映了種屬 和預(yù)處理后導(dǎo)致的纖維質(zhì)差異，這對了解預(yù)處理機(jī) 制和纖維質(zhì)酶解機(jī)制以及優(yōu)化生物質(zhì)相關(guān)的預(yù)處理/ 酶解工藝都具有一定的指導(dǎo)意義?；诖?，本文著眼于目前現(xiàn)代儀器分析技術(shù)， 尤其電子掃描顯微鏡（scanning electron microscope， SEM）、紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）、X- 射線衍射（X-ray diffraction，XRD）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）應(yīng)用于木質(zhì)纖 維素原料組成結(jié)構(gòu)分析

14、表征方面的研究進(jìn)展，分析 討論了這些方法在研究木質(zhì)纖維素多糖組成結(jié)構(gòu)方 面的共性特征，并對個別技術(shù)應(yīng)用過程中存在問題 和不足進(jìn)行了分析，最后總結(jié)出這些大型儀器分析 方法應(yīng)用于木質(zhì)纖維素組成結(jié)構(gòu)研究獲得的一些結(jié) 論，并在此基礎(chǔ)上對未來木質(zhì)纖維素基質(zhì)的分析表 征方法進(jìn)行了展望。木質(zhì)纖維素基質(zhì)的 SEM 觀察目前，掃描電子顯微鏡已成為木質(zhì)纖維素基質(zhì) 表面結(jié)構(gòu)特征顯微觀察的重要技術(shù)手段。本文作 者16用常壓甘油自催化預(yù)處理法處理小麥秸稈時 利用 SEM 觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)甘油處理后，原麥草整的 齊致密結(jié)構(gòu)撕裂成單個或者體積較小的纖維束，纖 維束松散細(xì)小，表面變得粗糙，呈現(xiàn)一系列不規(guī)則 的微孔洞或裂痕（如圖

15、1）。這些結(jié)構(gòu)變化增加了 纖維比表面積，增加了纖維素與酶的接觸面積，增 加了酶的接觸位點(diǎn)及酶載荷量，從而有助于提高酶 解效率。同時，SEM 方法還可用于木質(zhì)纖維素原料不同 預(yù)處理效果的比較。本文作者17也利用 SEM 比較 了麥草的常壓甘油自催化預(yù)處理和汽爆預(yù)處理方 法，發(fā)現(xiàn)：常壓甘油和汽爆兩種自催化預(yù)處理方法 均打破了木質(zhì)纖維類生物質(zhì)復(fù)雜致密的理化結(jié)構(gòu)， 在減小纖維的平均尺寸和增加纖維表面積的同時， 也提高了纖維的粗糙度；與汽爆相比，常壓甘油水 溶液預(yù)處理導(dǎo)致纖維束更松散，更細(xì)小，有著更多 的粗糙度和比表面積（如圖 2 所示）。這些 SEM 觀1第 4 期孫付保等：木質(zhì)纖維素糖平臺基質(zhì)組成結(jié)

16、構(gòu)的分析表征技術(shù)研究進(jìn)展·885·(a)(b)圖 1 常壓甘油水溶液預(yù)處理麥草纖維表面的超微結(jié)構(gòu)觀察16(a) 汽爆(b) 甘油圖 2 汽爆和常壓甘油自催化預(yù)處理麥草表面結(jié)構(gòu)的觀察17察表明，各種預(yù)處理方法均影響了木質(zhì)纖維素基質(zhì)的表面結(jié)構(gòu)，但同一種預(yù)處理方法不但在不同預(yù)處 理?xiàng)l件下對同一種木質(zhì)纖維素的預(yù)處理效果不同， 同一種預(yù)處理方法在相同預(yù)處理?xiàng)l件下對不同種屬 纖維質(zhì)原料預(yù)處理效果也不同，而且不同預(yù)處理方 法即使在相同預(yù)處理?xiàng)l件下對同一種原料的處理效 果不一樣，不同預(yù)處理方法在不同條件下處理不同 基質(zhì)效果差異就更大。因此，不同種屬木質(zhì)纖維素 原料、不同預(yù)處理方法和不同預(yù)處

17、理?xiàng)l件下獲得纖 維基質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)差異很大。另外，通過掃描電子顯微鏡還觀察到木質(zhì)素粒 子再縮合或木質(zhì)素- 碳水化合物復(fù)合體（ Lignin- carbohydrate complex，LCC）沉積在纖維表面的現(xiàn) 象（圖 3、圖 4）。作者早期研究18中對常壓甘油自 催化預(yù)處理麥草纖維表面的微觀觀察發(fā)現(xiàn)，纖維基 質(zhì)表面存在著一些細(xì)小斑點(diǎn)圖 3(a)，通過進(jìn)一步 放大倍數(shù)圖 3(b)、(c)發(fā)現(xiàn)這些小斑點(diǎn)通常是由一 些大小直徑約為 0.10.2 m 的顆粒和/或一個長約0.20.4 m 的長條結(jié)塊構(gòu)成。因此，具有超微分子結(jié)構(gòu)的木質(zhì)素縮合物和/或 LCC 可能由球形顆粒和/ 或塊狀物兩部分構(gòu)成：球形顆

18、粒為預(yù)處理過程中產(chǎn) 生的木質(zhì)素碎片通過再縮合而形成的木質(zhì)素粒子， 塊狀物質(zhì)是包括半纖維素和纖維素及其降解物在內(nèi) 的碳水化合物?？傊?，利用 SEM 只是對木質(zhì)纖維素基質(zhì)表面 結(jié)構(gòu)分析，獲得的信息和結(jié)果仍舊有限，仍需要借 助其他理化分析手段才能進(jìn)一步獲得準(zhǔn)確信息。木質(zhì)纖維素基質(zhì)的 IR 技術(shù)紅外光譜已成為分析木質(zhì)纖維素組成結(jié)構(gòu)和化 學(xué)變化的常用方法，表 1 總結(jié)出木質(zhì)纖維素基質(zhì)中 關(guān)鍵性化學(xué)鍵和官能團(tuán)對應(yīng)的波譜。通過對各種木 質(zhì)纖維素預(yù)處理前后的化學(xué)基團(tuán)分析表征，定性確 定木質(zhì)纖維素原料在預(yù)處理過程中的組成結(jié)構(gòu)變化 情況，以期更好地了解預(yù)處理方法對原料的作用機(jī) 制和后續(xù)酶解的影響。Kim 等19用

19、 FT-IR 分析了氨2·886·化工進(jìn)展2014 年第 33 卷(a) × 1000(b) × 8000(c) × 20000圖 3 甘油預(yù)處理麥草纖維表面的木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合體（LCC）結(jié)構(gòu)11(a) 酶解前(b) 酶解后圖 4 汽爆玉米芯酶解前和酶解后被純化的木質(zhì)素-多糖復(fù)合體結(jié)構(gòu)18表 1 木質(zhì)纖維素基質(zhì)中關(guān)鍵性化學(xué)鍵或基團(tuán)特征對應(yīng)的紅外光譜波數(shù)波數(shù)/cm1光譜歸屬和基團(tuán)解釋木質(zhì)纖維素組成結(jié)構(gòu)相關(guān)波數(shù)/cm1光譜歸屬和基團(tuán)解釋木質(zhì)纖維素組成結(jié)構(gòu)相關(guān)34553410OH 鍵伸展纖維素分子內(nèi)部氫鍵斷裂1260酯吸收（愈創(chuàng)木基環(huán) CO）糖

20、醛酸脫除相關(guān)33753340OH 鍵伸展纖維素分子內(nèi)部氫鍵斷裂12181245 半纖維素和木質(zhì)素里 CO 吸收源于乙?；鶊F(tuán)脫除3295OH 鍵伸展纖維素分子間氫鍵斷裂1205HO 彎曲振動和纖維素/半纖維含量相關(guān)29202850CH 伸展振動蠟質(zhì)脂肪族相關(guān)1160COC 糖環(huán)骨架振動和纖維素/半纖維含量相關(guān)2920CH 伸展振動纖維素甲基/亞甲基斷裂1110OH 締合光帶和纖維素/半纖維含量相關(guān)1745C=O 酯鍵與木質(zhì)素側(cè)鏈脫除相關(guān)1059C=O 伸展和纖維素/半纖維含量相關(guān)1720羧酸和酯鍵與半纖維素脫除相關(guān)900糖 C1 組或糖環(huán)頻率，糖單元間非結(jié)晶纖維素-葡萄糖苷鍵16301650 C

21、=O 伸展振動(木質(zhì)素)1429/893纖維素的結(jié)晶度/非結(jié)晶度 晶體纖維素和非結(jié)晶纖維素比例15951605芳香苯環(huán)伸展與木質(zhì)素脫除相關(guān)1372/2900纖維素的結(jié)晶度/非結(jié)晶度 晶體纖維素和非結(jié)晶纖維素比例1510-糖苷鍵振動和苯環(huán)伸展 碳水化合物和木質(zhì)素脫除特征峰1098/900纖維素的結(jié)晶度/非結(jié)晶度 晶體纖維素和非結(jié)晶纖維素比例1426CH2 和 CH3 基彎曲振動1372/670纖維素的結(jié)晶度/非結(jié)晶度 晶體纖維素和非結(jié)晶纖維素比例（纖維素）1387OH 鍵彎曲或 CH 變性1510/900木質(zhì)素/纖維素比例1329CC 和 CO 骨架振動紫丁香縮合木質(zhì)素相關(guān)750/710結(jié)晶纖維

22、素 1/1結(jié)晶纖維素各晶型比例（紫丁香基環(huán) CO）第 4 期孫付保等：木質(zhì)纖維素糖平臺基質(zhì)組成結(jié)構(gòu)的分析表征技術(shù)研究進(jìn)展·887·和 1457 cm1 處的吸收波譜，分別代表著木質(zhì)素組 分和芳香環(huán)的伸展，原麥草經(jīng)溫和汽爆處理在此處 的吸收加強(qiáng)而經(jīng)常壓甘油水溶液自催化預(yù)處理吸收 峰弱化成峰肩；這表明，汽爆自催化預(yù)處理后的麥 草中仍然存有著殘?jiān)举|(zhì)素，而且木質(zhì)素含量在汽 爆麥草的相對含量高于在原麥草中的含量；而常壓 甘油水溶液自催化預(yù)處理麥草纖維中的殘?jiān)举|(zhì)素 含量已很少，相對含量比汽爆麥草中的殘?jiān)举|(zhì)素含 量要低得多；IR 分析表明，常壓甘油水溶液自催化預(yù) 處理策略在脫出木質(zhì)

23、素方面比汽爆預(yù)處理更有效。以上研究結(jié)果表明：FT-IR 方法用于分析表 征木質(zhì)纖維素基質(zhì)組成結(jié)構(gòu)的化學(xué)變化時，盡管有 種屬和預(yù)處理方法不同，但通常有相對固定的譜帶 歸屬（如表 1 所示）；FT-IR 能定性顯示出各種方 法預(yù)處理后木質(zhì)纖維素組成結(jié)構(gòu)變化信息，如乙酰 基脫除、半纖維素/木質(zhì)素鏈接酯鍵/醚鍵斷裂、纖 維素分子內(nèi)/間氫鍵斷裂等，能初步判斷半纖維素和 木質(zhì)素脫除狀況；粗略提供纖維素分子結(jié)晶度與 非結(jié)晶度比例關(guān)系，以及晶型比例等信息；提供 木質(zhì)纖維素中殘存木質(zhì)素類型的信息。這些信息為 評價各種預(yù)處理方法對不同種屬木質(zhì)素預(yù)處理效果 提供了有益幫助，也為初步判斷木質(zhì)纖維素后續(xù)酶 解可消化性提

24、供了幫助。然而，既然木質(zhì)纖維素可 消化性與許多因素有關(guān)，因此仍需要其他分析手段 繼續(xù)加深對木質(zhì)纖維素基質(zhì)特征進(jìn)行分析。水預(yù)處理玉米秸稈組成結(jié)構(gòu)的化學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)玉米秸稈含有愈創(chuàng)木基和紫丁香基兩種類型木質(zhì)素，特 征吸收峰分別在 1218 cm1、1268 cm1（愈創(chuàng)木環(huán) CO）、1315 cm1（紫丁香環(huán) CO）和 15021600 cm（1 芳香骨架振動）；氨循環(huán)滲漏（ammonia recycle percolation，ARP）處理后玉米秸稈樣品所有木質(zhì)素 吸收峰（15021600 cm1）強(qiáng)度均比處理前明顯減 弱，顯示了 ARP 預(yù)處理的木質(zhì)素脫除效果。這方面 研究表明，IR 技術(shù)可用初

25、步判斷預(yù)處理對木質(zhì)纖維 素基質(zhì)化學(xué)組成的影響，如半纖維素和木質(zhì)素脫除、 纖維素/半纖維素分子內(nèi)和分子間氫鍵結(jié)合、纖維素 結(jié)晶度和非結(jié)晶度比例等。同時，IR 方法還可用于不同方法預(yù)處理纖維基 質(zhì)特征的比較。本文作者17先前對汽爆和常壓甘油 自催化預(yù)處理麥草前后紅外分析表明（圖 5），預(yù)處 理前后基質(zhì)在 1049 cm1 處由于多聚糖（纖維素和 半纖維素）中 COC 伸展引起一個強(qiáng)烈的窄峰； 1425 cm1 是由 CH 和 OH 彎曲造成的，1382 cm1 來源于 CH2 和 OH 彎曲，在異頭區(qū)（950700 cm1）的 899 cm1 處小尖峰代表著多聚糖中 -葡聚 糖苷鍵；與原麥草纖維相

26、比，兩種預(yù)處理麥草纖維 中在 1159 cm1 和 1107 cm1 處分別來源于 CO 反 對稱橋伸展和 COH 骨架振動的特征峰都明顯增 加，原麥草纖維在 1735 cm1 處的酯鍵（C=O）峰 經(jīng)汽爆預(yù)處理后明顯減弱，經(jīng)常壓甘油水溶液自催 化預(yù)處理后幾乎消失了；這些信息表明，在汽爆和 常壓甘油自催化預(yù)處理麥草的纖維中，連接多糖和 木質(zhì)素之間的阿魏酸、對羥基苯甲酸和對羥基肉桂 酸等關(guān)鍵性酯鍵都被打斷，而且常壓甘油自催化預(yù) 處理技術(shù)比汽爆技術(shù)更有效，能斷裂更多木質(zhì)素和3木質(zhì)纖維素基質(zhì)結(jié)晶結(jié)構(gòu)的 XRD分析X 射線衍射（XRD）已經(jīng)廣泛用于分析表征不 同方法預(yù)處理的各種木質(zhì)纖維素結(jié)晶度和晶體結(jié)

27、構(gòu) 的變化情況。Kim 等20利用 XRD 分析了石灰水預(yù) 處理玉米秸的結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)石灰水處理后秸稈纖 維結(jié)晶度提高可能是由于木質(zhì)素/半纖維素等非結(jié)cm1多糖之間的關(guān)鍵性酯鍵。另一方面，在 1510等19通過晶組分脫除而導(dǎo)致的。同樣，KimXRD對 ARP 預(yù)處理玉米秸進(jìn)行了分析，預(yù)處理后纖維結(jié)晶度指數(shù)明顯增加，認(rèn)為但該預(yù)處理并未打破纖維 素分子內(nèi)/間氫鍵，而是由于脫除其中木質(zhì)素和半纖 維素等非結(jié)晶成分而纖維素相對增加所導(dǎo)致的?？?之，研究表明，目前大多數(shù)預(yù)處理，如稀酸、稀/ 弱堿（石灰水、ARP）和微波等并不能作用于木質(zhì) 纖維素的纖維素結(jié)晶區(qū)，而是通過作用于木質(zhì)纖維 素非結(jié)晶區(qū)，通過脫除木

28、質(zhì)素或/和半纖維素等導(dǎo)致 木質(zhì)纖維素結(jié)晶度相對增加。然而，Wang 等21利用 XRD 對離子液 AmimCl圖 5 常壓甘油和汽爆自催化預(yù)處理前后麥草纖維的紅外光譜分析17A原麥草纖維；B汽爆麥草纖維；C常壓甘油自催化預(yù)處理麥草纖維·888·化工進(jìn)展2014 年第 33 卷從松木溶解提取纖維素進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn)，處理前松木纖維素為天然的型（在 2 的 15°和 22°出各 有一個顯著峰），經(jīng)離子液溶解再生出的纖維素只 在 2 的 25°附近有個稍寬衍射峰，表明溶解再生 產(chǎn)品為纖維素型；而且發(fā)現(xiàn)該離子液預(yù)處理破壞 了基質(zhì)中纖維素的分子間/內(nèi)氫鍵，使

29、纖維結(jié)晶度明 顯降低。Uju 等22最近用 XRD 詳細(xì)分析了兩種離子 液（BmpyCl/EmimOAc）預(yù)處理木質(zhì)纖維素 原料（甘蔗渣和桉樹）結(jié)晶度特征，發(fā)現(xiàn)以下幾點(diǎn)。預(yù)處理甘蔗渣和桉樹纖維素都具有高結(jié)晶度，屬 于纖維素型（天然纖維素），但桉樹纖維中含有 比甘蔗渣更多的晶體結(jié)構(gòu)。離子液EmimOAc 處理后 2 種基質(zhì)中代表纖維素結(jié)晶度的峰消失或減 弱，BmpyCl處理后除結(jié)晶纖維素原峰消失或減 弱外，在 12°出現(xiàn)一個纖維素型特征的弱峰，這 些衍射方式表明經(jīng)過 2 種離子液預(yù)處理后基質(zhì)纖維 素轉(zhuǎn)化為無定形和纖維素型，其中BmpyCl處 理后基質(zhì)纖維素主要以纖維素型狀態(tài)存在。進(jìn) 一

30、步計(jì)算結(jié)晶度指數(shù)顯示，EmimOAc預(yù)處理使 桉樹纖維素結(jié)晶度指數(shù)從 45%減少至 21%，使甘蔗 渣從 42%降至 30%，BmpyCl預(yù)處理使基質(zhì)纖維 素結(jié)晶度指數(shù)減少不明顯，分別使桉樹和甘蔗渣纖 維素結(jié)晶度指數(shù)降低至 39%和 37%，可能是由于該 預(yù)處理方法主要使晶體纖維素從型轉(zhuǎn)化為型， 而不是無定形狀態(tài)。即使BmpyCl預(yù)處理基質(zhì) 具有高的纖維素結(jié)晶度指數(shù)，后續(xù)酶解發(fā)現(xiàn)這些基 質(zhì)比EmimOAc預(yù)處理基質(zhì)更衣水解產(chǎn)糖，初步 分析可能是該預(yù)處理降低了纖維素聚合度，而纖維 素分子短鏈在纖維素再生過程中轉(zhuǎn)化為符合熱動力 學(xué)的纖維素型。結(jié)合酶解糖化，BmpyCl預(yù) 處理更適合用于提高木質(zhì)纖維

31、素可酶解性。盡管純纖維素結(jié)晶度和可消化性密切相關(guān)，但 對于木質(zhì)纖維素卻很難測其真實(shí)的纖維素結(jié)晶度， 所以常用 XRD 測定包括無定形纖維素、半纖維素 和木質(zhì)素等非結(jié)晶物質(zhì)在內(nèi)整個基質(zhì)的結(jié)晶度。因 此，木質(zhì)纖維素預(yù)處理后結(jié)晶度大小和可消化性并 沒有直接對應(yīng)關(guān)系，利用 XRD 分析木質(zhì)纖維素基 質(zhì)結(jié)晶度（結(jié)晶度指數(shù)）變化不能反映基質(zhì)的可酶 解性，對后續(xù)酶水解無明顯指導(dǎo)意義，但它測得纖 維素型的晶體尺寸指標(biāo)可能對評估木質(zhì)纖維素可 酶解性具有參考價值12，16。4 木質(zhì)纖維素的 13C NMR 結(jié)構(gòu)解析除 XRD 外，NMR 是研究木質(zhì)纖維素基質(zhì)里纖維素晶體結(jié)構(gòu)特征最合適的分析手段之一。由于13C N

32、MR 對于纖維素分子內(nèi)部排列更靈敏，所以它 測出的結(jié)晶度指數(shù)與 XRD 會有所不同，它測得的 結(jié)晶度指數(shù)能更準(zhǔn)確地反映纖維素晶體實(shí)際排 列23。纖維素 NMR 光譜中最有意義區(qū)域是一個分 布于 8092 的 C4 信號簇，其中有序 8692 區(qū)域?qū)?于晶體型（，）纖維素和次晶纖維素；無序 80 86 區(qū)域較寬，屬于無定形纖維素、纖維束表面的結(jié) 晶纖維素和/或半纖維素。Wang 等21利用 13C NMR 分析研究了離子液體處理前后松樹纖維質(zhì)結(jié)構(gòu)變 化，發(fā)現(xiàn)原松樹包括所有纖維素和木質(zhì)素的特征吸 收峰，但離子液體預(yù)處理后結(jié)晶纖維素在 C4（89） 和 C6（62）的特征吸收峰消失，僅剩下無定形纖維

33、 素在 C4（84）和 C6（62）的特征吸收峰，證明原松 樹復(fù)雜致密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形結(jié)構(gòu)；再 生纖維素光譜僅剩下纖維素和半纖維素吸收峰，沒 有木質(zhì)素吸收峰；松樹殘?jiān)墓庾V具有更高分辨率 和木質(zhì)素特征吸收峰（133、125 和 113），3 個木 質(zhì)素吸收峰重疊在一起并且形成了更廣闊的吸收 峰。該分析證明了離子液體預(yù)處理不僅能破壞木質(zhì) 纖維素中結(jié)晶纖維素的結(jié)合氫鍵，并且還作用于木 質(zhì)素芳香環(huán)并使其溶解。Zhang 等23利用 13C NMR 研究了不同預(yù)處理前后甜高粱晶體結(jié)構(gòu)變化，結(jié)合 水解結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)離子液和石灰水處理使基質(zhì)纖 維素結(jié)晶度減小，而稀酸和汽爆處理會使結(jié)晶度增 加；離

34、子液預(yù)處理會導(dǎo)致纖維素發(fā)生轉(zhuǎn)型，基質(zhì)纖 維素結(jié)晶度從天然型（，）轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌愋涂?能是導(dǎo)致水解增加的重要因素；盡管結(jié)晶度指數(shù)降 低和水解率提高有些關(guān)系，但結(jié)晶度指數(shù)的下降程 度和纖維素水解產(chǎn)糖增加沒有必然聯(lián)系，結(jié)晶度指 數(shù)并不是影響酶水解的主要因素；汽爆預(yù)處理由于 使基質(zhì)中無定形纖維素和易水解的細(xì)微表面纖維素 增加，使酶解同時發(fā)生在纖維素結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)， 從而增加了基質(zhì)的可消化性。即使對純纖維素來說， 僅僅結(jié)晶度指標(biāo)也不能用來評估其可水解性。此外， 與原纖維素相比，再生纖維素光譜沒有出現(xiàn)新信號， 顯示離子液處理過程中沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，這和 FT-IR 分析結(jié)果也是一致的。最近 Husson

35、等24在研 究中發(fā)現(xiàn)，離子液體處理 纖維素后使纖維素結(jié)晶 度指數(shù)從 25%下降到不到 5%，但預(yù)處理前后水解 葡萄糖產(chǎn)量并沒有明顯變化；離子液 Emim+ CH3COO 預(yù)處理使較長纖維素結(jié)晶度指數(shù)無明顯 變化，Emim+MeO(H)PO2預(yù)處理使結(jié)晶度指數(shù) 稍有下降（73%58%），但后者卻使纖維素水解第 4 期孫付保等：木質(zhì)纖維素糖平臺基質(zhì)組成結(jié)構(gòu)的分析表征技術(shù)研究進(jìn)展·889·產(chǎn)糖量提高近 3 倍。該結(jié)果再次證明，酶水解效率和結(jié)晶度指數(shù)沒有必然的相關(guān)性，其他因素如纖維 素晶型、結(jié)晶度和表面結(jié)構(gòu)（比表面積和粗糙度等） 應(yīng)該對酶解也有較大影響。比較 XRD 和 NMR 對

36、木質(zhì)纖維素基質(zhì)組成結(jié)構(gòu) 分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這兩種方法都是基于整個基質(zhì)進(jìn)行 的纖維素結(jié)晶度、結(jié)構(gòu)和晶體尺寸分析，因而在 C4 區(qū)域會發(fā)生半纖維素和纖維素吸收峰相重疊從而影 響結(jié)晶結(jié)構(gòu)測定的現(xiàn)象。因此，若基質(zhì)中半纖維素 含量較高，就會使 NMR 分析的結(jié)晶度指數(shù)偏高而 與實(shí)際不符，這就需要其他分析方法作為補(bǔ)充。5纖維基質(zhì)分析表征的新型技術(shù)除上文所述常見的 SEM 表面觀察、FT-IR 化學(xué) 結(jié)構(gòu)分析、XRD 晶體結(jié)構(gòu)分析和化學(xué)結(jié)構(gòu) 13C-NMR 解析外，新近也出現(xiàn)一些新型分析表征方法，如高 速原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）、 原位原子顯微鏡（ in-situ

37、AFM ）、 多尺度顯譜 （ multi-scale visualization ）和實(shí)時相關(guān) 成像 （correlative imagining in real time）技術(shù)等。 Igarashi 等25利用高速 AFM 實(shí)時觀察單個纖維素酶組分（CBH，CBH ）降解結(jié)晶纖維素的 過程。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以下幾點(diǎn)。CBH （TrCel7A） 分子在結(jié)晶纖維素表面單向滑行，在某一時刻會類 似于交通堵塞一樣集體停下來，停留片刻后又繼續(xù) 前進(jìn)，至于什么原因?qū)е滤麄儠袛嗤Ｏ聛恚醪?推斷可能是由于結(jié)晶纖維素表面的粗糙不光滑導(dǎo)致 纖維素酶蛋白分子交通阻塞。采用超臨界氨法處 理結(jié)晶纖維素，發(fā)現(xiàn)結(jié)晶纖維素由晶

38、型 轉(zhuǎn)變成 I，該處理能明顯增加結(jié)晶纖維素表面的可用滑道 數(shù)以及滑動纖維素酶數(shù)目，這是因?yàn)榻Y(jié)晶纖維素I 表面有更多纖維素酶蛋白分子相作用的結(jié)合位點(diǎn)。CBH （TrCel6A）單獨(dú)提前處理或與 CBH （TrCel7A）同時水解結(jié)晶纖維素I 都會導(dǎo)致纖維 素表面滑動酶分子數(shù)的顯著增加。因此，通過理化 預(yù)處理或其他酶協(xié)同作用改進(jìn)結(jié)晶纖維素表面結(jié)構(gòu) 狀態(tài)，如修平表面、脫除障礙物、增加滑道數(shù)和進(jìn) 出口數(shù)等，將有助于改進(jìn)酶蛋白分子的滑動狀態(tài)， 避免阻塞中斷，最終實(shí)現(xiàn)基質(zhì)高效降解?？梢姡?的預(yù)處理技術(shù)應(yīng)該將會增加結(jié)晶纖維素表面的纖維 素酶分子結(jié)合位點(diǎn)，增加纖維素酶分子可用滑道數(shù)， 最終有助于晶體纖維素高

39、效水解。Ganner 等26利用 in-situ AFM 生動呈現(xiàn)了纖維 素酶內(nèi)切 -葡聚糖苷酶（EG）和外切 -葡聚糖苷酶（CBH 和）單獨(dú)/協(xié)同水解纖維素基質(zhì)的結(jié)構(gòu)動態(tài)變化過程。通過觀察發(fā)現(xiàn)，纖維素由無定形區(qū) 和結(jié)晶區(qū)組成，其中結(jié)晶區(qū)還可分為細(xì)小的納米結(jié) 晶纖維（寬度15 nm，長度 100300 nm）和大的 微晶（10010 m），納米結(jié)晶纖維因末端纖維素 酶結(jié)合位點(diǎn)相對容易暴露出來而更容易水解，甚至 比無定形區(qū)域降解還快；纖維素內(nèi)/外切酶在協(xié)同水 解時分工非常明確，EG 和 CBH 通過脫除基質(zhì)中 無序的無定形區(qū)域，從而使鑲嵌于纖維素中有序的 納米晶體纖維暴露出來，然后這些納米纖維被

40、 CBH 有效降解而形成為新的無定形區(qū)域；分析認(rèn)為纖 維素酶協(xié)同作用是基質(zhì)形態(tài)依賴型的，該協(xié)同作用 是由分別降解無定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)的酶之間相協(xié)作來 實(shí)現(xiàn)的，晶體尺寸和形狀是決定晶體纖維素可水解 性和水解效率的重要因素。Chundawat 等27利用多尺度顯譜（multi-scale visualization），包括激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal fluorescence microscopy，LSCM）、 拉曼光譜、AFM、SEM、TEM、NMR 和化學(xué)分析 電子光 譜學(xué) （ electron spectroscopy for chemical analy

41、sis，ESCA）等，通過成像表征氨爆預(yù)處理（AFEX）前后玉米秸細(xì)胞壁細(xì)微的形態(tài)和理化性 質(zhì)變化，以期闡明該預(yù)處理方法在不從基質(zhì)上脫除 木質(zhì)素和半纖維素情況下促進(jìn)基質(zhì)水解的機(jī)制。研 究發(fā)現(xiàn)：AFEX 首先從細(xì)胞壁部分溶解提取一部分 分解產(chǎn)物（如氨基化合物、阿拉伯糖基寡木聚糖和 木質(zhì)基酚類化合物），但隨著氨氣蒸發(fā)遺失，這些 物質(zhì)又重新沉淀在外部細(xì)胞壁表面，導(dǎo)致細(xì)胞壁內(nèi) 部形成了像隧道一樣的納米多孔網(wǎng)絡(luò)；這些納米多 孔的形狀、尺寸（101000 nm）和空間分布決定 于內(nèi)在的細(xì)胞壁部位和外在的預(yù)處理?xiàng)l件，氨爆玉 米秸單位體積上孔徑表面積范圍在 0.005 0.05 nm2/nm3；氨爆預(yù)處理主要

42、是通過斷裂木質(zhì)素-碳水 化合物酯鍵、部分溶解和移位細(xì)胞壁提取物到細(xì)胞 壁表面，而作用于細(xì)胞壁胞間層和外部次級細(xì)胞壁 部位，使細(xì)胞壁形成相互貫通如隧道狀的多孔網(wǎng)絡(luò) 結(jié)構(gòu)，這大大增加了基質(zhì)的纖維素酶可及性。該研 究顯示，為了促進(jìn)木質(zhì)纖維素基質(zhì)高效水解產(chǎn)糖， 細(xì)胞壁充分分解并不是評價和選擇預(yù)處理必須的 標(biāo)準(zhǔn)。Ding 等28利用新型的實(shí)時相關(guān)成像技術(shù)，包 括：亮視野光學(xué)顯微鏡、共焦激光掃描顯微鏡、雙 色受激拉曼散射顯微鏡和原子力顯微鏡，察看了從 毫米到納米級玉米秸稈細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)及其被纖維素酶·890·化工進(jìn)展2014 年第 33 卷水解的變化過程，評估了化學(xué)預(yù)處理后細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)在納米

43、水平的變化及其對后續(xù)微生物酶降解的影 響，得到以下結(jié)論。真菌纖維素酶（cellulose） 是相對較小的多酶混合物（mixture），細(xì)菌纖維素 酶（ cellulosome ）是個體較大的多酶復(fù)合 體（multi-enzyme complex）。兩種纖維素酶消化植 物細(xì)胞壁機(jī)制明顯不同，細(xì)菌纖維素酶主要作用于 細(xì)胞壁表面，從細(xì)胞壁表面逐步剝離下單個微纖維 束，而真菌纖維素酶除作用于表面外，還能穿過細(xì) 胞壁表面孔洞或裂縫進(jìn)入細(xì)胞壁內(nèi)部的微纖維束網(wǎng) 絡(luò)，水解周邊成空洞或凹陷深坑，所以真菌纖維素 酶水解效率比細(xì)菌纖維素酶要高（約 5 倍）。纖 維素分子疏水面是微生物酶易于結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域， 在初級細(xì)

44、胞壁中疏水面是外露的，但在次級細(xì)胞壁 中是被木質(zhì)素屏蔽的（薄壁細(xì)胞中部分屏蔽，厚壁 纖維細(xì)胞中全部屏蔽），所以強(qiáng)化纖維素酶與纖維 素疏水表面區(qū)域的接觸將是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素高效降 解的有效方式。通過溫和預(yù)處理脫除木質(zhì)素發(fā)現(xiàn)， 實(shí)驗(yàn)中幾乎不存在木質(zhì)素的無效吸附現(xiàn)象，木質(zhì)素 含量與細(xì)胞壁的纖維素酶接觸結(jié)合具有很好的負(fù)相 關(guān)性，這說明木質(zhì)素的物理障礙是阻礙木質(zhì)纖維素 水解的關(guān)鍵。理想的預(yù)處理方法應(yīng)該是溫和的， 只是從細(xì)胞壁中脫除木質(zhì)素；在盡量脫除木質(zhì)素同 時，不使纖維素和半纖維素?fù)p失，也不使它們的天 然質(zhì)地構(gòu)造發(fā)生變化，盡可能保持天然纖維相對松 散、多孔原生狀的質(zhì)地結(jié)構(gòu)?？梢?，深入理解植物 細(xì)胞壁化學(xué)或

45、酶溶解機(jī)制，對于纖維素類生物質(zhì)高 效轉(zhuǎn)化為生物燃料是非常關(guān)鍵的。6問題與展望針對當(dāng)前儀器設(shè)備應(yīng)用于木質(zhì)纖維素基質(zhì)組成 結(jié)構(gòu)分析表征領(lǐng)域的研究進(jìn)展以及存在的問題，對 新型分析表征技術(shù)在木質(zhì)纖維素預(yù)處理和酶水解階 段的運(yùn)用提出了如下展望。由于適合生物煉制的原料的多樣性以及目前預(yù) 處理方法的多樣性，導(dǎo)致了分析檢測問題的復(fù)雜性。 單一的分析表征技術(shù)不能滿足檢測的需求。同種生 物質(zhì)原料經(jīng)過不同的預(yù)處理方法處理后，當(dāng)前的分 析技術(shù)可能檢測出不同甚至相反的結(jié)果；同樣，針 對不同的生物質(zhì)原料，單一的分析檢測技術(shù)可以得 出不同的檢測結(jié)果?；诖耍槍Ξ?dāng)前分析表征技 術(shù)存在的問題，作者認(rèn)為研究者應(yīng)結(jié)合多種分析表

46、征技術(shù)判定預(yù)處理以及酶解效果。此外，可以采用 新型分析表征技術(shù)動態(tài)觀察預(yù)處理以及酶解階段基質(zhì)的動態(tài)變化情況，更容易理解預(yù)處理及酶解機(jī)制。參考文獻(xiàn)余強(qiáng)，莊新姝，袁振宏，等. 木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)制取燃料及化學(xué)品的研究進(jìn)展J. 化工進(jìn)展，2012，31（4）：784-791. 許慶利，藍(lán)平，隋淼，等. 木質(zhì)纖維素水解制取燃料乙醇研究進(jìn) 展J. 化工進(jìn)展，2009，28（11）：1906-1912. 李江，謝天文，劉曉風(fēng). 木質(zhì)纖維素生產(chǎn)燃料乙醇的糖化發(fā)酵工 藝研究進(jìn)展J. 化工進(jìn)展，2011，30（2）：284-291.Himmel M E ， Ding S-Y ， Johnson D K ， et

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