bmp2在組織中的表達生物科學(xué)畢業(yè)設(shè)計論文

1、畢業(yè)論文（設(shè)計）內(nèi)容介紹論文（設(shè)計）題 目 BMP2 在組織中的表達 選題時間完成時間論文（設(shè)計）字數(shù)7850關(guān) 鍵 詞先兆子癇；蛻膜化；BMP2論文（設(shè)計）題目的來源、理論和實踐意義：題目來源：張叢教授選題理論和實踐意義： 先兆子癇屬于妊高癥的一種，它是指孕婦在妊娠 24 周左右，在高血壓和蛋白尿的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)的頭痛、眼花、惡心、嘔吐、上腹不適等癥狀，患有先兆子癇的孕婦如果得不到及時治療，往往會出現(xiàn)一些并發(fā)癥，對母親而言會造成子癇發(fā)作，對胎兒而言更為嚴重，會引起胎盤早剝、發(fā)育遲緩、宮內(nèi)死胎等。 先兆子癇發(fā)病率不低，也引起了人們對它的重視， ，盡管已經(jīng)研究多年，但這種妊娠特有疾病的病因和發(fā)病機

2、制至今尚未完全闡明，目前認為先兆子癇是由于胎盤發(fā)育異常引起，而胎盤的發(fā)育與子宮內(nèi)膜蛻膜化有密切的關(guān)系，在子宮內(nèi)膜的正常蛻膜化過程中 BMP2 發(fā)揮重要的作用。因此猜想，先兆子癇可能與 BMP2 的異常表達直接相關(guān)。論文（設(shè)計）的主要內(nèi)容及創(chuàng)新點：論文的主要內(nèi)容：通過實驗探究先兆子癇病人子宮內(nèi)膜蛻膜中 BMP2 表達量與正常人的是否有明顯差異，從而證明先兆子癇與 BMP2 的異常表達是否直接相關(guān)。創(chuàng)新點：，盡管已經(jīng)研究多年，但這種妊娠特有疾病的病因和發(fā)病機制至今尚未完全闡明，目前認為先兆子癇是由于胎盤發(fā)育異常引起，而胎盤的發(fā)育與子宮內(nèi)膜蛻膜化有密切的關(guān)系，在子宮內(nèi)膜的正常蛻膜化過程中 BMP2

3、發(fā)揮重要的作用。首次將先兆子癇與蛻膜化有關(guān)基因 BMP2 直接聯(lián)系在一起。I附：論文（設(shè)計）本人簽名： 2014 年 5 月 20 日目錄 中文摘要 .1英文摘要 .11 引言 .3 1.1 研究背景目的及意義 .31.2 先兆子癇的概念 .3 1.3 先兆子癇病因的研究進展 .3 1.4 子宮內(nèi)膜蛻膜化的概念 .4 1.5 BMP2 的概述.52 實驗材料和方法 .6 2.1 實驗材料 .6 2.2 試劑及儀器 .6 2.3 實驗方法 .62.4 實驗過程 .63 實驗結(jié)果 .164 討論 .18參考文獻 .19致謝 .200BMP2在組織中的表達 摘要摘要：先兆子癇屬于妊高癥的一種，它是指

4、孕婦在妊娠 24 周左右，在高血壓和蛋白尿的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)的頭痛、眼花、惡心、嘔吐、上腹不適等癥狀，患有先兆子癇的孕婦如果得不到及時治療，往往會出現(xiàn)一些并發(fā)癥，對母親而言會造成子癇發(fā)作，對胎兒而言更為嚴重，會引起胎盤早剝、發(fā)育遲緩、宮內(nèi)死胎等。 先兆子癇發(fā)病率不低，也引起了人們對它的重視，盡管已經(jīng)研究多年，但這種妊娠特有疾病的病因和發(fā)病機制至今尚未完全闡明，目前認為先兆子癇是由于胎盤發(fā)育異常引起，而胎盤的發(fā)育與子宮內(nèi)膜蛻膜化有密切的關(guān)系，在子宮內(nèi)膜的正常蛻膜化過程中 BMP2 發(fā)揮重要的作用。因此猜想，先兆子癇可能與BMP2 的異常表達直接相關(guān)。關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞：先兆子癇；蛻膜化；BMP2The E

5、xpression of BMP2 in Endometrium DecidualAbstract: Preeclampsia (PE) is one of pregnancy hypertension. It refers to the pregnant women who appear have a headache, giddy, disgusting, vomiting, epigatic discomfort and other symptoms on the basis of high blood pressure and proteinuria 24 week after pre

6、gnancy. If the woman who has Preeclmapsis left untreated will get some complications, for the mother, it can cause eclampsia attack, more serious for fetus, it can cause placental abruption, retardation, intrauterine demise and so on.1 The incidence of PE is not low, so it has aroused peoples attent

7、ion. Although people has studied it for years, the endemic disease etiology and pathogenesis has not been fully clarify. Now most people think preeclampsia is caused by abnormal placenta, and the development of placenta has a close relationship with endometrial decidualization, in the normal process

8、 of endometrial decidualization BMP 2 play an important role. So I guess the preeclampsia has a directly related with the abnormally expression of BMP2.Key words: preeclmapsis；decidualization；BMP2 21 1 引言引言1.11.1 研究背景、目的及意義研究背景、目的及意義先兆子癇(PE )是母嬰死亡的主要妊娠并發(fā)癥之一, 臨床發(fā)病率約5 %, 表現(xiàn)為高血壓蛋白尿, 并伴有頭痛、眼花、惡心、胃區(qū)疼痛及嘔吐

9、等癥狀, 可損壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)?；加邢日鬃影B的孕婦如果得不到及時治療，往往會出現(xiàn)一些并發(fā)癥，對母親而言會造成子癇發(fā)作，對胎兒而言更為嚴重，會引起胎盤早剝、發(fā)育遲緩、宮內(nèi)死胎等。1, 2, 3先兆子癇發(fā)病率不低，也引起了人們對它的重視， ，盡管已經(jīng)研究多年，但這種妊娠特有疾病的病因和發(fā)病機制至今尚未完全闡明，目前認為先兆子癇是由于胎盤發(fā)育異常引起，而胎盤的發(fā)育與子宮內(nèi)膜蛻膜化有密切的關(guān)系，在子宮內(nèi)膜的正常蛻膜化過程中 BMP2發(fā)揮重要的作用。因此猜想，先兆子癇可能與 BMP2的異常表達直接相關(guān)。 通過實驗探究先兆子癇病人子宮內(nèi)膜蛻膜中 BMP2表達量與正常人的是否有明顯差異，從而證明先兆

10、子癇與 BMP2的異常表達是否直接相關(guān)。1.21.2先兆子癇的概念及并發(fā)癥先兆子癇的概念及并發(fā)癥先兆子癇屬于妊高癥的一種，它是指孕婦在妊娠24周左右，在高血壓和蛋白尿的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)的頭痛、眼花、惡心、嘔吐、上腹不適等癥狀?；加邢日鬃影B的孕婦如果得不到及時治療，往往會出現(xiàn)一些并發(fā)癥，對母親而言會造成子癇發(fā)作，對胎兒而言更為嚴重，會引起胎盤早剝、發(fā)育遲緩、宮內(nèi)死胎等4。1.31.3先兆子癇病因的研究進展先兆子癇病因的研究進展先兆子癇發(fā)病率不低，也引起了人們對它的重視， ，雖然已經(jīng)研究多年，但其病因和發(fā)病機制至今尚未完全闡明，關(guān)于PE 的發(fā)病機制,認為它是多因素引3起的綜合征, 目前提出先兆子癇是由

11、于胎盤發(fā)育異常引起。妊娠過程中子宮在血壓調(diào)節(jié)中起重要作用。母體血容量可增加50%，為適應(yīng)這一過程，子宮螺旋動脈發(fā)生重構(gòu)，從卷曲狹窄變寬變薄，從而減少壓力，增加胎兒的血供。先兆子癇患者發(fā)生子宮螺旋動脈重構(gòu)障礙，而造成高血壓的一系列癥狀。51 1. .4 4 子宮內(nèi)膜蛻膜化的概念及作用子宮內(nèi)膜蛻膜化的概念及作用圖一 子宮結(jié)構(gòu)圖 (引自中醫(yī)世家 組織學(xué)與胚胎學(xué) )子宮內(nèi)膜蛻膜化是指子宮內(nèi)膜的基質(zhì)細胞在受到蛻膜化誘導(dǎo)因子的刺激下，增生、分化形成的一種特殊的組織，它對于妊娠的建立及維持具有至關(guān)重要的作用。月經(jīng)周期的分泌晚期，基質(zhì)細胞開始增生分化成前蛻膜細胞及蛻膜組織。若受精卵著床于子宮內(nèi)膜，前蛻膜細胞在

12、孕激素的影響下，繼續(xù)發(fā)育、增大，即可成為蛻膜細胞及妊娠蛻膜6，7。蛻膜的特定功能也不是不清楚。一個可能就是蛻膜能控制滋養(yǎng)層侵入到母體動脈中的程度。如果這個侵入過程能正確發(fā)生,母體就不會因為胚胎侵入的太深而招致?lián)p害, 胎兒也會獲得充分的營養(yǎng)。但如果沒有蛻膜的存在, 滋養(yǎng)層就能直接侵入到子宮肌層中，侵入過程就不會被限制在肌層的內(nèi)側(cè), 可能會導(dǎo)致肌肉組織的破壞和子宮的破裂等。因此, 蛻膜最重要的作用很可能是作為一個屏障, 使的母體免受由于胎兒的過渡侵入帶來損害。 8, 941 1. .5 5 BMP2的的概概述述BMP即 骨形態(tài)發(fā)生蛋白 （bone morphogenetic protein）,最早

13、作為體內(nèi)能夠誘導(dǎo)骨與軟骨形成的因子被人認識，又被稱作 “成骨素” ，屬于轉(zhuǎn)化生長因子TGF-超家族。BMP家族成員除了有明顯的的成骨作用外，還參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，能抑制細胞的生長、增殖，促進細胞分化和凋亡10。BMP2作為BMP家族的一員，可與細胞膜表面的受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)的Smad信號通路，促進人子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞發(fā)生蛻膜化11。52 2 實驗材料和方法實驗材料和方法2.12.1 實驗材料實驗材料試驗材料：本實驗選取正常人和患有先兆子癇的病人的子宮內(nèi)膜蛻膜組織。材料來源：齊魯醫(yī)院，醫(yī)生分別在正常人和先兆子癇病人分娩后（或流產(chǎn)后）取其子宮內(nèi)膜蛻膜組織，液氮保存待用2.22.2 試劑及儀器試

14、劑及儀器試劑：1）液氮 2）裂解液 3）SDS 上樣緩沖液 4）電泳緩沖液 5）轉(zhuǎn)移緩沖液 6）封閉液 7）TBST 8）洗脫抗體緩沖液 9）顯影液 10）定影液 11）BMP2抗體儀器： 1）垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置 2）離心機 3）移液槍及配套槍頭 4）玻璃勻漿器 5）酶標(biāo)儀 6）超聲波破碎儀 7）冰箱 8）鑷子 9） PVDF膜 10）小塑料盆 11）冰袋 12）冰盒 13）刀片 14）鉛筆 15）marker筆 16）孵育袋 17）熱封口器15 ) 脫色搖床 16）培養(yǎng)皿 17）ECL顯影儀 18）電磁爐 2.32.3 實驗方法實驗方法 對所得蛋白樣品定量后，在等量的蛋白樣品中，采用 Wes

15、tern Blot 對正常人和患有先兆子癇病人來源的子宮內(nèi)膜蛻膜組織中 BMP2 表達量進行比較。實驗中用人體組織中的一中管家基因 -actin 作為內(nèi)參。2.42.4 實驗過程實驗過程一、溶液配制一、溶液配制（一）蛋白裂解、定量：（一）蛋白裂解、定量： 1 1、PBSPBS 緩沖液：緩沖液： 4保存。 NaCl 0.8015 g KCl 0.0202 g Na2HPO4 0.142 g KH2PO4 0.0239 g6 DDW 80 ml 0.1M HCl/ 0.5M NaOH 調(diào)節(jié) PH7.4 DDW 定容至 100 ml2 2、10m10m M M PMSFPMSF（10 xPMSF10

16、 xPMSF）(蛋白酶抑制劑)： -20保存。 PMSF(MW174.2) 0.0174 g 異丙醇 10 ml （二）制膠：（二）制膠： 1 1、30%30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺溶液： 4避光保存。 丙烯酰胺（Acr） 29.2 g（29.2%） 甲叉雙丙烯酰胺（Bic） 0.8 g（0.8%） DDW 定容至 100ml 37水浴溶解，0.45m 過濾器過濾。 2 2、10%10% SDSSDS 溶液：溶液： 室溫保存。 SDS 1.0 g DDW 定容至 10 ml 37水浴溶解。 3 3、10%10%過硫酸銨（過硫酸銨（APAP）：）： 最好現(xiàn)用現(xiàn)配 過硫酸銨（AP） 0.01 g

17、DDW 定容至 100 l 4 4、1.51.5 M M Tris-Tris- HClHCl (PH(PH 8.88.8）：）： 4保存。 Tris 18.171 g DDW 50 ml 濃 HCl 調(diào)節(jié) PH 8.8 DDW 定容至 100 ml 5 5、1.01.0 M M Tris-HClTris-HCl (PH(PH 6.86.8）： 4保存。 Tris 12.114 g DDW 50 ml 濃 HCl 調(diào)節(jié) PH 6.87 DDW 定容至 100 ml 6 6、TEMEDTEMED： 分裝 200 l 于 EP 管中，4遮光保存。 （三）電泳：（三）電泳： 1 1、電泳緩沖液：、電泳

18、緩沖液： （1 1）5x5x 電泳緩沖液（儲存液）：電泳緩沖液（儲存液）： 無需調(diào) PH，4保存 4 周左右。 Tris 7.6 g(125 mM) Gly（甘氨酸） 47 g(500 mM) SDS 2.5 g(0.5%) DDW 定容至 500ml （2 2）1x1x 電泳緩沖液（工作液）：電泳緩沖液（工作液）： 常溫保存 1 周左右，最多共使用 3次 5x 電泳緩沖液 200 ml DDW 定容至 1000 ml 2 2、1x1x 轉(zhuǎn)移緩沖液（工作液）：轉(zhuǎn)移緩沖液（工作液）： 常溫保存 1 周左右，最多共使用 3 次。 Tris 1.5 g Gly 7.2 g 甲醇 75 ml DDW

19、定容至 500 ml（四）顯色：（四）顯色： 1 1、50 x50 x TBSTBS（1 1 M M，PH7.5PH7.5）：）： （室溫保存） 10 x10 x TBSTBSTris（MW121.14） 121 g 24.2 g DDW 800 ml 160 ml 濃 HCl 調(diào)節(jié) PH7.5 PH7.5 DDW 定容至 1000 ml 1000 ml2 2、1x1x TBS-TTBS-T： （室溫保存）Tris 2.42 g NaCl 8 g Tween-20 1 ml8 濃 HCl 調(diào)節(jié) PH7.5 DDW 定容至 1000 ml3 3、5%5%脫脂奶粉：脫脂奶粉： （ 4保存，可于一周

20、內(nèi)使用） 1XTBST 緩沖液 95-100 ml 10 ml 5 ml 脫脂奶粉 5 g 0.5 g 0.25g 4 4、一抗：、一抗： 兔來源 BMP2 一抗 、-actin 一抗 5 5、二抗、二抗 羊抗兔二抗 二、蛋白樣品制備二、蛋白樣品制備1. 融解 RIPA 裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使 PMSF 的最終濃度為 1 mM。 （如：取約 40 mg 組織，加入 450 l 裂解液，加 50 l 10 x PMSF） 2. 取四只 EP 管，分別標(biāo)記為 N1，N2，PE1,PE2。分別把兩位正常人和兩位先兆子癇病人蛻膜組織剪切成細小的碎片，按照每 2

21、0 毫克組織加入 150-250微升裂解液的比例加入裂解液。 3. 用玻璃勻漿器勻漿(置于冰上)，使其充分裂解，分別放入對應(yīng)的 EP 管中。 4. 用超聲波破碎儀對所得的子宮內(nèi)膜蛻膜組織進一步破碎。 5. 充分裂解后，4 12000 rpm 離心 3-5 分鐘，取上清，即可進行后續(xù)的PAGE 、Western 和免疫沉淀等操作。 三、蛋白樣品濃度測定及上樣體積的確定三、蛋白樣品濃度測定及上樣體積的確定使用“BCA 蛋白濃度測定試劑盒”1.取 0.8 ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到一管蛋白標(biāo)準(zhǔn)(20 mg BSA)中，充分溶解后配制成 25 mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。9 2.取適量 25mg/ml

22、 蛋白標(biāo)準(zhǔn)，稀釋至終濃度為 0.5 mg/ml。例如取 20 l 25mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)，加入 980 l PBS 即可配制成 0.5 mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)。蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡便起見，也可以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋后的 0.5 mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)也可以-20長期保存。 3.根據(jù)樣品數(shù)量，按 50 體積 BCA 試劑 A 加 1 體積 BCA 試劑 B(50:1)配制適量 BCA 工作液，充分混勻。BCA 工作液室溫 24 小時內(nèi)穩(wěn)定。 4.將標(biāo)準(zhǔn)品按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 l 加到 96 孔板的

23、標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補足到 20 l。 5.加適當(dāng)體積樣品到 96 孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到 20 l 。 6.各孔加入 200 l BCA 工作液，37放置 20-30 分鐘。 7.測定 A562，540-595 nm 之間的波長也可接受。 表一標(biāo)號(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)BSA（l）01248121620PBS（l）2019181612840BCA（l）200200200200200200200200濃度（g/ml）02550100200300400500吸光值0000.0260.1290.1530.2420.327繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖二：圖二 蛋白濃度

24、標(biāo)準(zhǔn)曲線表二N1N2PE1PE2吸光度1.7562.2122,6311,6068.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算出樣品 N1、N2、PE1、PE2 的蛋白濃度。 10經(jīng)過測定可得蛋白樣品 N1、N2、PE1、PE2 的濃度分別為 2.619 g/l,3.289 g/l,3.906 g/l,2.398 g/l為使各蛋白樣品上樣量相等，算得上樣體積為表三-actin（蛋白總量 20 g）N1N2PE1PE2蛋白樣品的體積(l)9.226.085.128.34上樣緩沖液的體積(l)2.3051.521.282.085總體積(l)11.5257.606.4010.425表四BMP2(蛋白總量 40g)N1N2P

25、E1PE2蛋白樣品的體積(l)18,4412.1610.2416,68上樣緩沖液的體積(l)4,613.042,564.17總體積(l)23.0515.2012,8020.85四、四、SDS-PAGESDS-PAGE 制膠配方制膠配方 ( (一一) ) 10%10%分離膠分離膠DDW 2.0 ml 30%丙烯酰胺 1.65 ml 1.5MTris(PH6.8) 1.25 ml 10%SDS 50 l 10%AP 50 l TEMED 2 l 總量 5 ml11（二）（二）5%5%濃縮膠濃縮膠 DDW 1.05 ml 30%丙烯酰胺 250 l 1.0M Tris(PH6.8) 190 l 10

26、%SDS 15 l 10%AP 15 l （AP:0.01 g; DDW:100l） TEMED 1.5 l 總量 1.5 ml五、制膠、電泳五、制膠、電泳（一）分離膠：（一）分離膠：1.將制膠槽安裝好。 2.依照上面 PAGE 制膠配方按分離膠所需各試劑的濃度和體積，配制相應(yīng)體積的溶液，加入 TEMED 后，立即灌膠。（用 1 毫升的槍在膠板的一側(cè)緩慢灌入。）3.灌裝分離膠后，用 DDW 將凝膠板上部空隙灌滿。（用 200 l 的槍左右來回灌入，操作要輕柔緩慢。） 4.靜止 30 min。（二）濃縮膠：（二）濃縮膠：1.依照上面 PAGE 制膠配方配制所需體積的濃縮膠溶液。2.待分離膠充分聚

27、合后，將其上部的 DDW 倒掉，并用濾紙吸干水分。 3.向濃縮膠溶液中，加入 TENMED 后，立即灌膠，并迅速插好梳子。 4.靜止一小時以上。5.待膠全部凝好后，依次將制膠槽的左右固定把手松開，將制膠架卸下。（三）加樣：（三）加樣：1.電泳前，將預(yù)先定量、變性的所需蛋白樣品從冰箱取出，加入所需體積的上樣緩沖液，10,000 rpm 離心 5 min，沸水中煮 7 min（使蛋白完全變性）,10,000 rpm 離心，2 min 去氣泡。 2.拔梳子：拔梳子：輕柔.垂直地將梳子從凝膠板中拔出，并用 DDW 輕柔清洗加樣孔，12之后甩干水分。 3.沖洗加樣孔：沖洗加樣孔：將已經(jīng)拔出梳子的制膠架放

28、置于電泳槽內(nèi)，將兩塊凝膠板之間小腔充滿電泳緩沖液，并令其溢出部分緩沖液流入電泳槽中。4.加樣：加樣：將蛋白樣品 N1、N2、PE1、PE2 及蛋白 Marker 按順序依次放于試管架上，以此吸取 Marker、N1、N2、PE1、PE2（-actin） 及Marker、N1、N2、PE1、PE2（BMP2）所需樣品體積，緩慢并連續(xù)將蛋白樣品加入到加樣孔中。（四）電泳：恒壓（四）電泳：恒壓1.加完最后一個樣品后，快速將電泳槽蓋蓋上，打開電源，設(shè)定 80 V。（電泳開始前，檢查電源、電泳槽之間的正負極連接線是否正確） 2. 30 min 后，樣品開始進入分離膠，此時應(yīng)改變恒流為 120 V，并將電

29、泳槽放入盛有冷水的小盆中，整個電泳過程中，應(yīng)保持在 10左右。3根據(jù)需要停止電泳。一般情況下，在所需濃度的 SDS-PAGE 電泳時，以溴酚藍尚未跑出凝膠為準(zhǔn)。6 6、轉(zhuǎn)膜、染色：轉(zhuǎn)膜、染色：（一）準(zhǔn)備膜：（一）準(zhǔn)備膜： 1.剪膜：剪膜：根據(jù)樣品孔的多少和膠的高度裁剪適當(dāng)大小的 PVDF 膜。 2.膜活化：膜活化：將膜浸入盛有10 ml 甲醇的干凈玻璃培養(yǎng)皿中，輕輕涮一下（5 秒） 3.清洗：清洗：將膜在盛有 DDW 的干凈玻璃培養(yǎng)皿中清洗，約 2 min。 4.在這期間，準(zhǔn)備一專用小塑料盆，將約 400 ml 預(yù)冷轉(zhuǎn)移緩沖液倒入小盆中。 5.膜滲透：膜滲透：將清洗后的 PVDF 膜放入緩沖液

30、中，靜等 15 min 以上。 6.膠滲透：膠滲透：此時，電泳完畢，卸下電泳槽，用長解剖刀片從中間打開玻璃板，令凝膠位于其中一塊玻璃板上，根據(jù)需要大小切膠，將需要轉(zhuǎn)移部分放入上述盛有轉(zhuǎn)移緩沖液的小盆中，與 PVDF 膜一同靜置 15 min。 （二）膜轉(zhuǎn)移（二）膜轉(zhuǎn)移 恒流恒流 1.依次將（+極）海綿-濾紙-膜-膠-濾紙-海綿 （-極）在轉(zhuǎn)13移緩沖液中放置好后，各層之間不要有氣泡。用 2B 鉛筆在按照預(yù)染蛋白Marker 的位置，在膜上標(biāo)記好后。依次放好濾紙、海綿，并將轉(zhuǎn)移夾扣緊，放入轉(zhuǎn)移槽中，裝滿預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液（注意：緩沖液面要略高于轉(zhuǎn)移夾的高度） ； 2.確認好需要將蛋白向 PVDF

31、膜轉(zhuǎn)移的方向和電源正負極后，將電流設(shè)定在 120 mA 后，開始轉(zhuǎn)移。由于 BMP2 蛋白大小為 45 kDa,因此轉(zhuǎn)移時間定為 50 min。（三）免疫檢測：（三）免疫檢測：1.PVDFPVDF 膜封閉：膜封閉：5%脫脂奶粉封閉 1.5 h。2.一抗孵育：一抗孵育： (1)根據(jù)不同抗體所需濃度及反應(yīng)液成分，配制一抗，經(jīng)摸索本次試驗 BMP2一抗?jié)舛葹?1:2000（2 l 一抗，2.5 ml 2.5%脫脂奶粉） ，-actin 一抗?jié)舛葹?:5000（0.5 l 一抗，2.5 ml 2.5%脫脂奶粉） 。 (2)將一抗工作液加入到孵育袋中，再將封閉完的膜放入袋中，封口。4過夜。3.第二天早上

32、，將膜從 4冰箱拿出，平衡 0.5 h。 4.洗膜：洗膜：將膜移入盛有 15 ml 的 TBS-T 培養(yǎng)皿中，至于脫色搖床上，洗 4 次，每次 15 min。 （對于內(nèi)參 -actin,無需進行二抗處理，可繼續(xù)放置于 4，待測目的蛋白膜二抗反應(yīng)后，一同清洗） 。 5.二抗孵育：二抗孵育：在最后一次洗膜完畢前，準(zhǔn)備濃度為 1:5000（0.5 l 一抗，2.5 ml 2.5%脫脂奶粉） 。的二抗反應(yīng)液。洗膜完畢后，孵育 1 h。 6.洗膜：洗膜：反應(yīng)完畢后，將膜移入盛有 15 ml 的 TBS-T 培養(yǎng)皿中，輕搖清洗，洗 4次，每次 15 min。 7.ECLECL 反應(yīng)：反應(yīng)： (1)洗膜期間

33、，將試驗臺面擦拭干凈后，鋪上干凈的保鮮膜。 (2)最后一次洗膜完成前，準(zhǔn)備 ECL 反應(yīng)液。將 ECL 試劑瓶拿出 4，根據(jù)PDVF 膜的大小，分別抽取等量（200 至 500 l）的 A 液和 B 液，移入到 1.5 ml 離心管中，充分混勻。 （100 lECL 反應(yīng)液/cm2膜） (3)用專用的平頭鑷子，將清洗后的膜從 TBS-T 中拿出，用濾紙吸去膜上的水分，將轉(zhuǎn)有蛋白的膜面向上，放置到保鮮膜上。 (4)將混勻的 ECL 反應(yīng)液，快速滴在膜上，避光，室溫孵育 5 min。 (5)將反應(yīng)完畢的膜，用鑷子拿起，放到濾紙上，吸干水分。 (6)將有蛋白的膜面向下（排出氣泡） ，用保鮮膜將膜包裹

34、起來，然后，正面向上，迅速放入 X-光片壓片夾中，扣緊后，拿入暗室。 8.曝光及顯影：曝光及顯影： (1)在洗膜期間（顯影前 10 分鐘） ，應(yīng)將 X 光片以及顯影、停影以及定影液，在暗室中準(zhǔn)備好。 (2)在暗室中（開有紅燈） ，打開壓片夾。根據(jù)膜的大小，剪裁略大于膜的 X光片，剪切左上角后，整齊放在膜上，壓緊壓片夾，收起、包好 X 光膠片盒（此時要注意觀察 PVDF 膜上是否有熒光出現(xiàn)） (3)定時定時: :應(yīng)根據(jù) PVDF 膜上熒光的強度，設(shè)定曝光時間。 （如：-actin 曝光30 s）3 3實驗結(jié)果實驗結(jié)果 對兩個正常人和兩個先兆子癇病人子宮內(nèi)膜蛻膜組織進行蛋白定量后，通過Wester

35、n Blot 顯影得到其內(nèi)參 -actin 的表達情況，各樣本中 -actin 的表達量基本一致，因此本次試驗結(jié)果可用，如圖三所示。圖三 從左至右依次為 N1、N2、PE1、PE2 子宮內(nèi)膜蛻膜組織中 -actin 表達情況通過 Western Blot 顯影得到 BMP2的表達情況，,可看出 PE1病人蛻膜組織中BMP2的相對表達量最少;而正常人 N1與先兆子癇病人 PE2兩位蛻膜組織中 BMP2的表達量相近，而正常人 N2的蛻膜組織中 BMP2的表達含量最高。以上四組數(shù)據(jù)中，兩位正常人的 BMP2的蛋白表的量相差就非常大，兩位病人的 BMP2蛋白表達量也無法看出與正常人之間有明顯異常，此結(jié)

36、果與預(yù)期結(jié)果不符。如圖四、圖五所示。圖四 從左至右依次為 N1、N2、PE1、PE2 子宮內(nèi)膜蛻膜組織中 BMP2 表達情況圖五 從左至右依次為 N1、N2、PE1、PE2 子宮內(nèi)膜蛻膜組織中蛋白表達情況 4 4討論討論 進過分析，出現(xiàn)這種情況的原因可能有以下幾種情況：1. 正如我們所知道的，人體是一個高度協(xié)調(diào)、精細調(diào)控的一個整體，先兆子癇的發(fā)病可能不只是有一個關(guān)鍵基因的表達異常。2. 可能是由于每個個體中 BMP2基因表達的差異。3. 驗證基因的表達量的方法不能只在蛋白水平，還可應(yīng)該 mRNA 水平進行。4. 實驗數(shù)據(jù)樣本量較少。 一個疾病病因的診斷應(yīng)該經(jīng)過反復(fù)試驗驗證，但由于時間有限并且實

37、驗材料的來源為人體，材料得來實在不易，因此我只是進行了簡單操作，實驗數(shù)據(jù)樣本量較少。參考文獻參考文獻1張克榮, 邢福祺. 先兆子癇發(fā)病機制研究進展J. 國外醫(yī)學(xué): 婦產(chǎn)科學(xué)分冊, 2003,30(3): 142-144.2 Jose Antonio GE, Maria J, et al. HELLP syndrome. Med Clin (Barc), 2002, 118(5):197-199 3 Balderas-Pena L M, Canales-Muoz J L, Angulo-Vzquez J, et al. The HELPP syndrome-evidence of a possible sys