尼莫地平對急性損傷后大鼠背根節(jié)細(xì)胞cfos、cjun m

1、尼莫地平對急性損傷后大鼠背根節(jié)細(xì)胞cfos、cjun mRNA表達(dá)的影響尼莫地平對急性損傷后大鼠背根節(jié)細(xì)胞cfos、cjun mRNA表達(dá)的影響作者：姚旭,丁新生,唐金榮,吳婷,德偉,袁櫟 作者單位：210029南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科姚旭(現(xiàn)在馬鞍山中心醫(yī)院）,丁新生,唐金榮,吳婷；南京醫(yī)科大學(xué)生化教研室（德偉，袁櫟） 【摘要】 目的 探討鈣離子拮抗劑尼莫地平對急性外周神經(jīng)損傷后大鼠背根神經(jīng)節(jié)cfos、cjun mRNA表達(dá)的影響。方法 建立大鼠坐骨神經(jīng)切斷模型，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）半定量法，檢測經(jīng)尼莫地平預(yù)處理的大鼠在制模后不同時間（5 min、15 min、30

2、min、60 min、120 min），以及同一時間（60 min）應(yīng)用不同劑量(2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg)尼莫地平時大鼠背根神經(jīng)節(jié)cfos、cjun mRNA的表達(dá)水平的變化。結(jié)果 與對照組比較，損傷組cfos mRNA表達(dá)于損傷后30 min、60 min、120 min，cjun mRNA表達(dá)于損傷后15 min、30 min、60 min、120 min顯著升高（均P0.05）；而尼莫地平組與對照組各時間點cfos、cjun mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。與損傷組比較，尼莫地平組cfos、cjun mRNA表達(dá)于30 min、60 min、120 min

3、明顯降低（均P0.001）。不同劑量尼莫地平預(yù)處理后，cfos mRNA的表達(dá)隨尼莫地平劑量的增加而逐漸減少，各劑量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P0.05），cfos mRNA表達(dá)水平與用藥劑量呈負(fù)相關(guān)（r=-2.663,P0.05）；cjun mRNA表達(dá)各劑量組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，亦無劑量相關(guān)性。結(jié)論 急性外周神經(jīng)損傷時應(yīng)用鈣離子拮抗劑尼莫地平，早期通過抑制cfos、cjun mRNA的表達(dá)，對外周神經(jīng)損傷有一定的保護(hù)作用。 【關(guān)鍵詞】 尼莫地平；cfos；cjun；神經(jīng)保護(hù)作用Effects of Nimodipine on the cfos and cjun mRNA expres

4、sions in dorsal root ganglia of rate following acute injury YAO Xu, DING Xinsheng, TANG Jinrong, et al.Department of Neurology, First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China Abstract：Objective To explore the effects of Nimodipine on oncogene cfos and cjun mRNA expres

5、sions in dorsal root ganglia of rats following acute sciatic nerve injury. Methods Nimodipine at a dose of 10 mg/kg at 5, 15, 30, 60 and 120 min and at a different dose of 2.5, 5 and 10 mg/kg at 60 min was given to each rat through intraperitoneal injection before transection of sciatic nerve. Using

6、 reverse transcription PCR (RTPCR) technique, the cfos and cjun mRNA expressions were detected at 5, 15, 30, 60 and 120 min after injection of Nimodipine and following acute sciatic nerve injury.Results Compared with control group, the expressions of cfos mRNA in injury group were obviously increase

7、d at 30, 60 and 120 min after injury (all P0.05). cjun mRNA expressions were also increased at 15, 30, 60 and 120 min (all P0.05). There was no significant difference in the cfos and cjun mRNA expressions between Nimodipine group and control group. Distinctly decreased expressions of cfos and cjun m

8、RNA were seen in Nimodipine group at 30, 60 and 120 min, compared with injury group (all P0.001). In different dose group, the cfos mRNA expression was gradually reduced with the raise of Nimodipine in dose. It was a remarkable difference between each other group at a different Nimodipine dose of 2.

9、5, 5 and 10 mg/kg (all P0.05). cfos mRNA expression was moderately negatively related to the dose of Nimodipine (r=-2.663, P0.05). There was no obvious difference in the expression of cjun mRNA among different dose group.Conclusions Nimodipine can significantly inhibit the cfos and cjun mRNA express

10、ions in rat dorsal root ganglia. It may have neuroprotective effect on the early acute peripheral nerve injury period. Key words：Nimodipine;cfos;cjun;neuroprotective effect由缺血、機(jī)械性損傷等造成的神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷，可引起即早基因（IEGs）cfos、cjun表達(dá)增強(qiáng)。本研究選擇大鼠坐骨神經(jīng)切斷模型，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）技術(shù)，觀察鈣離子拮抗劑尼莫地平對急性外周神經(jīng)損傷后背根神經(jīng)節(jié)cfos、cjun mRNA

11、表達(dá)的影響，探討其神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動物及分組 SD大鼠42只，雌雄不限，質(zhì)量240270 g，南京醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。將大鼠隨機(jī)分為正常對照組(3只)、損傷組及尼莫地平組。損傷組和尼莫地平組依據(jù)制模后不同時間點分為5個亞組（5 min、15 min、30 min、60 min、120 min），每組3只。另有9只大鼠依照制模前應(yīng)用不同劑量的尼莫地平預(yù)處理分為低劑量組（2.5 mg/kg）、中劑量組（5 mg/kg）及高劑量組（10 mg/kg），每組3只。1.1.2 主要儀器及試劑 低溫高速離心機(jī)；紫外分光光度儀；PCR擴(kuò)增儀；電泳儀、電泳槽；全自動凝

12、膠圖像分析系統(tǒng)。RNA提取試劑（Invitrogen公司產(chǎn)品No.15596026）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）；尼莫地平注射液（尼莫同，德國拜耳公司）。1.2 方法1.2.1 藥物干預(yù)方法 尼莫地平組大鼠制模前10 min予以腹腔注射尼莫地平10 mg/kg 1次。低、中、高劑量組大鼠制模前10 min分別給于相應(yīng)劑量的尼莫地平腹腔注射1次，正常對照組及損傷組無藥物預(yù)處理。1.2.2 動物模型制備 采用Kenney等1方法改良后，大鼠給予腹腔注射硫賁妥鈉（50 mg/kg）麻醉后俯臥位固定，背側(cè)中線切口，在L4、L5會聚處分離出右側(cè)坐骨神經(jīng)并用絲線結(jié)扎，于近端處用虹膜手術(shù)剪剪去2.0

13、 mm，縫合傷口。正常對照組不手術(shù)。1.2.3 標(biāo)本采集及處理 各組于相應(yīng)時間點，迅速取損傷側(cè)L4、L5背根神經(jīng)節(jié)，置于液氮瓶中-70冰箱中保存待用。1.2.4 cfos mRNA及cjun mRNA的檢測 （1）背根神經(jīng)節(jié)RNA提取：按試劑盒說明操作。（2）RTPCR引物序列：cfos上游為5ATGATGTTCTCGGGTTTCAA3，下游為5TGACATGCTCTTCACCACTC3，擴(kuò)增片段長度為348 bp；cjun上游為5ATGACTGCAAAGATGGAAAC3，下游為5TTGAAGTTGCTGAGGTTGGC 3，擴(kuò)增片段長度為530 bp。內(nèi)對照actin的引物由北京三博遠(yuǎn)志生

14、物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，序列上游為5CCACGAGAAGATGACCCAGAT 3，下游為5GAAGCATTTGCGGTGGACGA 3，擴(kuò)增片段長度為877 bp。（3）RTPCR：提取后的RNA于70孵育10 min后置于冰上備用,配制RT反應(yīng)液20 l,按下列條件進(jìn)行RT：室溫（30）10 min，42 5 min，95 5 min，5 5 min。RT完成后配制PCR反應(yīng)液，按下列條件進(jìn)行擴(kuò)增：95預(yù)變性2 min后，進(jìn)入95變性1 min，55.5(cfos)/56(cjun)退火1 min，72延伸1 min，共循環(huán)35次，最后72延伸2 min。（4）反應(yīng)完畢后將PCR產(chǎn)物加入加

15、樣緩沖液，置1%瓊脂糖凝膠，80V恒壓電泳30 min。用PCR Marker作分子量標(biāo)準(zhǔn)，電泳完畢后在紫外光燈下觀察，進(jìn)行陽性條帶密度掃描，計算mRNA指數(shù)（RI）。RI越高，mRNA水平越高。RI= cfos、cjun mRNA掃描值/actin掃描值100%。PCR結(jié)果經(jīng)圖像分析軟件作半定量分析。1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，成組間比較運(yùn)用單因素方差分析。不同劑量組的組間比較采用ANOVA及線性回歸分析。2 結(jié)果2.1 各組各時間點cfos mRNA、cjun mRNA表達(dá)水平的比較 見圖1、表1。與正常對照組比較，損傷組及尼莫地

16、平組的12345（5 min、15 min、30 min、60 min、120 min）cfos mRNARI于損傷后30 min、60 min、120 min顯著升高（均P0.05），cjun mRNA于損傷后15 min、30 min、60 min、120 min顯著升高（均P0.05）。尼莫地平組cfos mRNA、cjun mRNARI與正常對照組比較各時間點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；與損傷組比較，其cfos mRNA、cjun mRNA RI于30 min、60 min、120 min明顯降低（均P0.001）。圖1 尼莫地平組、損傷組各時間點cfos、cjun mRNA的表達(dá)（略）M為M

17、arker（2000 bp-2000、1000、800、500、200、100 bp）。c-fos、c-jun、-actin的陽性條帶見于損傷組的123456（正常對照組、5 min、15 min、30 min、60 min、120 min）2.2 不同劑量尼莫地平對cfos mRNA、cjun mRNA表達(dá)的影響 見圖2、表2。不同劑量組間cfos mRNA表達(dá)水平隨劑量的加大而逐漸減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P0.05），呈劑量負(fù)相關(guān)（r=-2.663,P0.05）；cjun mRNA表達(dá)各劑量組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，亦無劑量相關(guān)性。表1 各組、各時間點cfos mRNA、cjun mRNA

18、RI的比較（略）注：與損傷組比較*P0.001；與正常對照組比較P0.05，圖2 不同劑量尼莫地平對cfos、cjun mRNA表達(dá)的影響（略）M為Marker（2000 bp-2000、1000、800、500、200、100 bp）。cfos、cjun、actin的陽性條帶見于123（低、中、高劑量組）表2 不同劑量尼莫地平預(yù)處理組cfos mRNA、cjun mRNA RI的比較（略）注：與中劑量組比較P0.05；與高劑量組比較*P0.053 討論cfos mRNA、cjun mRNA為IEGs的家族成員，其表達(dá)產(chǎn)物為細(xì)胞核的磷酸蛋白，在神經(jīng)細(xì)胞對外界刺激應(yīng)答中起中介作用，是神經(jīng)元激活的

19、標(biāo)志之一2，參與神經(jīng)系統(tǒng)對各種刺激所發(fā)生的立即和長時程反應(yīng)過程。cfos、cjun mRNA的表達(dá)早期出現(xiàn)在損傷后存活的神經(jīng)元中3，其表達(dá)水平可作為判斷損傷后神經(jīng)元功能狀態(tài)的有效指標(biāo)。正常組織內(nèi)都有低水平的cfos、cjun mRNA表達(dá)，在多種病理條件下可引起不同程度的表達(dá)變化，并且與刺激種類、性質(zhì)、強(qiáng)度和持續(xù)時間有關(guān)4。cfos mRNA作用的發(fā)揮與cjun密切相關(guān),cjun和cfos mRNA編碼的蛋白fos與jun在細(xì)胞內(nèi)形成二聚體，構(gòu)成轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1（AP1）的主要部分，作為第三信使5 參與細(xì)胞信息傳遞;在病理狀態(tài)下與許多疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在再生、修復(fù)、凋亡等方面都起著重要作

20、用。坐骨神經(jīng)切斷后，神經(jīng)細(xì)胞可出現(xiàn)神經(jīng)生長因子缺乏、受體缺失、Ca2+內(nèi)流、氧自由基增多、興奮性氨基酸升高等生化條件改變。興奮性氨基酸升高，可通過激活花生四烯酸代謝級聯(lián)反應(yīng)等使活性氧類生成增加，導(dǎo)致氧化應(yīng)激發(fā)生。氧化應(yīng)激則可通過抑制鈣調(diào)蛋白依賴的過程、動員線粒體該庫內(nèi)Ca2+的釋放等增加胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+的水平。這些最終引起細(xì)胞內(nèi)Bcl2的表達(dá)降低、Bax的表達(dá)增高，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和死亡。大量證據(jù)表明，谷氨酸N甲基D天冬氨酸（GluNMDA）受體激活是IEGs表達(dá)的關(guān)鍵因素，而受體活化引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2+和蛋白激酶C（PKC）第二信使系統(tǒng)是表達(dá)的必要條件6。Murphy等7認(rèn)為Glu 受體

21、活化是刺激cfos基因表達(dá)的主要途徑，應(yīng)用NMDA受體拮抗劑能明顯減少cfos mRNA和cjun mRNA的表達(dá)。Morgan等8認(rèn)為NMDA可促使cfos mRNA的表達(dá)作用，并與增強(qiáng)磷脂酰肌醇(PI)的降解、PKC激活及鈣通道開放有關(guān)。體外研究9表明，鈣通道激動劑可誘導(dǎo)IEGs的表達(dá)，而鈣通道拮抗劑則抑制IEGs的表達(dá)，這提示細(xì)胞內(nèi)Ca2+是調(diào)控IEGs表達(dá)的另一主要因素。本實驗運(yùn)用Ca2+拮抗劑尼莫地平腹腔注射，觀察其對大鼠坐骨神經(jīng)切斷模型的L4、L5背根神經(jīng)節(jié)cfos mRNA、cjun mRNA表達(dá)的影響。尼莫地平屬于L型Ca2+拮抗劑，其半衰期是1.11.7 h，于0.6 h達(dá)血

22、漿峰值濃度。本研究結(jié)果表明尼莫地平對cfos mRNA、cjun mRNA的表達(dá)有明顯的阻斷作用，在30 min、60 min、120 min時與損傷組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且cfos mRNA的表達(dá)隨尼莫地平的濃度的增高而逐漸降低，存在劑量負(fù)相關(guān)；cjun mRNA的表達(dá)則無劑量相關(guān)性。提示cjun mRNA的表達(dá)可能還受除Ca2+以外的其他物質(zhì)影響，損傷時細(xì)胞內(nèi)Ca2+增高刺激cjun mRNA表達(dá)，卻抑制了其他刺激cjun mRNA表達(dá)的因素。當(dāng)損傷后的適應(yīng)抑制了鈣通道后，其他因素得以激活，并增強(qiáng)cjun mRNA的表達(dá)，故而cjun mRNA對鈣拮抗劑濃度的增加不敏感。 本實驗結(jié)果提

23、示，急性外周神經(jīng)損傷可引起cfos mRNA、cjun mRNA表達(dá)的增強(qiáng)，鈣離子拮抗劑預(yù)處理可抑制其的表達(dá)，并且對cfos mRNA的抑制有劑量相關(guān)性。cfos mRNA、cjun mRNA的表達(dá)可作為研究外周神經(jīng)損傷后細(xì)胞代謝改變的一項指標(biāo)，測定藥物對損傷干預(yù)作用的一種方法，在實際應(yīng)用中有很大潛力，為外周神經(jīng)損傷的防治提供實驗室依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Keney AM,Kocsis JD.Peripheral axotomy induces longterm cjun aminoterminal kinase1 activation and activator protein1 landing

24、 activity by cjun and junD in adult rat dorsal root ganglia in vivo.J Neurosci,1998,18:1318.2Radhakrishna M, Almazan G.Protein kinases mediate basic fibroblast growth factors stimulation of proliferation and cfos induction in oligodendrocyte progenitors.Brain Res Mol Brain Res, 1994, 24: 118.3Takemoto O, Tomimoto H, Yanagihara T.Induction of cfos and cjun gene products and heat shock protein after brief and prolonged cerebral ischemia in gerbils.Stoke, 1995, 26: 1639.4Jang MH, Chang HK, Shin MC, et al.Effect of ginseng radix on cfos expression in the hippocam