影響鏈格孢菌生長及產(chǎn)孢的因子-

1、17(11619中國生物防治Ch inese Journal of B i ol ogical Control2001年2月影響鏈格孢菌生長及產(chǎn)孢的因子黃世文1,余柳青1,A lan K1W atson2(11中國水稻研究所,杭州310006;21Internati onal R ice Research Institute,P1O1Box933,M anila1099,Phili pp ines摘要:在實驗室研究了影響稗草病原真菌鏈格孢生長及產(chǎn)孢的因子。鏈格孢菌可在較寬的溫度范圍內(nèi)生長、繁殖;連續(xù)黑暗、空氣充足條件下有利于產(chǎn)孢;該菌在4種不同的植物產(chǎn)品上培養(yǎng)可產(chǎn)生大量的孢子,最多的無芒稗籽上

2、每克干物質(zhì)產(chǎn)孢量達3159×108個,這些培養(yǎng)物在首次產(chǎn)孢收獲后均可直接培養(yǎng)作二次產(chǎn)孢利用。固體(菌塊和液體(菌懸液接種培養(yǎng)物均能成功產(chǎn)孢。但培養(yǎng)量大時液體接種優(yōu)于固體接種,產(chǎn)孢量與接種菌懸液濃度呈正相關(guān)。關(guān)鍵詞:鏈格孢菌;生長;產(chǎn)孢;生物防治分類號:S45;Q949.331+.3文獻標(biāo)識碼:A文章編號:100529261(20010120016204目前,一些稗草微生物制劑已處于試用階段或已商品化13。國內(nèi)近年在稗草病原菌的篩選、評價方面也有一些報道46。鏈格孢菌屬(A lternaria s pp.是一類寄主范圍很廣的病原真菌,可寄生多種雜草和作物,至今有12種鏈格孢菌已開發(fā)或正

3、在開發(fā)成微生物除草劑,如決明鏈格孢(A.cassiae防治鈍葉決明、望江南、美麗豬屎豆;百日草鏈格孢(A.z inniae防治蒼耳;粗鏈格孢(A.crassa防治曼陀羅等79。一般認為,真菌微生物制劑多是利用其孢子,這是因為孢子不論是穩(wěn)定性、活力、侵染力還是壽命等方面均比真菌其它階段更具優(yōu)勢10。因此,開發(fā)廉價、高效、可大量生產(chǎn)菌孢子的培養(yǎng)基及其技術(shù)是真菌微生物制劑成功的關(guān)鍵。稗草鏈格孢菌A lternaria alternata(F r.Keissler是從田間自然罹病的稗草標(biāo)樣上分離獲得,經(jīng)生測,該菌對稗草致病力強,鮮重防效在60%左右,對水稻小苗有輕度影響,但隨后可恢復(fù)正常。在從稗草病標(biāo)

4、樣中分離到的近百個病原菌中,該菌占41.3%,是感染稗草造成葉片和葉鞘病斑的主要病原真菌之一,本文研究了影響該菌生長及產(chǎn)孢的多種因子。1材料與方法1.1菌種的分離、培養(yǎng)和保存鏈格孢菌是作者從田間自然感病稗草標(biāo)樣中分離獲得,經(jīng)單孢純化后在半強度PDA斜面培養(yǎng)基上于4保存?zhèn)溆?。接種時移入PDA培養(yǎng)基平板中央,于28±0.5恒溫培養(yǎng)7天,取邊緣、生長旺盛的菌絲塊作為接種體。1.2溫度對菌生長及產(chǎn)孢的影響直徑9c m(下同消毒培養(yǎng)皿中倒入20m l PDA培養(yǎng)基,接入7mm直徑菌塊,處理溫度:收稿日期:2000204218基金項目:農(nóng)業(yè)部“九五”高新技術(shù)重點項目(02-03-03;國際合作項

5、目作者簡介:黃世文(19622,男,學(xué)士,副研究員。第1期黃世文等:影響鏈格孢菌生長及產(chǎn)孢的因子(128±0.5恒溫;(29月份室溫,晝 夜溫度28 20左右;(312月份室溫,晝 夜溫度20 8左右;(4溫室:溫度13±133±1(室溫、溫室溫度用最高最低寒暑表每天記錄,下同,處理后2天以十字交叉法測量菌落直徑,每隔1天測量1次,直到生長最快的處理長滿培養(yǎng)皿,同時觀察菌落顏色、形狀。最后一次測量后,用含0.05%吐溫220的無菌水20m l刮下菌落及孢子,裝廣口瓶中充分搖勻,用2層紗布過濾得菌懸液,用血球計數(shù)器在顯微鏡下測量孢子含量,并最終計算出每皿產(chǎn)孢數(shù)。各處

6、理重復(fù)3次,以下均相同。1.3光照、通氣對產(chǎn)孢的影響培養(yǎng)皿中倒入20m l PDA培養(yǎng)基,接種菌塊后,A組培養(yǎng)皿用parafil m膠帶封口,B組不封口。處理(1置恒溫28±0.5連續(xù)黑暗培養(yǎng);(2用3層黑布包裹(模擬連續(xù)黑暗置9月份室溫;(3不用布包裹置室溫(自然光培養(yǎng)7、14天。按1.2法收集、計算每皿產(chǎn)孢數(shù)。1.4不同培養(yǎng)基質(zhì)對產(chǎn)孢的影響稱取大麥、小麥、無芒稗籽粒、米糠及曬干后的稗稈、稗葉(0.5c m長各10g置250m l三角瓶中,除米糠加5m l溫開水(拌勻達飽和不滴水外,其他均加水10m l預(yù)浸24小時,121高溫高壓處理30分鐘,取出冷卻后接菌種2塊,充分搖勻。置28

7、±0.5培養(yǎng)7、14天,用100m l 0105%吐溫220無菌水洗下孢子,2層紗布過濾,收集孢子,按1.2法測量孢子數(shù),計算每克干物質(zhì)產(chǎn)孢量。過濾后培養(yǎng)物擠干水分均勻攤開,連紗布置培養(yǎng)皿中,恒溫培養(yǎng),作二次產(chǎn)孢試驗。7天后以同樣方法收集孢子,計算孢子數(shù)。1.5接種方法和接種濃度對產(chǎn)孢的影響設(shè)計鏈格孢菌不同接種方法和接種量在無芒稗籽上的產(chǎn)孢試驗。(1菌塊(固體接種;(2菌懸液(液體接種:2m l濃度為3.5×106個孢子 m l菌懸液,接于10g稗籽上,充分搖勻,作如下處理:置恒溫28±0.5黑暗培養(yǎng);置12月室溫培養(yǎng);置溫室13±133±1培

8、養(yǎng);(3不同濃度菌懸液接種:50g干稗籽裝入500m l三角瓶中,加50m l溫開水預(yù)浸24小時消毒后分別用5塊1c m直徑菌塊和10m l菌懸液接種,菌懸液濃度分別為3.5×107、3.5×108、3.5×109個 m l,置恒溫、溫室和12月室溫條件下培養(yǎng),分別在7、14、21天按1.4法收獲孢子,計算產(chǎn)孢量,進行統(tǒng)計分析。2結(jié)果與分析2.1溫度對菌生長及產(chǎn)孢的影響鏈格孢菌菌落在28±0.5恒溫下開始生長速度較快,前2天生長速度為7.5mm d,后為11mm d;在9月室溫較高、晝夜溫差不大的情況下,菌落生長較好,室溫較低的12月和晝夜溫差較大的溫室

9、,菌落生長較慢(表1。生長較快的處理,菌絲豐富,孢子相對較少;相反,生長較慢的處理菌絲較少,相對地孢子產(chǎn)量較高。菌絲(孢子初為淡黃至黃褐色,隨著培養(yǎng)時間延長,逐漸轉(zhuǎn)為黑色。2.2光照、通氣對產(chǎn)孢的影響鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上,不同處理條件下產(chǎn)孢水平差異顯著。連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng),不論是恒溫還是室溫自然條件,培養(yǎng)皿不用parafil m封口時產(chǎn)孢能力強,封口條件下菌株產(chǎn)孢能力明顯降低;室溫不封口連續(xù)黑暗培養(yǎng)產(chǎn)孢能力要強于室溫不封口自然光照(表2。說明連續(xù)黑暗,空氣充足條件下有利于該菌產(chǎn)孢。表1溫度對鏈格孢菌生長及產(chǎn)孢的影響處理菌落直徑(mm 2d4d 6d 8d 8d 產(chǎn)孢量(107個 皿恒溫15

10、.0a 45.5a 64.0a 86.5a4.6c 溫室11.5c 36.5b 56.5b 75.5ab 8.3a 室溫12月13.0b 41.0ab 59.5b82.0a 3.9d 室溫9月8.8d12.0c39.5c68.0b7.2b注:同列數(shù)據(jù)后不同字母表示5%水平下差異顯著,下同。表2光照和通氣對產(chǎn)孢的影響條件處理方法7d 14d恒溫黑暗封口0.86d 3.37c黑暗不封口3.16b 16.04a 室溫9月黑暗封口0.58e 3.04c 黑暗不封口6.64a 15.96a 自然光封口0.37f 2.78c 自然光不封口1.57c14.56b注:封口指用parafli m 膠帶密封培養(yǎng)皿

11、。2.3不同培養(yǎng)基質(zhì)對產(chǎn)孢的影響鏈格孢菌在無芒稗籽、稗莖、稗葉、大麥粒、小麥粒、米糠4種不同植物產(chǎn)品上都能大量產(chǎn)生孢子(表3,菌株在這些物質(zhì)中培養(yǎng)7或14天收獲孢子后,培養(yǎng)基質(zhì)還可繼續(xù)培養(yǎng)作二次產(chǎn)孢利用,其中在無芒稗籽上產(chǎn)孢量最多。培養(yǎng)7和14天每克干稗籽兩次產(chǎn)孢之和分別可達3.59×108和3.16×108個孢子。產(chǎn)孢量較少的米糠每克干物質(zhì)的兩次產(chǎn)孢量之和也分別達到1.09×108和7.56×107個孢子,其產(chǎn)孢量與在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的每皿產(chǎn)孢量相當(dāng)。鏈格孢菌在稗稈和稗葉上均能大量產(chǎn)生孢子,兩者產(chǎn)量相差不大,但產(chǎn)孢量明顯少于稗籽。表3不同培養(yǎng)基

12、質(zhì)對產(chǎn)孢的影響(107個孢子 g 干物質(zhì)培養(yǎng)物7d一次產(chǎn)孢二次產(chǎn)孢14d一次產(chǎn)孢二次產(chǎn)孢培養(yǎng)物7d一次產(chǎn)孢二次產(chǎn)孢14d一次產(chǎn)孢二次產(chǎn)孢米糠0. 50f10.35b 1.18d6.38c無芒稗籽13.20a 22.72a 16.30a15.30a 麥粒3.93d 9.41c 6.90c 8.40b 稗稈6.52b 4.36e 8.61b 3.14e 大麥粒3.68e 8.80d8.95b 4.13d 稗葉5.86c4.02e6.29c2.78ePDA10.57-33.50-2.4接種方法和接種濃度對產(chǎn)孢的影響鏈格孢菌不論是采用固體還是液體接種,不論恒溫、室溫和溫室條件下均可在無芒稗籽上大量產(chǎn)生

13、孢子。在培養(yǎng)物較少(10g 稗籽的情況下,固體接種產(chǎn)孢量多于液體接種。但隨著培養(yǎng)量的增加(50g 稗籽、接種菌懸液濃度的提高,液體接種法每克無芒稗籽產(chǎn)孢量明顯多于固體接種的產(chǎn)孢量(圖。A :菌塊接種;B :菌懸液接種(3.5×107 m l ;C :菌懸液接種(3.5×108 m l ;D :菌懸液接種(3.5×109 m l 圖不同接種方法、濃度鏈格孢菌在無芒稗籽上的產(chǎn)孢比較3討論鏈格孢菌適應(yīng)性強,相對較低或較高的溫度只能減緩而不會抑制其生長繁殖,晝夜變溫更中國生物防治第17卷第1期黃世文等:影響鏈格孢菌生長及產(chǎn)孢的因子有利于孢子形成。鏈格孢菌生長繁殖快,對營養(yǎng)

14、要求低,產(chǎn)孢能力強,在一些廉價農(nóng)產(chǎn)品上均可大量產(chǎn)生孢子。培養(yǎng)基質(zhì)在第一次收獲孢子后還可作二次產(chǎn)孢利用。其生長及產(chǎn)孢特性正是病原菌成為微生物制劑所必須的。連續(xù)黑暗、空氣充足條件下有利于鏈格孢菌產(chǎn)孢。鏈格孢菌對稗草及其它雜草的致病性,寄主范圍特別是對水稻及相近的禾本科作物的毒性還需作進一步的研究,該菌與其它雜草病原菌、化學(xué)除草劑混用對雜草的防效也值得探討。參考文獻1Tebeest O D,Yang X B,et al.The status of bi ol ogical control of w eeds w ith fungal pathogensJ.A nn.Rev.Phytopathol.,

15、1992,17:302310.2W ats on A K,et al.P rogress of a bi ol ogicalw eed control p roject in rice2based cropp ing syste m s in Southeast A siaR.The16th A sian2PacificW eed Science Society Conference.1997.342344.3Bow ers R C.Comm ercializati on of Collego,an industrialists vie wJ.W eed Sci.,1986,34:2425.4

16、王明旭,羅寬.稗葉枯菌及其毒素的研究: .病原鑒定及產(chǎn)孢產(chǎn)毒條件J.湖南農(nóng)學(xué)院學(xué)報,1991,17(1:3441.5陳勇,倪漢文.中國稗草病原真菌對稗草及水稻的致病性J.中國生物防治,1999,15(2:7376.6Yu L iuqing,W ats on A K,H uang Shi w en,et al.Screening and Evaluati on of Barnyardgrass(E chinochloa s pp.PathogensDB.V ietna m:W orkshop of IP M N etwork,1999.7強勝.生物除草劑的研究概況J.雜草科學(xué),1996,2:11

17、14.8李樹正,岳東霞,劉準(zhǔn),等.茄鏈格孢培養(yǎng)濾液抗菌活性物質(zhì)的研究J.植物病理學(xué)報,1997,27(2:161165.9董金皋,樊慕貞,楊英如,等.蕓苔鏈格孢菌種內(nèi)和鏈格孢菌種間的酯酶同工酶比較J.植物病理學(xué)報,1997,27(2:167173.10Boyette C D,Q ui m by P C J r,Connick W J,et al.P rogress in the p roducti o n,for m ulati o n and app licati o n of m ycoherbicidesA.In:Tebeest D O,ed.M icrobial Control ofW

18、 eedsM.N e w York:Chapm an and Hall,1992.209222.Factors Affecti n g Growth and Sporula ti on of A lterna ria a lterna taHUAN G Sh i w en,YU L iuqing,A lan K1W ats on(Ch ina N ati onal R ice R esearch In stitute,H angzhou310006,Ch inaAbstract:T he grow th and con idia p roducti on characteristics of A lternaria alternata (F r1Keissler,a pathogen ic fungus of barnyardgrass(E ch inochola s pp1w as studied in labo rato ry1A1alternata could grow and s po rulate bet w een13±1-33±11T he ability of con idia p roducti on w as p romo ted in con tinuous dark an