發(fā)酵罐中生產(chǎn)納豆激酶的條件與動(dòng)力學(xué)研究_圖文

1、發(fā)酵罐中生產(chǎn)納豆激酶的條件與動(dòng)力學(xué)研究3沙維1,劉妍妍1,張麗萍1,21(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶,1633192(黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心,黑龍江大慶,163319摘要對(duì)納豆桿菌進(jìn)行了10L 發(fā)酵罐分批發(fā)酵試驗(yàn),研究發(fā)酵罐裝液量、接種量、攪拌槳轉(zhuǎn)速對(duì)納豆激酶發(fā)酵的影響,并采用Logistic 方程、Luedking 2Piret 方程、Luedking 2Piret 2like 方程描述了發(fā)酵中菌體生長(zhǎng)、納豆激酶生成、基質(zhì)消耗特性。在裝液量5L 、接種量3%、攪拌槳轉(zhuǎn)速400r/m in 條件下,發(fā)酵得到納豆激酶活力4476125I U /mL,分批發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模

2、型與實(shí)驗(yàn)值擬合度較好。關(guān)鍵詞納豆激酶,液態(tài)發(fā)酵,優(yōu)化,動(dòng)力學(xué)第一作者:碩士研究生(張麗萍教授為通訊作者。3黑龍江省農(nóng)墾總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(HNKX I V 206205a ;黑龍江省研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(YJSCX20092125HLJ 收稿日期:2009-11-15納豆激酶具有很強(qiáng)的纖溶活性1,可由細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)。從已有的研究報(bào)道來(lái)看,目前國(guó)內(nèi)納豆激酶研究多集中在菌種篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化方面,且規(guī)模較小,僅限于搖瓶,在發(fā)酵罐中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)報(bào)道尚少。由于搖瓶發(fā)酵的條件與發(fā)酵罐的發(fā)酵條件在一定程度上存在差異,往往存在著“放大效應(yīng)”2,所以,在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上有必要對(duì)發(fā)酵罐的發(fā)酵條件做進(jìn)一步的研究。熊曉

3、輝3以優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件進(jìn)行5L 發(fā)酵罐發(fā)酵放大試驗(yàn),與搖瓶發(fā)酵比較,發(fā)酵產(chǎn)酶有所提前,到60h 時(shí)酶活最高達(dá)到2250I U /mL 。黃俊4研究以317L B i oengineering K LF2000型發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵,研究發(fā)現(xiàn),菌體濃度和溶氧是影響菌體產(chǎn)酶的重要因素,最終發(fā)酵液中納豆激酶的酶活由搖瓶時(shí)的1314I U /mL 提高到在317L發(fā)酵罐中的2348I U /mL 。梁淑娃5在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)上研究了50L 罐和500L 罐發(fā)酵情況,最終酶活最高分別達(dá)到2210U /mL 和1934U /mL 。本文在前期搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上,對(duì)納豆激酶10L 發(fā)酵罐的液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)

4、化,并對(duì)該菌株進(jìn)行了發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究,建立了菌體生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物形成數(shù)學(xué)模型,為納豆激酶工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。1材料與方法111菌種納豆桿菌(B ail subticlsc (natto ,黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院畜產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室選育和保存。112培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基:大豆蛋白胨110g,牛肉膏(總氮13%013g,NaCl015g,葡萄糖011g,瓊脂210g,pH 712,加水100mL 。發(fā)酵種子培養(yǎng)基:葡萄糖310g,大豆蛋白胨(總氮9%210g,MgS O 4012g,K 2HP O 4011g,KH 2P O 4012g,CaCl 0103g,pH 610,加水100mL 。發(fā)酵培養(yǎng)基

5、:可溶性淀粉310g ,酪蛋白013g,KH 2P O 4014g,K 2HP O 4014g,CaCl 20102g,豆粕粉210,pH710,加水100mL 。113主要儀器與設(shè)備振蕩培養(yǎng)箱(HGCE 2F160哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;全自動(dòng)發(fā)酵罐(G BJS -10鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司;空氣壓縮機(jī)(W -013、1215泉州市新華壓縮機(jī)械有限公司;全自動(dòng)小型蒸汽鍋爐系列(LDR3(6.91017Z 江心服裝機(jī)械有限公司。114菌體培養(yǎng)方法11411液體種子培養(yǎng)基制備在250mL 錐形瓶中分裝50mL 無(wú)菌的種子培養(yǎng)基,接入1環(huán)已活化的納豆激酶斜面菌種,37,180r/m

6、 in 的條件下振蕩培養(yǎng)9h,再將一級(jí)種子液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%接種到裝50mL 的種子培養(yǎng)基的250mL 錐形瓶中,繼續(xù)培養(yǎng)14h,作為二級(jí)種子備用。1141210L 全自動(dòng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)將二級(jí)種子液接入10L 全自動(dòng)發(fā)酵罐中,按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵罐管路經(jīng)鍋爐壓力為0114-0120MPa 蒸汽消毒30m in 后,發(fā)酵罐罐體110-112MPa 空消30m in,發(fā)酵培養(yǎng)基液上罐,110-112MPa 實(shí)消30m in,待發(fā)酵液冷卻為34時(shí),接入液體菌種,進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵罐進(jìn)氣口壓力為0125MPa,出氣口壓力為0105 MPa,空氣流量為30L/m in。115納豆激酶活力的測(cè)定方法發(fā)酵

7、液經(jīng)4000r/m in離心30m in,收集上清液,適當(dāng)稀釋后即為粗酶液,取樣10L按照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部W S2011(X200695關(guān)于“蚓激酶的部頒標(biāo)準(zhǔn)"中"尿激酶瓊脂糖-纖維蛋白平板法”測(cè)定活力。116菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定取發(fā)酵液10mL,6000r/m in離心15m in,用無(wú)菌蒸餾水洗2次,80干燥至恒重。117殘?zhí)堑臏y(cè)定用DNS法6測(cè)定。118發(fā)酵罐培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)分別研究不同裝液量(2、3、4、5、6L、不同接種量(1%、2%、3%、4%、5%、不同攪拌漿轉(zhuǎn)速(200、300、400、500、600r/m in對(duì)納豆激酶酶活力的影響。11910L全自動(dòng)發(fā)

8、酵罐發(fā)酵動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)按118所述優(yōu)化后的培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),測(cè)定生物量、酶活、殘?zhí)橇?計(jì)算發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方程。2結(jié)果與分析211酶活測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線以尿激酶為標(biāo)準(zhǔn)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)S AS912軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=219310x2511021,相關(guān)系數(shù)為019904,作為以下試驗(yàn)中納豆激酶活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。212裝液量對(duì)納豆激酶產(chǎn)量的影響將二級(jí)種子液按3%接種于分別裝有2、3、4、5、6L基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中,37,300r/ m in下發(fā)酵,取第2天的發(fā)酵液測(cè)定酶活力,選取產(chǎn)生較大酶活的裝液量為最適裝液量。發(fā)酵生產(chǎn)納豆激酶的納豆枯草桿菌為好氧菌,通過(guò)調(diào)整發(fā)酵罐

9、中的裝液量來(lái)滿足菌種對(duì)氧氣的需要。由圖1可知,隨著裝液量的增加,產(chǎn)酶活性最大值呈現(xiàn)降低趨勢(shì),對(duì)試驗(yàn)結(jié)果用S AS912軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,經(jīng)過(guò)顯著性分析(Duncna法,3、4、5L的裝液量得到的酶活之間差異不顯著,低于2L裝液量時(shí)得到的酶活有顯著的差異。6L裝液量對(duì)應(yīng)得到的酶活最低。而2L的裝液量雖然在得到的酶活方面較高,但是,由于其設(shè)備的利用率過(guò)低,不適于工業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性要求,綜合考慮,選擇5L裝液量 。圖1裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響(注:圖中A、B、C表示在0105水平時(shí),不同裝液量所得結(jié)果間的差異顯著性213接種量對(duì)納豆激酶產(chǎn)量的影響在發(fā)酵過(guò)程中,微生物細(xì)胞的數(shù)量、狀態(tài)、代謝情況對(duì)產(chǎn)物的生物合

10、成有著重要的影響。因此對(duì)于納豆激酶發(fā)酵,適合的接種量才能達(dá)到較佳的產(chǎn)率。由圖2可知,接種量為3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)有利于納豆激酶的生成。接種量過(guò)小(1%、2%,在發(fā)酵體系中微生物調(diào)整期延長(zhǎng),整個(gè)發(fā)酵周期增加,細(xì)胞內(nèi)部的某些維生素和輔酶會(huì)向周?chē)鷶U(kuò)散,發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量低;菌體濃度大(4%、5%,微生物的適應(yīng)程度增加,生長(zhǎng)周期縮短,細(xì)胞活性高,產(chǎn)物的產(chǎn)量增加,但是菌體濃度過(guò)高,使得菌種繁殖過(guò)盛,發(fā)酵液黏度大,代謝途徑可能偏向生長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗過(guò)快,培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)生明顯的改變,有毒物質(zhì)積累,可能改變菌體的代謝途徑,不利于酶產(chǎn)物的合成 。圖2不同接種量的溶圈直徑(注:圖中A、B、C、D、E表示在0105水平時(shí)

11、,不同接種量所得結(jié)果間的差異顯著性214攪拌漿轉(zhuǎn)速的選擇將種子液按2%接種于裝有4L基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的10L發(fā)酵罐中,37,分別以200、300、400、500、600r/m in條件下發(fā)酵培養(yǎng),在第2天制取粗酶液測(cè)定酶活力,以確定攪拌漿轉(zhuǎn)速。發(fā)酵罐中攪拌槳的轉(zhuǎn)動(dòng),可以使空氣中的氧有效地溶解,利于好氧菌納豆枯草桿菌的生長(zhǎng)代謝。由圖3可知,400r/m in 為適宜攪拌槳轉(zhuǎn)數(shù)。 圖3不同攪拌槳轉(zhuǎn)數(shù)條件下的溶圈直徑(注:圖中A 、B 、C 、D 、E 表示在0105水平時(shí),不同接種量所得結(jié)果間的差異顯著性。 215發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的建立215111L 發(fā)酵罐中分批發(fā)酵的試驗(yàn)結(jié)果在1L 發(fā)酵罐內(nèi),納豆激

12、酶的發(fā)酵過(guò)程曲線如圖4所示。發(fā)酵條件為:攪拌速度400r/m in,通氣量3L /m in,培養(yǎng)溫度37,裝液量5L 。每隔5h 取樣,測(cè)定其納豆激酶活力、殘?zhí)橇?、菌體生物量。 圖4納豆激酶發(fā)酵進(jìn)程曲線分析圖4可知,在發(fā)酵前5h,納豆激酶發(fā)酵菌株處于生長(zhǎng)延遲期,此時(shí)產(chǎn)酶量及速率較低。10h 之后,菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,生長(zhǎng)速度逐漸加快,耗糖速率隨之迅速上升,45h 時(shí),進(jìn)入發(fā)酵中后期,此時(shí),耗糖速率有所下降,酶產(chǎn)量迅速提高。至菌體衰亡期,菌體濃度減小。耗糖速率減緩,酶產(chǎn)量呈下降趨勢(shì)。21512菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型根據(jù)納豆激酶分批發(fā)酵特點(diǎn),選用能很好反映分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)中因菌體濃度的增加對(duì)自身生長(zhǎng)起抑

13、制作用的Logistic 模型,來(lái)描述納豆激酶發(fā)酵過(guò)程中的菌體生長(zhǎng)情況,其形式為:d x d t =u max (1-xx max(1式中:u max -菌體最大比生長(zhǎng)速率(h -1;X -菌體濃度(g/L ;X max -穩(wěn)定期菌體濃度(g/L ;t 生長(zhǎng)時(shí)間(h 。對(duì)其積分后,得到代數(shù)形式,并利用DPS 軟件對(duì)方程用麥夸特法進(jìn)行單因變量模型參數(shù)估計(jì),并將得到的參數(shù)值代入生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型方程,得到菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型方程:x =1.63431-e 4.5578-0.444t(2由圖5擬合的結(jié)果可知,菌體生長(zhǎng)的試驗(yàn)值與模型的計(jì)算值非常吻合,擬合度為019807。因此可以確定Logistic 方程能

14、夠很好地描述10L 發(fā)酵罐中菌體生長(zhǎng)情況。圖5菌體生長(zhǎng)的試驗(yàn)值與模型計(jì)算值的比較21513納豆激酶形成動(dòng)力學(xué)模型由于發(fā)酵產(chǎn)物的生成速率與菌體生長(zhǎng)速率之間大致存在3種不同類(lèi)型的關(guān)聯(lián),分別是:(1產(chǎn)物生成速率與菌體生長(zhǎng)速率耦聯(lián);(2產(chǎn)物生成速率與菌體生長(zhǎng)速率部分耦聯(lián);(3產(chǎn)物生成速率與菌體生長(zhǎng)速率無(wú)關(guān)。采用經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚅uedeking 2Piret 方程可以全面的描述產(chǎn)物生成速率與菌體生長(zhǎng)速率的關(guān)系:d p d t =-d xd t+x(3當(dāng)0,=0時(shí),產(chǎn)物生成速率與菌體生長(zhǎng)速率耦聯(lián);當(dāng)0,0時(shí),產(chǎn)物生成速率與菌體生長(zhǎng)速率部分耦聯(lián);當(dāng)=0,0時(shí),產(chǎn)物生成速率與菌體生長(zhǎng)速率無(wú)關(guān)。將菌體生長(zhǎng)方程代入(3

15、式并積分得到產(chǎn)物隨時(shí)間變化的函數(shù),利用DPS 軟件對(duì)方程用麥夸特法進(jìn)行單因變量模型參數(shù)估計(jì),并將各參數(shù)值代入函數(shù)表達(dá)式,即得納豆激酶形成動(dòng)力學(xué)模型方程:P =698.8621+165.5684ln1.6283+0.0060e0.4444T1.6343+5.98811.6283+0.0060e0.4444t(4式中P -納豆激酶活力(I U /mL ;a -與菌體生長(zhǎng)相關(guān)的產(chǎn)物生成系數(shù)(u /mL ;-與菌體濃度相關(guān)的產(chǎn)物生成系數(shù)u /(mg h 。納豆激酶產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)模型方程中=18314266,=4510220均不為0,說(shuō)明納豆激酶合成與菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)關(guān)系屬于部分耦聯(lián)型。圖6為納豆激酶合

16、成的試驗(yàn)值與模型計(jì)算值間隨時(shí)間變化的曲線圖,其擬合度為018645。 圖6酶活的實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值的比較21514基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型底物消耗速率取決于菌體生長(zhǎng)速率、產(chǎn)物生成速率和底物維持能耗所消耗的速率。因此,底物消耗動(dòng)力學(xué)可采用Luedeking 2Piret 2like 方程模型來(lái)描述,即:-d x d t =y d xd t +x(5其中,=1y(6=m (7-d x d t =1Y d pd t (8-d xd t=m x (9式中,Y -產(chǎn)物得率系數(shù),即底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率;m -維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)所需能量的細(xì)胞維持系數(shù)。結(jié)合式(5-(9,通過(guò)發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)的消耗物料衡算,并對(duì)

17、整合后的算式積分,可得基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型方程的代數(shù)形式,代入利用DPS 軟件對(duì)方程用麥夸特法進(jìn)行單因變量模型參數(shù)估計(jì)所得到參數(shù),得基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)方程:s =2.4610+2.2412×10-12(-0.0060e0.4444t0.9963+0.0037e0.4444t -1-0.0997ln (0.09963+0.0036e0.4444t(10將基質(zhì)消耗實(shí)驗(yàn)值與模型的計(jì)算值做比較,結(jié)果如圖6所示,可以看出,該基質(zhì)消耗模型能很好地描述發(fā)酵過(guò)程基質(zhì)的消耗情況,預(yù)測(cè)生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)堑淖兓?擬合度為018662。圖7殘?zhí)堑膶?shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值的比較3結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在裝液量5L 、接種量3

18、%、攪拌槳400r/m in 條件下發(fā)酵酶活為476125I U /mL 。應(yīng)用優(yōu)化后發(fā)酵條件生產(chǎn)納豆激酶,并通過(guò)Lo 2gistic 模型、Luedking 2Piret 模型和Luedeking 2Piret 2like 模型來(lái)描述納豆激酶的生成,確定納豆激酶的發(fā)酵屬于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型。模型可以較好地解釋實(shí)際發(fā)酵中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成、底物消耗的動(dòng)力學(xué)規(guī)律,可用于進(jìn)一步設(shè)計(jì)大型發(fā)酵工藝。參考文獻(xiàn)1Yoshikatsu M ur ooka,M itsuo Ya m shit 1Traditi onal healthfulfer mented p r oducts of Japan J 1M ic

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21、 ogy ResearchCenter of Heil ongjiang Pr ovince,Daqing,Heil ongjiang163319,ChinaABSTRACTThe fer mentati on p r ocess of B acillus natto was studied in a102L batch syste m.The fer mentati on con2 diti ons including volu me of the mediu m,inoculati on quantity and r otati on s peed.Models were p r opos

22、ed with the Lo2 gistic equati on f or gr owth,the Luedking2Piret equati on f or natt okinase p r oducti on and Luedking2Piret2like equati on f or substrate consump ti on.The op ti m ized conditi ons were as f oll ows:liquid volume5L/10L,r otati on s peed400r/m in, 3%inoculu m.Under these conditi ons

23、 the activity of natt okinase was4476.25ur okinase units of each m illiliter br oth and the model has p r ovided a good descri p ti on of B acillus subtilis.Key wordsnatt okinase,liquid fer mentati on,op ti m izati on,kinetic行業(yè)動(dòng)態(tài)奇華頓公司推出更具“原汁原味”的雞肉香精世界領(lǐng)先的香精香料生產(chǎn)商奇華頓公司通過(guò)深入開(kāi)展Taste Essentials T M雞肉風(fēng)味研究項(xiàng)目

24、,開(kāi)發(fā)出更多風(fēng)味獨(dú)特的雞肉香精,幫助食品生產(chǎn)商制造出更為符合消費(fèi)者喜好的產(chǎn)品。奇華頓使用的新原料可以使雞肉香精更加接近原汁原味,尤其是那種“濃郁”的口感,恰到好處地捕捉了雞肉的鮮美。這些高質(zhì)量的新原料已經(jīng)使用在奇華頓部分雞肉香精產(chǎn)品中,能極大提升客戶的品牌和產(chǎn)品的價(jià)值,并且可以在雞湯、雞精、雞肉漢堡和雞塊等各種產(chǎn)品中得到很好的應(yīng)用。奇華頓種類(lèi)繁多的雞肉香精包含了一系列能夠滿足客戶和消費(fèi)者需求的高性能配料,具有貼近原味、味道濃郁、含鈉量低、無(wú)過(guò)敏原、純天然成分等特征。通過(guò)感官評(píng)定對(duì)消費(fèi)者需求的洞察,奇華頓公司不斷探尋新原料的開(kāi)發(fā),通過(guò)獨(dú)特的“香味語(yǔ)言”來(lái)協(xié)助奇華頓公司的創(chuàng)香團(tuán)隊(duì),幫助客戶判斷哪些香料組合更能滿足本地市場(chǎng)需要。為了更好地甄別香味中最受歡迎的香氣,奇華頓采用了創(chuàng)新工具和技術(shù),如獨(dú)具專(zhuān)利的VAS T M模擬芳香合成器和M ini VAS T