外源糖對蘋果果實山梨醇代謝相關(guān)酶活性的影響

1、外源糖對蘋果果實山梨醇代謝相關(guān)酶活性的影響摘要：以新紅星蘋果為試材，采用果實圓片孵育體系研究了外源糖對SDH和SOX活性的影響。結(jié)果表明：在整個發(fā)育過程當中，蘋果果實的SDH活性與葡萄糖、果糖和蔗糖含量間不存在顯著的相關(guān)性；而SOX活性與葡萄糖和果糖含量間存在極顯著的相關(guān)性。外源山梨醇和蔗糖均可提高發(fā)育前期和發(fā)育后期蘋果果實的SDH和SOX活性，其中以山梨醇的誘導(dǎo)作用最為顯著。外源葡萄糖對SDH活性的增加具有顯著的促進作用，但抑制SOX活性，而外源果糖對蘋果果實SDH和SOX活性的誘導(dǎo)效果與葡萄糖恰好相反。結(jié)果還表明，外源糖對發(fā)育前期蘋果果實SDH和SOX的誘導(dǎo)作用均顯著高于對發(fā)育后期蘋果果實

2、的誘導(dǎo)作用。由此推斷，蘋果果實中山梨醇代謝相關(guān)酶的活性變化受到可溶性糖的調(diào)控。 關(guān)鍵詞：蘋果果實；外源糖；山梨醇脫氫酶；山梨醇氧化酶 Effects of Soluble Sugars on Related Enzyme Activities of Sorbitol Metabolism in Developing Apple Fruit YE Cheng-rong, LIU Geng-sen, WANG Yong-zhang, LI PEi-huan, LIU Cheng-lian ，YUAN Yong-bing (College of Gardens and Horticulture, Q

3、ingdao Agriculture University, Qingdao, Shandong 266109, China) : The regulating effects of soluble sugars on activities of SDH and SOX were studied in Starkrimson apple fruits through disk incubation. The results showed that the activities of SDH in apple fruit had no significant correlation with t

4、he concentrations of glucose, fructose and sucrose during the whole developmental period. However, the activities of SOX had significant positive correlation with glucose and fructose concentrations. The results also indicated that exogenous sorbitol and sucrose highly increased the activities of SD

5、H and SOX, moreover, the exogenous glucose indicated the highest promoting effects on SDH activity, but inhibited the activity of SOX significantly. On the other hand, the exogenous fructose showed reverse regulating action on SDH and SOX activities compared with exogenous glucose. The exogenous stu

6、dy also indicated that the regulating effects of exogenous sugars on the fruit at early developmental stage were much higher compared with the fruit at late developmental stage. It is concluded that the metabolism of sorbitol in apple fruit was regulated by soluble sugars.Key words: apple fruit; exo

7、genous sugar; sorbitol dehydrogenase; sorbitol oxidase 果實所積累糖的種類、含量及比率是決定其品質(zhì)及商品價值的重要因素1。近幾年眾多研究結(jié)果表明，可溶性糖不僅作為代謝基質(zhì)為植物發(fā)育提供能量和中間產(chǎn)物，而且還具有信號功能，可通過多條途徑在不同水平上調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)酶的基因表達和酶活性變化2-3。山梨醇作為蘋果光合同化產(chǎn)物的主要輸出和運輸形式1, 4，在蘋果果實內(nèi)可被迅速轉(zhuǎn)化4。山梨醇脫氫酶（SDH）和山梨醇氧化酶（SOX）是參與山梨醇代謝的關(guān)鍵酶，其中SDH將山梨醇還原成果糖，SOX將山梨醇氧化成葡萄糖4-6。發(fā)育過程當中，蘋果果實SDH和SO

8、X活性變化與可溶性糖含量間的關(guān)系尚不清楚，本研究以新紅星蘋果為試材對比進行了探討與分析。 1 材料和方法 1.1 材料 試驗于20092010年在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹試驗中心進行。以12年生新紅星（Malus domestica Borkh. cv. Starkrimson）為試材，樹勢中庸，生長發(fā)育正常，常規(guī)田間管理。從花后間隔15 d取樣1次，每次隨機取50個果實，果肉用液氮速凍后置-80 超低溫冰箱貯存?zhèn)溆谩７謩e在花后50 d和100 d進行外源糖孵育試驗。 1.2方法 1.2.1可溶性糖的測定葡萄糖、果糖和蔗糖的測定采用高效液相色譜法（HPLC）7。柱溫40 ，流速2 mL/min，RID

9、示差檢測器；流動相為乙腈水=8317，每次進樣體積為20 l，根據(jù)樣品峰面積和標準曲線計算蔗糖、葡萄糖和果糖含量。 1.2.2果實圓片試驗參照Beruter等8的方法略有改動。將花后50 d和100 d的果實分割成直徑1.0 cm，厚0.1 cm的圓片，在平衡緩沖液中平衡30 min后進行外源糖孵育試驗。取5 g果肉圓片與20 mL分別加入濃度為100 mmol?L-1的葡萄糖、果糖、山梨醇、蔗糖的MES緩沖液混合（用100 mmol?L-1甘露醇調(diào)節(jié)各反應(yīng)液的滲透勢），放入50 mL的三角瓶中，在搖床上振蕩反應(yīng)16 h（25 ），測定SDH和SOX的活性。3次重復(fù)。 1.2.3酶液的制備及酶

10、活性測定稱取1 g果肉于研缽內(nèi)，加少量石英砂和5 mL的50 mmol?L-1 HEPES-NaOH（pH 7.5），冰浴研磨勻漿，12 000 g，4 離心20 min。上清液用稀釋10倍的提取緩沖液透析15 h。參照Yamaki等5的方法測定SDH和SOX的活性。 2 結(jié)果與分析 2.1 發(fā)育過程當中蘋果果實山梨醇代謝相關(guān)酶活性及可溶性糖含量變化 圖1表明，發(fā)育前期，蘋果果實的SDH和SOX活性均較低。從花后45 d開始，SDH活性增加顯著，到花后75 d，SDH活性達到最高，之后隨果實發(fā)育逐漸下降直至果實成熟。與SDH的活性變化相比，整個發(fā)育過程當中SOX活性較低且變化較小。在發(fā)育前期，

11、SOX與SDH活性差異不顯著。從花后45 d開始，SOX活性緩慢上升，到花后120 d達到最大值，但顯著低于SDH活性。從圖2可以看出，發(fā)育早期新紅星蘋果果實的果糖和蔗糖含量均較低，而葡萄糖含量在花后30 d有一定增加。隨著果實的發(fā)育，從花后60 d開始，果糖和葡萄糖含量迅速增加，其中以果糖的積累最為顯著。到果實發(fā)育后期，新紅星蘋果果實的果糖含量最高，葡萄糖含量次之?？v觀蘋果果實的整個發(fā)育過程，蔗糖含量僅在發(fā)育后期才有一定的增加，但最終含量仍較低，遠低于果糖和葡萄糖的含量。 2.2 發(fā)育過程中蘋果果實山梨醇代謝相關(guān)酶活性與可溶性糖含量間的相關(guān)性 在整個發(fā)育過程中，蘋果果實的SDH活性變化與葡萄

12、糖、果糖和蔗糖含量間均不存在顯著的相關(guān)關(guān)系（表1）。而SOX活性與蘋果果實的葡萄糖和果糖含量間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.789 1和0.900 2。蘋果果實的SOX活性與蔗糖含量間的相關(guān)系數(shù)雖達到0.634 6，但經(jīng)顯著性測驗表明，二者間并不存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。 2.3 外源糖對蘋果果實山梨醇脫氫酶活性的影響 圖3表明，分別用濃度為100 mmol?L-1的葡萄糖、果糖、山梨醇、蔗糖孵育果實圓片16 h，可影響蘋果果實的SDH活性，但不同糖種類間存在差異。從圖3可以看出，山梨醇、葡萄糖和蔗糖可顯著提高發(fā)育前期蘋果果實的SDH活性，與對照相比，其活性分別增加了4.82，3.41

13、，1.64倍；對于發(fā)育后期的蘋果果實，其活性僅增加了1.32，0.76，0.54倍。而外源果糖處理均抑制發(fā)育前期和發(fā)育后期蘋果果實的SDH活性，與對照相比，活性分別下降了0.56倍和0.49倍。 2.4 外源糖對蘋果果實山梨醇氧化酶活性的影響 從圖4可以看出，與外源糖對SDH的誘導(dǎo)效果相類似，外源山梨醇和蔗糖也可顯著提高發(fā)育前期和發(fā)育后期蘋果果實的SOX活性。與對照相比，發(fā)育前期果實的SOX活性分別增加了4.79倍和1.70倍，而發(fā)育后期果實的SOX活性僅增加了1.38倍和0.44倍。圖4還表明，蘋果果實的SOX活性受到外源葡萄糖的抑制和果糖的促進。與對照相比，外源果糖處理，發(fā)育前期和發(fā)育后期

14、蘋果果實的SOX活性分別增加了3.38倍和1.37倍。而外源葡萄糖處理，發(fā)育前期和發(fā)育后期蘋果果實的SOX活性分別下降了0.59倍和0.52倍。 3 討論 眾多研究結(jié)果表明，蘋果果實中糖的積累受到果實庫強、韌皮部卸載、跨膜運輸、碳水化合物代謝及相關(guān)酶活性等方面的調(diào)控4, 5, 9。山梨醇作為蘋果光合同化產(chǎn)物的主要輸出和運輸形式，在葉片中占可溶性總糖的80%，而在果實中僅占總糖的3%8%，表明山梨醇可在果實內(nèi)被迅速轉(zhuǎn)化4，山梨醇經(jīng)韌皮部卸載，在果實中被SDH和SOX轉(zhuǎn)化成果糖和葡萄糖，參與果實的生長發(fā)育和品質(zhì)形成4-5。由圖1可以看出，發(fā)育前期，蘋果果實的SDH和SOX活性都較低。可能原因在于，

15、在生長發(fā)育早期，蘋果的萌芽、展葉和開花坐果需要消耗大量的同化產(chǎn)物，蘋果幼葉自身的光合能力較弱，因此，合成與外運到果實中的山梨醇較少。同時，發(fā)育早期的幼果又是主要的代謝庫，需要大量的碳水化合物，而轉(zhuǎn)運來的山梨醇可作為代謝基質(zhì)用于呼吸代謝、細胞分裂和細胞形成4。隨著果實的生長發(fā)育和品質(zhì)形成，需要碳水化合物的不斷供給，多數(shù)葉片在此期也發(fā)育成為代謝源9。蘋果“源（葉片）庫（果實）”關(guān)系建立，從葉片轉(zhuǎn)運來的山梨醇在糖代謝相關(guān)酶的作用下轉(zhuǎn)化成蘋果果實發(fā)育過程中的暫時性貯存物（淀粉），維持了果實的庫強，保證了光合同化產(chǎn)物從源葉向果實的不斷輸入。而代謝庫（果實）對山梨醇需求量的增加，導(dǎo)致山梨醇的卸載能力增強，

16、所以，在果實的發(fā)育中期，SDH和SOX活性逐漸升高。越來越多的研究結(jié)果表明，植物體內(nèi)存在己糖激酶、依賴己糖但不依賴己糖激酶以及特殊的蔗糖信號系統(tǒng)。植物可通過細胞的糖感知系統(tǒng)調(diào)控與糖代謝有關(guān)的基因表達和酶活性的變化10。一般而言，糖抑制基因表達的多屬于正調(diào)節(jié)，而促進基因表達的多屬于負調(diào)節(jié)。植物體糖枯竭時可以改變相關(guān)酶的基因表達，從而誘導(dǎo)已有蛋白的重組，新蛋白的合成，使光合作用、再運輸和輸出光合產(chǎn)物相關(guān)基因的表達增強。當植物體糖含量較高時，可以通過阻遏和誘導(dǎo)相結(jié)合，起到與糖枯竭時相反的調(diào)控作用10?？v觀蘋果果實的整個發(fā)育過程，從山梨醇代謝相關(guān)酶SDH和SOX與可溶性糖的相關(guān)性（表1）可以看出，不同

17、糖種類與SDH和SOX間的相關(guān)性差異較大，表明葡萄糖、果糖和蔗糖對SDH和SOX活性的變化可能存在不同的調(diào)控作用或作用機理。從表1可以看出，發(fā)育過程中蘋果果實的SOX活性與果糖含量存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，說明發(fā)育過程中果實中逐漸積累的果糖可能誘導(dǎo)SOX活性的提高。外源果糖顯著提高發(fā)育前期和發(fā)育后期蘋果果實的SOX活性充分驗證了這一論點。對SDH而言，雖然整個發(fā)育過程中，葡萄糖、果糖和蔗糖與SDH間均不存在顯著的相關(guān)關(guān)系，但經(jīng)相關(guān)與回歸分析表明，發(fā)育后期（花后75135 d）蘋果果實的SDH活性與果糖含量間存在極顯著的負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)高達-0.940 4，表明發(fā)育后期蘋果果實SDH活性的下降

18、可能受到果糖的抑制。外源果糖顯著抑制了發(fā)育前期和發(fā)育后期蘋果果實的SDH活性進一步驗證了這一推斷，由此可以看出，隨著果實的生長發(fā)育，果實中果糖含量逐漸增加，而不斷增加的果糖反饋抑制了SDH的活性。因此，果糖對蘋果果實的山梨醇代謝可能存在雙重調(diào)控作用。 從本試驗結(jié)果還可以看出，外源山梨醇均可提高發(fā)育前期和發(fā)育后期蘋果果實的SDH和SOX活性，其原因可能是通過增加酶促反應(yīng)底物濃度促進了SDH和SOX活性的提高。而外源蔗糖促進SDH和SOX活性提高的可能機制為，蔗糖本身就可誘導(dǎo)SDH和SOX的活性變化，或者蔗糖在轉(zhuǎn)化酶或蔗糖合酶的作用下轉(zhuǎn)化成己糖，再通過己糖誘導(dǎo)SDH和SOX的活性。鑒于果實糖代謝路徑的多樣性，酶學(xué)調(diào)控和糖誘導(dǎo)相關(guān)酶基因表達及活性變化的復(fù)雜性2, 9-11，可溶性糖調(diào)控山梨醇代謝的具體生理機制有待進一步研究。 參考文獻： 1 Beruter J. Sugar accumulation and changes in the activities of related enzymes during development of apple fruitJ. Journal of Plant Physiology, 1985, 12