南美蝦蛋白酶解產(chǎn)物全身過敏反應(yīng)的消減效果的實(shí)驗(yàn)研究

1、. . . . 南美蝦蛋白酶解產(chǎn)物全身過敏反應(yīng)消減效果的實(shí)驗(yàn)研究容摘要：本實(shí)驗(yàn)以PBS平衡鹽溶液為陰性對(duì)照，以卵白蛋白為陽性對(duì)照，建立了南美蝦蛋白全身過敏試驗(yàn)的動(dòng)物模型。并以此為參照，比較了木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶酶解的蝦蛋白產(chǎn)物過敏原的消減效果。同時(shí)，初步分析了過敏反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制。結(jié)果顯示：0.1%卵白蛋白可使豚鼠100%出現(xiàn)過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性，0.1%蝦蛋白也使豚鼠100%出現(xiàn)過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性，表明全身過敏反應(yīng)模型制作成功。加熱處理的蝦蛋白過敏原基本不能消減。南美蝦蛋白的酶解產(chǎn)物使豚鼠全身過敏反應(yīng)明顯減輕，與同等量的蝦蛋白比較，差異顯著（P0.05）。比較三種酶的全身過敏反應(yīng)程度，認(rèn)

2、為胰蛋白酶的作用較其他兩種酶略佳。以上結(jié)果提示，南美蝦蛋白過敏原可以通過酶解方式消減，該工藝過敏原的消減效果較好，以胰蛋白酶的效果略佳。關(guān)鍵詞：卵白蛋白；南美蝦蛋白；蛋白酶；過敏試驗(yàn)；過敏原1 導(dǎo)言1.1 研究目的和意義過敏反應(yīng)屬于藥物不良反應(yīng)之一，是在全世界廣泛流行的一類常見變態(tài)反應(yīng)性疾病，由于其癥狀復(fù)雜，種類繁多，危害廣泛且難以根治，成為長期以來醫(yī)學(xué)界的一大難題。然而引起過敏反應(yīng)的主要渠道之一就是飲食，人們食用某些食品后出現(xiàn)皮膚瘙癢、胃腸功能紊亂等不良反應(yīng)，這些癥狀稱為食物過敏1。在過去，食物過敏問題一直沒有受到足夠的重視。自二十世紀(jì)八十年代以來，人們逐漸認(rèn)識(shí)到食物過敏的危害性。許多常見的

3、癥狀包括疲勞、頭痛、焦慮、鼻子癢、流鼻水和眼皮腫脹，甚至多年的關(guān)節(jié)炎、腸胃道疾病、自身免疫疾病、濕疹和偏頭痛等，都和食物過敏有關(guān)2。嚴(yán)重的食物過敏還可導(dǎo)致過敏性休克，直至威脅到人們的生命，美國每年有100至125例因食物過敏而致死的病例3。由于環(huán)境污染加劇，工業(yè)發(fā)展加速，過敏疾病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，超過25%的人受到過敏疾病的困擾，食物過敏正逐漸成為食品工業(yè)和臨床變態(tài)學(xué)的一個(gè)重要瓶頸4。1999年，國際食品法典委員會(huì)第23次會(huì)議公布了常見致敏食品的清單，包括蛋類與其制品、魚與其制品、甲殼類與其制品、奶與奶制品、花生、大豆、堅(jiān)果和谷物與其制品等，90%以上的過敏反應(yīng)是由這8種常見致敏食品而引起

4、的5。在一項(xiàng)對(duì)嬰兒牛奶過敏的前瞻性研究表明，56%的患兒在1歲、70%的患兒在2歲、87%的患兒在3歲時(shí)對(duì)牛奶不再過敏。但對(duì)魚蝦等海產(chǎn)品、花生和堅(jiān)果，則多數(shù)為終生過敏6。此外，國際貿(mào)易技術(shù)壁壘已開始關(guān)注過敏原。1999年AFO/WHO食品法典委員會(huì)(CAC)通過了已知引起過敏反應(yīng)和應(yīng)在標(biāo)簽上聲明的食物和成分的清單。2005年歐盟食品監(jiān)督委員和美國食品藥品管理局(FDA)要求所有的食品標(biāo)簽上必須標(biāo)明過敏原的種類和數(shù)量，以方便過敏人群在購買產(chǎn)品時(shí)進(jìn)行選擇。在上述八大食物過敏原中，蝦類與其制品是一種深受人們喜歡的食品，也是我國重要的出口產(chǎn)品，這是由其特性決定的。我國是水產(chǎn)品大國，2004年，我國水產(chǎn)

5、品人均占有量達(dá)到38.69公斤，進(jìn)出口總額首次突破100億美元，其中出口69.7億美元，進(jìn)口32.3億美元。除去來料加工的魚片(13.0億美元)等產(chǎn)品，蝦等甲殼類產(chǎn)品的出口額為8.6億美元，是我國大宗的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品7。特別是近年來，一些深加工產(chǎn)品(面包蝦、調(diào)味蝦等)的比重逐漸上升，以蝦為原料的食品日益增多，蝦過敏原的問題很有可能成為下一個(gè)貿(mào)易技術(shù)壁壘，這使得蝦過敏原的研究日益受到關(guān)注。因此，要想保證食品的安全性并對(duì)食物致敏原標(biāo)簽進(jìn)行監(jiān)管，這就要求食品科學(xué)工作者與醫(yī)學(xué)工作者聯(lián)合起來，對(duì)蝦與其制品中過敏原的情況進(jìn)行研究，并探索診斷和檢測蝦過敏原的方法，研究降低蝦過敏原免疫活性的可能性。為保護(hù)消費(fèi)者

6、的食用安全，打破進(jìn)口國的貿(mào)易技術(shù)壁壘，同時(shí)保護(hù)我國的消費(fèi)市場。在前期工作的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)已經(jīng)分離得到的蝦蛋白過敏原的致敏性進(jìn)行在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以檢測蛋白過敏原的制備效果，建立蝦蛋白過敏實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型；并進(jìn)一步對(duì)蝦蛋白酶解產(chǎn)物過敏原消減的效果進(jìn)行在體評(píng)價(jià)。1.2 相關(guān)研究現(xiàn)狀1.2.1 食物過敏簡介食物過敏是一種對(duì)食物中抗原分子產(chǎn)生的不良免疫介導(dǎo)反應(yīng)，其中90%以上的食物過敏是由免疫球蛋白 E(IgE)介導(dǎo)的。1963 年， Coombs 和 Gell 根據(jù)反應(yīng)發(fā)生的速度、發(fā)病機(jī)制和臨床特征，將過敏反應(yīng)可分為、和型。型是IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)；型即細(xì)胞毒性超敏反應(yīng)；型即免疫復(fù)合物型超敏反應(yīng)；型即

7、 T 細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)。-型由抗體介導(dǎo)，可經(jīng)血清被動(dòng)轉(zhuǎn)移。而型由 T 細(xì)胞介導(dǎo)，可經(jīng)細(xì)胞被動(dòng)轉(zhuǎn)移，反應(yīng)發(fā)生較慢，故稱遲發(fā)型過敏反應(yīng)。四種類型的過敏反應(yīng)如表1所示8：由表1可以看出，食物過敏是一個(gè)非常復(fù)雜的反應(yīng)過程。典型的食物過敏主要涉與I型過敏反應(yīng)，而且臨床數(shù)據(jù)表明，90%以上的食物過敏屬于I型過敏反應(yīng)9。食物過敏引起的型變態(tài)反應(yīng)包括三個(gè)階段，即食物過敏原的致敏階段、激發(fā)階段和效應(yīng)階段。表1 過敏反應(yīng)的分類類型介導(dǎo)物質(zhì)癥狀I(lǐng)型IgE肥大細(xì)胞和嗜性中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的血管和平滑肌反應(yīng)皮膚過敏反應(yīng)、消化道過敏反應(yīng)、呼吸道過敏反應(yīng)、過敏性休克等型 補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用新生兒溶血癥、自身免疫性溶血

8、性貧血、特發(fā)性血小板減少性紫癜等IgG或IgM抗體介導(dǎo)的細(xì)胞功能損傷型免疫復(fù)合物/補(bǔ)體介導(dǎo)的組織炎癥血清病、支氣管炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡等型特意性致敏T細(xì)胞所導(dǎo)致的單個(gè)核細(xì)胞浸潤為主的炎癥和組織壞死傳染性過敏反應(yīng)、接觸性皮炎在致敏階段，易感機(jī)體接觸過敏性食物后，可被誘導(dǎo)產(chǎn)生反應(yīng)性 IgE 抗體。在嬰幼兒時(shí)期，由于胃腸道功能尚不健全，通透性高，食物中的過敏原進(jìn)入到體液中，可以選擇性誘導(dǎo)抗原特異性 B 細(xì)胞產(chǎn)生 IgE 抗體應(yīng)答，然后 IgE 抗體的Fc 段與肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞表面的 IgE 受體結(jié)合，完成致敏過程。在正常狀態(tài)下的人群，對(duì)從呼吸道吸入和通過胃腸道攝入的過敏原可以產(chǎn)生

9、免疫耐受。對(duì)于過敏體質(zhì)的人群，通過這些途徑進(jìn)入的過敏原則可使機(jī)體處于致敏階段。在激發(fā)階段，一樣的抗原再次進(jìn)入機(jī)體時(shí)，通過與致敏肥大細(xì)胞（mast cell, MC）、嗜堿性粒細(xì)胞（basophil， Bas）表面 IgE 抗體特異性結(jié)合，使之脫顆粒，釋放出組胺、5-羥色胺、白三烯、前列腺素與嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等大量生物活性介質(zhì)，作用于效應(yīng)組織和器官，引起局部或全身過敏反應(yīng)10-13。 食物過敏主要是攝食的一部分食品在消化道可能消化不完全，而且未消化完全的組分還可進(jìn)入（或侵入）體，健康的人對(duì)它不會(huì)做出免疫反應(yīng)，然而一些特殊人群會(huì)產(chǎn)生異常的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致各種過敏癥狀。圖1為過敏反應(yīng)發(fā)生機(jī)理示

10、意圖14。圖1 過敏反應(yīng)發(fā)生機(jī)理示意圖吸 附刺激產(chǎn)生某些細(xì)胞抗體機(jī)體過敏原再次刺激過敏原釋放物質(zhì)導(dǎo) 致毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管通透性增強(qiáng)、平滑肌收縮、腺體分泌增加全身過敏反應(yīng)（過敏性休克）呼吸道過敏反應(yīng)（過敏性鼻炎、支氣管哮喘）消化道過敏反應(yīng)（食物過敏性胃腸炎）皮膚過敏反應(yīng)（蕁麻疹、濕疹、血管性水腫）一般來說，食物過敏的過敏原大都來源于食物中的蛋白質(zhì)，而實(shí)際上與過敏反反應(yīng)相關(guān)的僅為其部分抗原決定基(數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)氨基酸)，后者被稱為“表位” (epitope)。雖然原肌球蛋白的結(jié)構(gòu)比較清楚，但是其引起過敏反應(yīng)的表位還比較缺乏。1993年，Shanti等人15首先利用過敏患者的血清和對(duì)照血清發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)蝦

11、過敏原的表位，它們分別是9個(gè)(50-66)和6個(gè)(153-161)氨基酸殘基片斷，超過50%的蝦過敏患者的血清能夠與這兩個(gè)肽段發(fā)生反應(yīng)。為了更好地了解蝦過敏原的表位，1997年Reese等人16利用cDNA文庫技術(shù)以與單克隆抗體對(duì)蝦過敏原進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)4個(gè)肽段存在IgE結(jié)合活性，它們分別是167-179，136-148，262-282，157-169序列的肽段。為了確定蝦過敏原表位的空間位置，Ayuso等人17,18用36段有重復(fù)序列的多肽，他們的組合包括整個(gè)蝦過敏原。當(dāng)用18位蝦過敏患者的血清（能夠和蝦過敏原發(fā)生反應(yīng)）進(jìn)行檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)肽段有IgE結(jié)合活性。IgE結(jié)合位點(diǎn)的長度以與肽段的重

12、復(fù)程度表明一些肽段含有兩個(gè)或以上的表位。如果表位被認(rèn)為是能夠有引起過敏反應(yīng)的最小單位，目前共發(fā)現(xiàn)八個(gè)能夠引起過敏反應(yīng)的肽段19,20。一些條件下，患者的血清只能夠識(shí)別一個(gè)表位，有時(shí)候患者的血清能夠識(shí)別多個(gè)過敏原的表位。1.2.2 食物過敏原消減的方法食物過敏原絕大多數(shù)為蛋白質(zhì)，除去這些蛋白質(zhì)有著相當(dāng)?shù)碾y度。在此背景下，世界上一些先進(jìn)國家試著研究、開發(fā)各種低過敏或抗過敏食品，并取得了一些進(jìn)展。雖然過敏原與抗原決定簇能夠在一定程度上耐受各種形式的加工，但許多研究結(jié)果表明，食品加工過程能夠?qū)κ澄镞^敏原的活性產(chǎn)生影響。根據(jù)處理食物過敏原原理的不同，處理食物過敏原又分為物理化學(xué)方法、生化方法、酶分解法、

13、育種學(xué)方法（篩選、育種不含或少含變應(yīng)原的品種）)、基因工程方法以與非過敏成分的抽出再重組方法等。在食品加工領(lǐng)域中去除過敏原一般采用物理化學(xué)法和酶分解法，但還沒有明確有效和系統(tǒng)的方案。1.2.2.1 物理方法（1）熱處理法由于大部分過敏原屬于蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在高溫時(shí)容易變性，引起空間構(gòu)象與三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。因此，食品加熱到一定程度可以除去過敏原或降低過敏原性。熱處理破壞過敏原取決于加熱的溫度、加熱時(shí)間的長短等外部因素以與蛋白質(zhì)的狀態(tài)、二硫鍵的斷裂與重新形成新的分子作用力等部因素21。加熱對(duì)過敏活性的影響沒有通用的一般規(guī)律，有些過敏原 (牛奶、雞蛋、魚貝類、花生與其制品) 一般都有熱穩(wěn)定性，有些過敏原

14、(豆類、谷物、堅(jiān)果與其制品)有一定的熱穩(wěn)定性，然而還有一些過敏原(水果和胡蘿卜)對(duì)熱比較敏感。另外，熱處理能夠破壞抗原表位，也能夠產(chǎn)生一些新的抗原表位。總之，熱處理對(duì)過敏活性的影響是一個(gè)非常復(fù)雜的問題。（2）輻照法食品輻射加工技術(shù)是一種新型而有效的殺菌保鮮手段，稱為“冷巴斯德殺菌法” (cold pasteurization)，在食品加工中的應(yīng)用越來越廣泛。研究表明，低劑量(<5kGy)導(dǎo)致小分子蛋白質(zhì)的裂解，高劑量可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，而非常高的劑量(>100kGy)可以打斷氨基酸的側(cè)鏈，低劑量到中劑量(<10kGy)可以觀察到一些能的改變。研究結(jié)果表明，輻照對(duì)過敏活性的影響

15、具有復(fù)雜性，輻照造成的食品組分之間的相互作用對(duì)過敏活性具有舉足輕重的作用。有研究者發(fā)現(xiàn)，蝦過敏原在用射線照射后，其過敏活性有明顯的變化，并且隨著輻射劑量的增大，其過敏活性下降越大。分析發(fā)現(xiàn)過敏原的抗原表位受到射線輻射后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變22。此外，蒸煮工藝、高壓處理等對(duì)過敏活性的影響也有研究。1.2.2.2 化學(xué)方法（1）酸堿水解Brnena等人在研究中發(fā)現(xiàn)，在60用Na0H浸泡可以降低桃子和花蜜的過敏活性23。雞蛋中卵白蛋白和卵粘蛋白經(jīng)Na0H處理后，其過敏活性也有所降低。但一般的過敏原對(duì)酸有抵抗作用，這可能是因?yàn)檫^敏原為酸性蛋白質(zhì)，在酸性條件下比較穩(wěn)定，而堿性的條件容易使得其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，

16、相應(yīng)的引起過敏活性的變化。此外，化學(xué)溶劑的抽提對(duì)過敏原的活性也有很大的影響，在精煉的食用油中沒有發(fā)現(xiàn)能夠使患者過敏的成分。（2）美拉德反應(yīng)從食品工業(yè)的角度，美拉德反應(yīng)是在蛋白質(zhì)的氨基和還原糖的羥基之間發(fā)生的一種非常復(fù)雜的一系列非酶反應(yīng)24。它能夠?qū)κ称返馁|(zhì)量包括風(fēng)味、顏色、質(zhì)地以與營養(yǎng)等產(chǎn)生非常重要的影響。一些研究者報(bào)道美拉德反應(yīng)能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)的過敏活性產(chǎn)生影響，而且這種影響取決于蛋白質(zhì)和還原糖的種類。（3）酶解大部分的食物過敏原是蛋白質(zhì)，在一定的條件下，蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生水解。除了酸堿水解外，蛋白酶能夠?qū)^敏原蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，其作用分為兩方面：一是改變抗原決定簇的三級(jí)結(jié)構(gòu)，或者斷裂一些化學(xué)鍵，使

17、之失去原有的活性，從而降低其過敏性。二是斷裂酰胺鍵，破壞過敏原的抗原表位，從而降低過敏原的免疫活性。乳蛋白酶能夠?qū)⑷榍虻鞍椎倪^敏表位進(jìn)行破壞，其結(jié)合IgE的能力受到影響，從而降低乳球蛋白的過敏活性。Kunylohsi S.等人還報(bào)道了多種蛋白酶都能夠?qū)讱ゎ悇?dòng)物過敏原有良好的降解作用，經(jīng)過酶解的甲殼類動(dòng)物蛋白抽提物，其過敏活性幾乎完全消失25。然而酶解處理也很容易對(duì)蛋白質(zhì)的質(zhì)地產(chǎn)生影響，從而影響食品的其他參數(shù)。1.2.2.3 生物法（1）微生物發(fā)酵微生物發(fā)酵是重要的食品加工工藝，許多食品屬于發(fā)酵產(chǎn)品。發(fā)酵能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)的結(jié)果和性質(zhì)進(jìn)行改變。有研究者報(bào)道，大豆的發(fā)酵產(chǎn)品其過敏活性保持不變，也就是說

18、發(fā)酵不能降低大豆的過敏活性。但也有報(bào)道稱發(fā)酵后的酸奶其過敏活性下降超過99%，這種過敏活性在皮膚試驗(yàn)中已經(jīng)無法檢測26。發(fā)酵是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，其對(duì)過敏活性的影響還不是非常清楚，有待進(jìn)一步研究。（2）基因工程前面所提的方法基本都是在過敏原已存在的基礎(chǔ)上，通過加工減少或消除過敏原。從生物遺傳角度，可以通過調(diào)整編碼食物過敏原決定簇的基因，使之無法形成抗原決定簇，并生成沒有致敏性的蛋白質(zhì)，從而從源頭上去除其致敏性。當(dāng)然由于對(duì)抗原決定簇的性質(zhì)了解不深，基因重組有可能引入新過敏原決定簇27。1.3 相關(guān)研究方法1.3.1 過敏實(shí)驗(yàn)方法簡介目前臨床上過敏實(shí)驗(yàn)有皮試法、點(diǎn)眼法、口服液法、靜脈注射法等。靜脈

19、注射法系將實(shí)驗(yàn)藥物按規(guī)定量注入周圍靜脈，據(jù)反應(yīng)癥狀進(jìn)行判別，這種方法藥物進(jìn)入體速度快，但危險(xiǎn)性較大。口服法系將實(shí)驗(yàn)藥物配成適當(dāng)濃度口服液，根據(jù)服后全身癥狀反應(yīng)來判別能否應(yīng)用。點(diǎn)眼法系將實(shí)驗(yàn)藥物直接滴入眼結(jié)膜，在一定時(shí)間后觀察是否充血、紅腫，由此決定藥物能否使用皮試法。過敏反應(yīng)屬于藥物不良反應(yīng)之一，它與毒副作用（也屬不良反應(yīng)）不同，毒副作用與用藥量呈正相關(guān)，而過敏反應(yīng)與劑量的關(guān)系極其微妙，有時(shí)微少的用量，也可引起嚴(yán)重甚至危與生命的過敏反應(yīng)。1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物簡介豚鼠具有易感性，過敏反應(yīng)發(fā)展迅速，且豚鼠的肺臟是一個(gè)持久且極易致敏的靶器官，因此建立全身性和被動(dòng)性過敏反應(yīng)豚鼠是極易致敏的物種，是最普

20、遍使用的藥物過敏動(dòng)物之一。與豚鼠相比，大白鼠和小白鼠的自動(dòng)致敏比較困難，這是由于大白鼠和小白鼠引起致敏的反應(yīng)類型抗體與豚鼠的不同，用普通的方法免疫，這種抗體產(chǎn)生的很弱，且時(shí)間較短。1.4 本文主要研究容與目標(biāo)1.4.1主要研究容（1）找出卵白蛋白使豚鼠出現(xiàn)過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性的最低劑量。正確認(rèn)識(shí)豚鼠的全身過敏反應(yīng)的表現(xiàn)。（2）以等濃度的南美海蝦蛋白致敏，并進(jìn)行激發(fā)，觀察豚鼠的全身過敏反應(yīng)，建立蝦蛋白全身過敏試驗(yàn)的動(dòng)物模型，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。（3）以等濃度的南美海蝦蛋白與其酶解產(chǎn)物進(jìn)行致敏，用蝦蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行激發(fā)，觀察豚鼠的全身過敏反應(yīng)。比較各組的過敏反應(yīng)，篩選出海蝦蛋白過敏原消減效果最好的工藝

21、。（4）掌握豚鼠致敏和激發(fā)的操作要領(lǐng)與操作技術(shù)。1.4.2 研究目標(biāo)（1）建立卵白蛋白豚鼠的致敏陽性模型，觀察卵白蛋白對(duì)豚鼠全身過敏反應(yīng)的影響，初步分析卵白蛋白過敏發(fā)生的機(jī)制。（2）觀察海蝦蛋白過敏原對(duì)豚鼠全身過敏反應(yīng)的影響，建立蝦蛋白過敏的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＃?）觀察木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶酶解的蝦蛋白產(chǎn)物對(duì)豚鼠全身過敏反應(yīng)的影響，以篩選出海蝦蛋白過敏原消減效果最好的酶解工藝。2 材料與方法2.1 材料2.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑南美白對(duì)蝦（活）：購自市水產(chǎn)批發(fā)市場；卵白蛋白：美國Sigma公司，II型，有效期2012年9月；南美蝦蛋白：本院食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室提供；各酶解產(chǎn)物：本院食品科

22、學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室提供；撲爾敏：力生制藥股份，批號(hào)0903006；丙酮：市化學(xué)試劑批發(fā)公司，分析純；無水乙醇，市德恩化學(xué)試劑生產(chǎn)，2008年3月14日出產(chǎn)；氯化鈉（NaCl）：市凱學(xué)試劑生產(chǎn)，2009年8月1日出廠；磷酸氫二鈉（Na 2HPO4）：市贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，2007年3月1日出廠；磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）：市德恩化學(xué)制劑生產(chǎn)，2007年4月3日出廠。2.1.2 實(shí)驗(yàn)器材分析天平，日本島津公司，型號(hào)：AUY120；計(jì)算機(jī)，聯(lián)想，型號(hào)：啟天M4880；電熱鼓風(fēng)干燥箱，錦屏儀器儀表分公司，型號(hào)：101-4；電子天平，精科天平，型號(hào)：FA1004 Max100g；沖洗

23、式豚鼠籠架，家港市生物醫(yī)學(xué)儀器廠生產(chǎn)；其他器材：注射器（1mL，2mL）、鑷子、剪毛剪。其他低值易耗玻璃器材，如燒杯、量筒、保鮮膜若干、濾紙、玻璃棒以與脫脂棉等。2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物英國種Hartly豚鼠，體重170g250g，雌雄各半，購自市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為 SCXK津2005-0001 。2.1.4 藥液與試劑的配制（1）PBS平衡鹽溶液的制備用分析天平精確稱取下列物質(zhì)，配制PBS貯存液和PBS應(yīng)用液。所用試劑與稱取質(zhì)量見表2。表2 PBS平衡鹽溶液的配制試劑NaCl單位/g1.0220.38648.1816用水補(bǔ)足到100mL，調(diào)節(jié)pH=6.5，為濃縮10倍的PBS貯存液，常溫下

24、可保存數(shù)月。取1份PBS貯存液加9份水，混合成0.01mol，pH=7.2±0.1的PBS應(yīng)用液。（2）南美蝦蛋白的制備將南美白對(duì)蝦去殼、去頭、去尾、去腸線后，放在勻漿器中勻漿，然后加入4倍體積的冷丙酮（-20預(yù)冷過夜），8000r·min-1離心15min，收集沉淀物并轉(zhuǎn)移至干凈的濾紙上，分散并讓其在室溫下空氣中風(fēng)干后粉碎，之后用抽提液(1M KCl and 0.5mM DTT(1,4-Dithiothreitol，pH7.4)按1:10的比例抽提過夜，8000r·min-1 離心15min，取上清。沉淀用抽提液繼續(xù)抽提4h，離心取上清。透析過夜，合并兩上清液后

25、冷凍干燥，儲(chǔ)藏于-20的冰箱中備用。經(jīng)檢測，該產(chǎn)物中總蛋白含量約89%。（3）酶解產(chǎn)物的酶解條件將南美蝦蛋白用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶進(jìn)行分解，其酶解條件如下：胰蛋白酶：pH8.0，酶底比1:100，45 ，底物濃度3%；木瓜蛋白酶：pH6.5，酶底比1:100，60 ，底物濃度3%；菠蘿蛋白酶：pH7.5，酶底比1:100，55 ，底物濃度5%。在酶解過程中，注意控制酶解液pH值的控制，酶解時(shí)間均為3h。酶解結(jié)束后，將酶解液pH值至中性，用80滅酶10min，冷凍干燥備用。2.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟2.2.1 動(dòng)物分組與標(biāo)號(hào)2.2.1.1 分組由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有個(gè)體差異，在飼養(yǎng)過程中有可能

26、會(huì)自然死亡，所以每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物至少保證4只。取豚鼠100只，體重170g250g，隨機(jī)分為16個(gè)組。其中，蝦蛋白過敏反應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M有8組，每組4到6只豚鼠，雌雄各半；加熱處理的蛋白質(zhì)組有2組，每組4到6只豚鼠，雌雄各半；蝦蛋白酶解產(chǎn)物過敏原消減組有6組，每組6只豚鼠，雌雄各半。詳見2.2.22.2.1.2 標(biāo)號(hào)常用化學(xué)染料染色編號(hào)，最常用苦味酸溶液(3050 mg·mL-1)涂染成黃色。編號(hào)的原則是：先左后右，從上到下。一般把涂在左前腿上的為1號(hào)，左側(cè)腹部為2號(hào)，左后腿為3號(hào)，頭頂部為4號(hào)，腰背部為5號(hào)，尾基部為6號(hào)，右前腿為7號(hào)，右側(cè)腹部為8號(hào)，右后腿為9號(hào)，不染色的為10號(hào)。若

27、動(dòng)物編號(hào)超過10或更大數(shù)字時(shí)，可使用上述兩種不同顏色的溶液即把一種顏色作為個(gè)倍數(shù)，另一種顏色作為十位數(shù)，這種交互使用可編到99號(hào)。編號(hào)方法見圖2。圖2 動(dòng)物編號(hào)方法2.2.2 動(dòng)物致敏2.2.2.1 蝦蛋白過敏模型組致敏 實(shí)驗(yàn)共分8組，各組的致敏物質(zhì)、致敏途徑、致敏方法和注射劑量如下：第1組 動(dòng)物隔日腹腔注射PBS平衡鹽溶液，1mL·只-1，共3次；第2組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.2%的卵白蛋白溶液，1mL·只-1，共3次；第3組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.1%的卵白蛋白溶液，1mL·只-1，共3次；第4組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.01%的卵白蛋白溶液，1mL·只-1

28、，共3次；第5組 動(dòng)物隔日腹腔注射1%的南美蝦蛋白溶液，1mL·只-1，共3次；第6組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.25%的南美蝦蛋白溶液，1mL·只-1，共3次；第7組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.1%的南美蝦蛋白溶液，1mL·只-1，共3次；第8組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.01%的南美蝦蛋白溶液，1mL·只-1，共3次。2.2.2.2 經(jīng)加熱處理的蛋白質(zhì)組動(dòng)物致敏 實(shí)驗(yàn)共分2組，各組的致敏物質(zhì)、致敏途徑、致敏方法和注射劑量如下：第1組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.2%加熱到70后的卵白蛋白溶液，1mL·只-1，共3次；第2組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.1%加熱到70后的南美

29、蝦蛋白溶液，1mL·只-1，共3次。2.2.2.3 蝦蛋白酶解產(chǎn)物過敏原消減組致敏實(shí)驗(yàn)共分6組，各組的致敏物質(zhì)、致敏途徑、致敏方法和注射劑量如下：第1組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.1%的南美蝦蛋白溶液，1mL·只-1，共3次；第2組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.1%的南美蝦蛋白溶液，1mL·只-1，共3次；第3組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.1%的南美蝦蛋白溶液，1mL·只-1，共3次；第4組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.1%的胰蛋白酶解產(chǎn)物溶液，1mL·只-1，共3次；第5組 動(dòng)物隔日腹腔注射0.1%的木瓜蛋白酶解產(chǎn)物溶液,1mL·只-1，共3次；第6組 動(dòng)物隔

30、日腹腔注射0.1%的菠蘿蛋白酶解產(chǎn)物溶液,1mL·只-1，共3次。2.2.3 過敏反應(yīng)激發(fā)實(shí)驗(yàn) 在末次強(qiáng)化致敏10d后，各動(dòng)物用相對(duì)應(yīng)的致敏物質(zhì)進(jìn)行激發(fā)，觀察動(dòng)物是否發(fā)生過敏反應(yīng)。2.2.3.1 蝦蛋白過敏模型組激發(fā)實(shí)驗(yàn)各組激發(fā)時(shí)所用過敏物質(zhì)、激發(fā)給藥的途徑、激發(fā)的方法和注射劑量如下： 第1組 在末次腹腔注射后10天靜脈注射PBS平衡鹽溶液，2mL·只-1；第2組 在末次腹腔注射后10天靜脈注射0.2%的卵白蛋白溶液，2mL·只-1；第3組 在末次腹腔注射后10天靜脈注射0.1%的卵白蛋白溶液，2mL·只-1；第4組 在末次腹腔注射后10天靜脈注射0.0

31、1%的卵白蛋白溶液，2mL·只-1第5組 在末次腹腔注射后10天靜脈注射1%的南美蝦蛋白溶液，2 mL·只-1；第6組 在末次腹腔注射后10天靜脈注射0.25%的南美蝦蛋白溶液,2 mL·只-1；第7組 在末次腹腔注射后10天靜脈注射0.1%的南美蝦蛋白溶液，2mL·只-1；第8組 在末次腹腔注射后10天靜脈注射0.01%的南美蝦蛋白溶液,2mL·只-1。各動(dòng)物靜脈注射后立即記時(shí)，密切觀察注射后60 min動(dòng)物的各種反應(yīng)，并與時(shí)記錄。2.2.3.2 經(jīng)加熱處理的蛋白質(zhì)組過敏激發(fā)實(shí)驗(yàn)第1組 在末次腹腔注射后10天靜脈注射0.2%加熱到70后的卵白

32、蛋白溶液，2mL·只-1；第2組 在末次腹腔注射后10天靜脈注射0.1%加熱到70后的南美蝦蛋白溶液，2mL·只-1。2.2.3.3 蝦蛋白酶解產(chǎn)物過敏原消減組激發(fā)實(shí)驗(yàn)各組激發(fā)時(shí)所用過敏物質(zhì)、激發(fā)給藥的途徑、激發(fā)的方法和注射劑量如下：第1組 在末次腹腔注射后10天，靜脈注射0.1%的胰蛋白酶解產(chǎn)物溶液，2mL·只-1；第2組 在末次腹腔注射后10天，靜脈注射0.1%的木瓜蛋白酶解產(chǎn)物溶液，2mL·只-1；第3組 在末次腹腔注射后10天，靜脈注射0.1%的菠蘿蛋白酶解產(chǎn)物溶液，2mL·只-1；第4組 在末次腹腔注射后10天，靜脈注射0.1%的胰蛋

33、白酶解產(chǎn)物溶液，2mL·只-1；第5組 在末次腹腔注射后10天，靜脈注射0.1%的木瓜蛋白酶解產(chǎn)物溶液，2mL·只-1；第6組 在末次腹腔注射后10天，靜脈注射0.1%的菠蘿蛋白酶解產(chǎn)物溶液2mL·只-1。各動(dòng)物靜脈注射后立即記時(shí)，密切觀察注射后60 min動(dòng)物的各種反應(yīng)，并與時(shí)記錄。2.2.4 過敏反應(yīng)判定與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)凡在60分鐘豚鼠出現(xiàn)興奮不安、抓鼻、豎毛、打噴嚏、呼吸困難、痙攣、休克和死亡等現(xiàn)象可按表3進(jìn)行分級(jí)，并據(jù)此按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)給每只動(dòng)物評(píng)分。過敏反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)見表3。表3 過敏反應(yīng)判定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分反應(yīng)癥狀結(jié)果0無明顯反應(yīng)陰性1只有輕度抓鼻、顫抖或豎毛弱陽性23次咳

34、嗽、有抓鼻、顫抖或豎毛陽性3多次或連續(xù)咳嗽、伴有呼吸困難或痙攣、抽搐等強(qiáng)陽性4痙攣、抽搐、大小便失禁、休克死亡極強(qiáng)陽性2.2.5 數(shù)據(jù)采集與處理按上述實(shí)驗(yàn)要求記錄原始數(shù)據(jù)，包括出現(xiàn)陽性反應(yīng)的動(dòng)物數(shù)、過敏反應(yīng)的癥狀、死亡動(dòng)物數(shù)、各鼠過敏反應(yīng)評(píng)分，整理各組數(shù)據(jù)，計(jì)算出各組評(píng)分的均值（）±標(biāo)準(zhǔn)差（s），進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，然后根據(jù)方差是否齊進(jìn)行組間差異的顯著性檢驗(yàn)（t檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)）。平均值：，（），其中n為樣本容量 標(biāo)準(zhǔn)差：，（）2.2.5.1 方差齊性檢驗(yàn)要判斷兩個(gè)總體方差21與22是否相等，可用F檢驗(yàn)。求得F統(tǒng)計(jì)量后，按檢驗(yàn)水準(zhǔn)，可查F分布的臨界值表，得臨界值F（1-）/2）和F（/2）

35、。若FF（1-）/2）或FF（/2），P，拒絕H0；若F（1-）/2）FF（/2），則不可拒絕H0。但一般情況F值不小于1，這時(shí)，只要FF（/2），便可拒絕H0；FF（/2），便不可拒絕H0。2.2.5.2 顯著性檢驗(yàn)方法通過F檢驗(yàn)若方差齊性，則可用t檢驗(yàn)；方差不齊性，則用t檢驗(yàn)。tt(/2，n), P，拒絕H0，接受H1，兩個(gè)樣本有差異。同理，tt(/2，df), P，拒絕H0，接受H1，兩個(gè)樣本有差異。（1）：=組間差異無顯著性，：=組間有顯著性；（2）計(jì)算T，即 ；（3）當(dāng)=0.05時(shí)，查分布表，將t與進(jìn)行比較，若t, P，拒絕H0，接受H1，組間有顯著性差異；反之，組間無顯著性差異。3

36、結(jié)果3.1 蝦蛋白過敏反應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⒁訮BS平衡鹽溶液為陰性對(duì)照，以卵白蛋白為陽性對(duì)照，建立了蝦蛋白全身過敏反應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?.1.1各組豚鼠致敏并激發(fā)后的全身過敏反應(yīng)表現(xiàn)豚鼠用不同劑量的卵白蛋白致敏后，部分豚鼠出現(xiàn)咳嗽、抓鼻、打噴嚏、皮毛稍凌亂、倦怠等癥狀，個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)死亡；PBS組豚鼠一切正常，與致敏前幾乎無變化；而用不同劑量的蝦蛋白致敏后的豚鼠反應(yīng)與卵白蛋白組相似。PBS組豚鼠靜脈注射PBS后，豚鼠表現(xiàn)正常，無任何過敏反應(yīng)的表現(xiàn)；各劑量卵白蛋白組動(dòng)物用等濃度的卵白蛋白靜脈注射后，出現(xiàn)不同程度的過敏反應(yīng)，多數(shù)動(dòng)物表現(xiàn)多次咳嗽、抓鼻、打噴嚏、肌力增高、站立不穩(wěn)、驚厥、抽搐、呼吸困

37、難、大小便失禁、直至死亡。各劑量蝦蛋白組動(dòng)物在激發(fā)后的過敏反應(yīng)表現(xiàn)與卵白蛋白組與其相似。結(jié)果見表4。3.1.2各組豚鼠致敏并激發(fā)后的全身過敏反應(yīng)評(píng)判與評(píng)分結(jié)果參照表3 中的過敏反應(yīng)強(qiáng)度的判定標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果見表5。表4 各組豚鼠致敏并激發(fā)后的全身過敏反應(yīng)表現(xiàn)組別例數(shù)致敏物質(zhì)激發(fā)物質(zhì)癥狀/只（均腹腔注射）（均靜脈注射）1244PBS平衡鹽溶液0.2%卵白蛋白PBS平衡鹽溶液0.2%卵白蛋白無異常3只死亡，1只出現(xiàn)抓鼻、咳嗽>3次350.1%卵白蛋白0.1%卵白蛋白均死亡450.01%卵白蛋白0.01%卵白蛋白4只死亡541%南美蝦蛋白溶液1%南美蝦蛋白溶液3只死亡，1

38、只出現(xiàn)呼吸困難650.25%南美蝦蛋白溶液0.25%南美蝦蛋白溶液3只死亡，1只出現(xiàn)、呼吸困難、驚厥760.1%南美蝦蛋白溶液0.1%南美蝦蛋白溶液5只死亡，1只抓鼻、咳嗽>3次、呼吸困難、驚厥、大小便失禁850.01%南美蝦蛋白溶液0.01%南美蝦蛋白溶液1只死亡，1只驚厥，均抓鼻>3次、咳嗽表5 全身過敏反應(yīng)評(píng)判與評(píng)分結(jié)果組 別例數(shù)陽性數(shù)陽性率死亡數(shù)死亡率評(píng)分/只/只 /%/只/%1400000.00±0.002441003753.50±1.0035510051004.00±0.00454802403.80±0.455441003753.

39、75±0.50654803603.00±1.7376583.33583.334.00±0.00854801202.20±1.48*注：與PBS平衡鹽溶液組比較， 0.01P0.05， P0.01 與0.1%卵白蛋白溶液組比較，* 0.01P0.05，*P0.013.2 經(jīng)加熱處理的蛋白質(zhì)過敏原的消除效果評(píng)價(jià)3.2.1 致敏并激發(fā)后的全身過敏反應(yīng)表現(xiàn)豚鼠用加熱后的卵白蛋白溶液和蝦蛋白溶液致敏后，豚鼠出現(xiàn)了不同程度的咳嗽、抓鼻、肌無力、甚至死亡等癥狀。結(jié)果見表63.2.2 蛋白液加熱后豚鼠致敏并激發(fā)后的全身過敏反應(yīng)評(píng)判與評(píng)分結(jié)果參照表3 中的過敏反應(yīng)強(qiáng)度的判

40、定標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果見表7。表6 致敏并激發(fā)的全身過敏反應(yīng)表現(xiàn)組別例數(shù)致敏物質(zhì)激發(fā)物質(zhì)癥狀/只（均腹腔注射）（均靜脈注射）14PBS平衡鹽溶液PBS平衡鹽溶液無異常240.2%卵白蛋白0.2%卵白蛋白3只死亡，1只出現(xiàn)抓鼻、咳嗽>3次360.1%南美蝦蛋白溶液0.1%南美蝦蛋白溶液5只死亡，1只抓鼻、咳嗽>3次、呼吸困難、驚厥、大小便失禁440.2%加熱到70卵白蛋白溶液0.2%加熱到70卵白蛋白溶液均死亡54加熱到70后0.1%南美蝦蛋白溶液加熱到70后0.1%南美蝦蛋白溶液1只死亡，均咳嗽、抓鼻>3次表7 致敏并激發(fā)的全身過敏反應(yīng)評(píng)判與評(píng)分結(jié)果組別例數(shù)

41、陽性數(shù)陽性率死亡數(shù)死亡率評(píng)分/只/只/%/只/%1400000.00±0.0023464510083.33357583.333.50±1.004.00±0.0045510051004.00±0.005441001252.25±1.26注：與PBS平衡鹽溶液組比較， 0.01P0.05， P0.01 與0.1%卵白蛋白溶液組比較，* 0.01P0.05，*P0.01與0.1%蝦白蛋白溶液組比較，0.01P0.05，P0.013.3 蝦蛋白酶解產(chǎn)物過敏原消減效果評(píng)價(jià)3.3.1各組豚鼠致敏并激發(fā)后的全身過敏反應(yīng)表現(xiàn)豚鼠用蝦蛋白致敏后，部分豚鼠出現(xiàn)了不

42、同程度的咳嗽、抓鼻、肌無力等癥狀，個(gè)別豚鼠出現(xiàn)死亡；用不同酶解產(chǎn)物致敏后的豚鼠反應(yīng)與蝦蛋白相似。不同酶解產(chǎn)物靜脈注射后，各組豚鼠出現(xiàn)了不同程度的咳嗽，抓鼻等癥狀，并有個(gè)別豚鼠死亡。結(jié)果見表8。3.3.2各組豚鼠致敏并激發(fā)后的全身過敏反應(yīng)結(jié)果評(píng)判結(jié)果參照表3 中的過敏反應(yīng)強(qiáng)度的判定標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果見表9。表8 各組豚鼠致敏并激發(fā)后的全身過敏反應(yīng)表現(xiàn)組別例數(shù)致敏物質(zhì)激發(fā)物質(zhì)癥狀/只（均腹腔注射）（均靜脈注射）060.1%南美蝦蛋白溶液0.1%南美蝦蛋白溶液5只死亡，1只抓鼻、咳嗽>3次、呼吸困難、驚厥、大小便失禁160.1%南美蝦蛋白溶液0.1%胰蛋白酶解產(chǎn)物咳嗽、抓鼻

43、>3次、1只略有肌無力、呼吸困難260.1%南美蝦蛋白溶液0.1%木瓜蛋白酶解產(chǎn)物抓鼻>3次360.1%南美蝦蛋白溶液0.1%菠蘿蛋白沒接產(chǎn)物抓鼻3次，2只未iv已過敏死亡460.1%胰蛋白酶解產(chǎn)物0.1%胰蛋白酶解產(chǎn)物抓鼻2次、1只多次咳嗽550.1%木瓜蛋白酶解產(chǎn)物0.1%木瓜蛋白酶解產(chǎn)物第一只死亡，均抓鼻，一只多次咳嗽660.1%菠蘿蛋白酶解產(chǎn)物0.1%菠蘿蛋白沒解產(chǎn)物多次抓鼻、咳嗽>3次表9 蝦蛋白酶解產(chǎn)物過敏反應(yīng)評(píng)判與評(píng)分結(jié)果組別例數(shù)陽性數(shù)陽性率死亡數(shù)死亡率評(píng)分/只/只/%/只/%06583.33583.334.00±0.0016466.67001.33&

44、#177;1.21*26116.67000.33±0.82*36466.67233.331.67±1.86*46233.33000.50±0.84*553601201.40±1.67*66350001.00±1.10*注：與PBS平衡鹽溶液組比較， 0.01P0.05， P0.01 與0.1%南美蝦蛋白溶液組比較，* 0.01P0.05，*P0.014分析與討論4.1 動(dòng)物模型的建立建立動(dòng)物模型是現(xiàn)在最常見的研究過敏癥的方法，因此選擇合適的動(dòng)物來建立模型對(duì)過敏癥的研究有著極其重要的意義。常見用來建立過敏模型的動(dòng)物有很多，例如豚鼠、猴子、狗、大鼠

45、、小鼠等。豚鼠是常用來建立過敏模型的動(dòng)物之一，與其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相比，豚鼠易于致敏，常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接受致敏物質(zhì)的反應(yīng)程度是豚鼠>家兔>狗>小鼠>貓>蛙。當(dāng)兩次注射抗原后，豚鼠即可以有規(guī)律的發(fā)展成急性典型休克，支氣管平滑肌收縮、發(fā)紺、虛脫、呼吸困難而死亡，是全身過敏反應(yīng)研究的良好動(dòng)物模型，并且豚鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)與人類相似。但由于豚鼠飼養(yǎng)條件要求較高，在飼養(yǎng)過程中個(gè)別豚鼠不適應(yīng)環(huán)境意外死亡，因此在實(shí)驗(yàn)過程中至少保證每組至少觀察4例。4.2 蝦蛋白過敏反應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑽r蛋白是一種常見的食物過敏原。為了消減其中的過敏原，制作低敏或不過敏的食品，本實(shí)驗(yàn)前期工作篩選出了經(jīng)酶

46、水解的蝦蛋白產(chǎn)物。為了評(píng)價(jià)南美蝦蛋白酶解產(chǎn)物過敏原的消減效果，本研究進(jìn)行了在體過敏實(shí)驗(yàn)。豚鼠具有易感性，過敏反應(yīng)發(fā)展迅速，是建立過敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统Ｓ玫膭?dòng)物。本實(shí)驗(yàn)選用豚鼠，經(jīng)腹腔注射過敏原致敏，敏化后通過靜脈注射進(jìn)行激發(fā)，觀察過敏原引起的全身過敏反應(yīng)。以PBS平衡鹽溶液作為陰性對(duì)照，以卵白蛋白為陽性對(duì)照，建立蝦蛋白全身過敏反應(yīng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。結(jié)果顯示，PBS平衡鹽溶液組動(dòng)物致敏并激發(fā)后，豚鼠較致敏前未發(fā)生任何改變；不同劑量卵白蛋白的各組豚鼠均發(fā)生了不同程度的過敏反應(yīng)，嚴(yán)重者出現(xiàn)過敏性休克死亡。在所觀察的各劑量中，引起100%極強(qiáng)陽性反應(yīng)的最小濃度為0.1%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析得出：0.1%卵白蛋白組與

47、PBS平衡鹽溶液組相比，過敏反應(yīng)程度（評(píng)分）有顯著性差異（P0.05）；不同劑量蝦蛋白的各組豚鼠也都發(fā)生了不同程度的過敏反應(yīng)，嚴(yán)重者出現(xiàn)過敏性休克死亡。在所觀察的各劑量中，引起100%極強(qiáng)陽性反應(yīng)的最小濃度為0.1%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出：0.1%南美蝦蛋白溶液組與PBS平衡鹽溶液組相比，過敏反應(yīng)有顯著性差異（P0.05），與0.1%卵白蛋白組模型組的效果相似（P0.05）。由上述結(jié)果，一方面可以證明南美蝦蛋白過敏原的提取效果很好，另一方面也證實(shí)本實(shí)驗(yàn)的全身過敏反應(yīng)動(dòng)物模型成功建立，為下述實(shí)驗(yàn)奠定了可靠的基礎(chǔ)。4.3 蝦蛋白酶解產(chǎn)物過敏原消減效果評(píng)價(jià)用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和胰蛋白酶水解蝦蛋白，得

48、到三種酶解產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)分別用0.1%蝦蛋白和0.1%各酶解產(chǎn)物進(jìn)行致敏，再用酶解產(chǎn)物激發(fā)。結(jié)果無論用蝦蛋白致敏或酶解產(chǎn)物致敏的動(dòng)物，在受到酶解產(chǎn)物激發(fā)后，其過敏反應(yīng)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度均明顯降低和減輕。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與0.1%南美蝦蛋白陽性對(duì)照組相比，各酶解產(chǎn)物過敏反應(yīng)的陽性發(fā)生率有顯著性差異（均P0.05）。其中應(yīng)用胰蛋白酶解后，過敏反應(yīng)的消減效果最為明顯。由上述分析可知，三種蛋白酶的蝦蛋白酶解產(chǎn)物過敏原均明顯減少，消減效果較好，使用較為安全。其中，以胰蛋白酶的酶解產(chǎn)物過敏原消減效果最佳。4.4 蝦蛋白過敏原過敏發(fā)生機(jī)制的初步分析組胺是廣泛存在人體的一種自體活性物質(zhì)，并由組胺酸經(jīng)脫羧酶的作用脫

49、羧而成。新合成的組胺立即與肝素和蛋白質(zhì)結(jié)合，以無活性的復(fù)合物形式儲(chǔ)存于肥大細(xì)胞和是堿性粒細(xì)胞的顆粒中。當(dāng)變應(yīng)原或理化刺激損傷這些細(xì)胞時(shí)，引起肥大細(xì)胞脫顆粒同時(shí)有組胺釋放，組胺立即與鄰近的靶細(xì)胞不同亞型的組胺受體結(jié)合，產(chǎn)生相應(yīng)的變態(tài)反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用酶解法，減少因攝入刺激而引起的組胺釋放。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：酶解法對(duì)海蝦蛋白過敏原是有一定消減效果的。模型組、陽性對(duì)照組以與受試樣品組分別于陰性對(duì)照組之間分別存在顯著性差異。利用胰蛋白酶解后的南美蝦蛋白產(chǎn)物進(jìn)行全身過敏試驗(yàn)評(píng)分為0.50±0.84，利用木瓜白酶解后的南美蝦蛋白產(chǎn)物進(jìn)行全身過敏試驗(yàn)評(píng)分為1.40±1.67，利用菠蘿白酶

50、解后的南美蝦蛋白產(chǎn)物進(jìn)行全身過敏試驗(yàn)評(píng)分為1.00±1.10。本實(shí)驗(yàn)同期還觀察了上述制品對(duì)致敏豚鼠離體回腸平滑肌的攻擊作用，認(rèn)為過敏反應(yīng)的發(fā)生與組胺釋放有關(guān)。4.4.1卵白蛋白對(duì)致敏豚鼠離體回腸平滑肌的影響圖3 0.2mL卵白蛋白攻擊試驗(yàn)圖4 經(jīng)撲爾敏處理的腸管0.2mL白蛋白攻擊試驗(yàn)卵白蛋白使其致敏的腸平滑肌收縮明顯加強(qiáng)，見圖3。事先用撲爾敏處理，再加入卵白蛋白進(jìn)行攻擊，腸管的收縮力較未經(jīng)撲爾敏處理的腸管明顯減弱，說明撲爾敏對(duì)卵白蛋白的過敏反應(yīng)有明顯的拮抗作用，見圖44.4.2蝦白蛋白對(duì)致敏豚鼠離體回腸平滑肌的影響圖5 0.2mL0.1%蝦蛋白攻擊試驗(yàn)圖6經(jīng)撲爾敏處理的腸管，用蝦蛋

51、白攻擊前后的腸收縮曲線蝦蛋白使其致敏的腸平滑肌收縮明顯加強(qiáng)，見圖5。當(dāng)加入撲爾敏后，撲爾敏對(duì)于組胺與組胺-1型受體結(jié)合起到拮抗作用，緩解了腸管的緊程度，因此表現(xiàn)為收縮力下降。在受到蝦蛋白攻擊后，由于過敏反應(yīng)收縮力加強(qiáng)，因此曲線上升，見圖6。4.4.3胰蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)致敏豚鼠離體回腸平滑肌的影響圖7 0.1%蝦蛋白對(duì)胰蛋白酶酶解物致敏腸管的攻擊作用胰蛋白酶酶解產(chǎn)物致敏的豚鼠腸管在經(jīng)蝦蛋白攻擊后，腸管收縮力未見明顯變化，與之前用0.1%蝦蛋白致敏，并用0.1%蝦蛋白攻擊的結(jié)果進(jìn)行比較，腸管收縮力明顯減弱，見圖74.5 實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問題（1）配置的蛋白溶液，應(yīng)放入冰箱保存，防止活性降低，用前取出，

52、放至室溫，且其放置時(shí)間不得超過14天。（2）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中，由于操作不熟練，進(jìn)行腹腔注射時(shí)有時(shí)會(huì)傷到豚鼠的臟，造成動(dòng)物意外死亡，同時(shí)由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有個(gè)體差異等，這些影響了數(shù)據(jù)的采集。（3）每次腹腔注射，針頭應(yīng)與注射部位成45°角，由右下到左上給藥，整個(gè)過程應(yīng)注意消毒，先進(jìn)針再推藥。（4）腹腔注射時(shí)，應(yīng)在注射器前安裝無菌過濾器，且操作時(shí)間不宜過長，以免蛋白溶液堵塞過濾器，更不可用注射器直接吸取蛋白液。（5）每次做完實(shí)驗(yàn)后都與時(shí)清洗注射器和過濾器，用無菌蒸餾水浸泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對(duì)試驗(yàn)臺(tái)面與器械消毒，將注射器浸泡于75%酒精中30min以上，做到徹底滅菌，以免豚鼠傷口感染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。（6

53、）數(shù)據(jù)采集過程中，人為原因造成的隨機(jī)誤差可能對(duì)數(shù)據(jù)有影響。由于動(dòng)物的個(gè)體差異，其表現(xiàn)出來的過敏反應(yīng)也有差別，增加動(dòng)物數(shù)可減少這種誤差。5 結(jié)論與展望5.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)論甲殼類食品是人類最優(yōu)質(zhì)的動(dòng)物蛋白的來源之一，也是八大類容易引起食物過敏的食物之一。隨著國際貿(mào)易的發(fā)展，其在食品中的應(yīng)用越來越廣泛，因食用甲殼類食品過敏的潛在危害更值得重視。本論文利用酶解法來消減南美蝦蛋白的過敏反應(yīng)，主要結(jié)論如下：（1）酶解法可以使南美蝦蛋白的過敏反應(yīng)得以減弱，出現(xiàn)因過敏致死的可能性大大降低。（2）在選用酶方面，可以得出，胰蛋白酶在本實(shí)驗(yàn)中的活性最高，只出現(xiàn)輕微的過敏反應(yīng)。（3）通過本次實(shí)驗(yàn)還推斷過敏反應(yīng)與致敏劑量、

54、激發(fā)劑量是有關(guān)的。 致敏劑量太小，則抗體IgE 的生成量不足, 在激發(fā)時(shí)能夠形成過敏物質(zhì)IgE 復(fù)合物不足；即使IgE生成量足夠, 如果激發(fā)量太少, 則仍會(huì)導(dǎo)致過敏物質(zhì)IgE 復(fù)合物不足, 兩種情況均導(dǎo)致釋放的生物活性介質(zhì)偏少, 從而不足以使機(jī)體表現(xiàn)出過敏現(xiàn)象。（4）過敏反應(yīng)與致敏時(shí)間有關(guān), 可能是致敏時(shí)間長, 有利于生成更多的IgE。（5）經(jīng)加熱處理后蝦蛋白過敏原未消除，與陰性對(duì)照組比較具有顯著性。因此，加熱處理的蝦蛋白過敏原基本不能消減。5.2 展望食物過敏的防治食物過敏的防治應(yīng)著眼于過敏原和機(jī)體免疫狀態(tài)兩個(gè)方面。一方面盡可能查出過敏原，使過敏者避免與其接觸；另一方面，可針對(duì)食物過敏的發(fā)生

55、發(fā)展過程，通過切斷或干擾其中的某些環(huán)節(jié)，達(dá)到防治的目的。目前臨床上通常采用的防治方法有以下幾種：（1）檢出過敏原，避免與之接觸過敏原是過敏發(fā)生的必要條件，離開了過敏原就可以避免過敏的發(fā)生，這是種經(jīng)濟(jì)而有效的辦法28。目前這是有效治療食物過敏的手段之一，但在實(shí)踐過程中難以完全避免食物過敏原。牛奶、雞蛋、花生等食物是嬰幼兒的主要產(chǎn)品，但又是主要的食物過敏原，其次為魚、貝類、堅(jiān)果(也以花生為主)、水果等食物，雖然隨著嬰幼兒年齡的增長，腸道屏障功能的發(fā)育不斷完善，多數(shù)食物過敏可以緩解，但部分兒童仍存在食物過敏，并可引發(fā)哮喘等疾病。（2）特異性免疫療法過去80多年中，特異性的免疫療法(STI)已成功地運(yùn)

56、用于I型變態(tài)反應(yīng)的治療，STI主要是用大劑量天然過敏原的提取物進(jìn)行皮注射。STI一般主要用于吸入性抗原導(dǎo)致的過敏，如塵蝸、動(dòng)物皮屑和花粉等，在食物過敏原中應(yīng)用較少。有學(xué)者在進(jìn)行花生過敏的特異性免疫治療研究后指出，多數(shù)病人可耐受比治療前劑量大的花生抗原。這種天然過敏原的大劑量皮注射可能會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的變應(yīng)性疾病。采用改變其glE抗原結(jié)合表位的主要氨基酸序列，既保持T細(xì)胞的表位活性，促進(jìn)T細(xì)胞增殖，又降低glE的表位結(jié)合能力，從而達(dá)到抗過敏的作用。已證實(shí)這種方法對(duì)部分食物過敏癥如花生、魚、蝦過敏的病人治療有效。目前，主要采用兩種辦法對(duì)食物過敏原進(jìn)行重組異構(gòu)29：一種方法與主要過敏原的IgE表位突變有關(guān)；另一種方法是