前列腺特異膜抗原及其變異體DNA檢測在臨床應(yīng)用初探

1、前列腺特異膜抗原及其變異體DNA檢測在臨床應(yīng)用初探    【關(guān)鍵詞】逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng); PSMA; 前列腺腫瘤;臨床應(yīng)用 Establishment of real time quantitative PCR to test PSMA and alternative spliced variant PSMA5 and exploration the application in the clinical YAN Hai-yan,XIE Wen-feng,ZENG Hua,et al.Clinical Laboratory,Standard Resear

2、ch Center for Clinical Laboratory,the Sun-Yat sen Memory Hospital of Sun-Yat sen University,Guang-zhou 510080,China 【Abstract】 Objective Explore the clinical application of PSMA and PSMA5 in the diagnosis of the prostatic carcinoma and prostate hyperplasia.Methods Using the quantitative RT-PCR metho

3、d built by ourselves to test the PSMA DNA in LNcap cells andthe peripheral blood cell of the prostate hyperplasia and prostate tumor patients.Results PSMA DNA in the peripheral blood cells of the prostate hyperplasia and prostate cancer patients were more than those of the normal ones.PSMA5 DNA in t

4、he peripheral blood cells of the prostate cancer patients were more than PSMA mRNA.Conclusion The difference of PSMA and PSMA5 DNAin the peripheral blood cells showed that PSMA5 is more specific as a prostate tumor maker.Give us a new research wayto use the PSMA as a prostate tumor marker. 【Key word

5、s】RT-PCR; PSMA; Prostate tumor;Application in clinical 前列腺特異性膜抗原PSMA是前列腺腺上皮細(xì)胞膜上的一種2型跨膜蛋白1。近年來對PSMA的研究發(fā)現(xiàn)其作為前列腺癌的生物標(biāo)志物比PSA更具有組織特異性,已成為前列腺癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。而其變異體的發(fā)現(xiàn)為前列腺癌的研究又提供了新的研究方向和思路,PSMA5是本課題組發(fā)現(xiàn)的PSMA的變異體2并建立了一種能區(qū)分PSMA和PSMA5DNA的實(shí)時熒光定量PCR分析方法。為了解和研究PSMA和PSMA5DNA檢測的臨床應(yīng)用價值,我們通過該法對在前列腺增生及前列腺癌患者的外周血中的PSMA及PSMA5DA

6、N進(jìn)行定量分析和研究,對其在前列腺癌及增生疾病的診療中的應(yīng)用作一初步探索。 1 資料和方法 1.1 一般資料 經(jīng)證實(shí)表達(dá)PSAM的前列腺癌LNCap細(xì)胞株(為本課題組保存)。10例正常前列腺組織標(biāo)本取自健康人被剝奪生命者。 1.1.1 標(biāo)本的采集與保存 10例正常外周血標(biāo)本取自健康體檢者,均為男性,年齡范圍2355歲,平均(34±12)歲。血液標(biāo)本采用內(nèi)有2030 u/ml濃度的肝素抗凝的一次性真空抽血管,抽取患者空腹全血3 ml,于3 h內(nèi)分離單個核細(xì)胞,采用常規(guī)的單個核細(xì)胞分離方法,置于無RNase的EP管內(nèi),然后放-80冰箱保存。 同時離心分離血漿標(biāo)本,也是置于無RNase的E

7、P管內(nèi),然后放-80冰箱保存。 前列腺癌病例一共8例,年齡范圍5676歲,62±8歲 ;前列腺增生病例共3例,年齡范圍6672歲。 1.1.2 主要試劑與儀器 RT-PCR 試劑盒(invitrogen 公司),PC3.0-T 質(zhì)粒(TaKaRa 公司),Trizol(Sangon 公司),Opticon2 熒光定量PCR 儀(美國MJ 公司),SYBERGREEN熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)。2kb DNA Marker(鼎國生物公司)。 1.2 方法 1.2.1 引物設(shè)計和反應(yīng)體系 按照Israeli等發(fā)表的人PSMA的cDNA全序列(Genbank登錄號M99487

8、)和我室新發(fā)現(xiàn)的PSMA變異體PSMA5(提交序列號:PSM-E,Genbank登錄號EF488811)的序列,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物。PT上游引物5'-TACCACATTTAGCAGGAACAGAAC-3',下游引物5'-AACCATCTGGATAGGACTTCACC-3',擬擴(kuò)增片段長度498bp,PCR參數(shù)為:95.02 min(94.0 30 s,60.0 30 s,72.040 s)×4172.02 min4保溫;P上游引物5'-GAGCTCGGATCCGAGATGTG-3',下游引物5'-

9、ATTTTATAAACCACCCGAAG-3',擬擴(kuò)增片段長度146bp,PCR參數(shù)為:95.0 2 min(94.0 30 s,58.0 30 s,72.040 s)×4172.02 min4保溫;P5上游引物5'-GCCAACTGCAAGGTCTAATG-3',下游引物5'-CCTGCTAAATGTGGTATCTGTG-3',擬擴(kuò)增片段長度225bp;PCR參數(shù)為:95.0 2 min(94.0 30 s,54.0 30 s,72.0 40 s)× 4172.0 2 min4保溫,G上游引物5'-GAAGGTCGGAGTC

10、AACGGATT-3',下游引物5'-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3',擬擴(kuò)增片段長度223bp,PCR參數(shù):95.02 min(94.030 s,60.0 30 s,72.040 s)× 4172.02 min4保溫。所有引物均由Invitrogen公司合成。        1.2.3 反應(yīng)體系 cDNA 1 l,H2O 8 l,Forward primer(50M)0.2 l,Reverse primer(50M)0.2 l,MASTER MIX(2X)10 l

11、,總的反應(yīng)體系共20 l。其中試劑盒配套MASTER MIX(2X)是各種試劑的混合液,其中包括RNase Free dH2O、Buffer、各種酶等。 1.2.4 樣品檢測 每次檢測均加入一空白管作一陰性對照,每個樣品通過PCR 反應(yīng)得到各自的Ct 值,樣品測得Ct 值后,儀器自動繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線并給出初始拷貝數(shù)。 2 結(jié)果 PT、P及P53對引物在外周血細(xì)胞和血漿中對PSMA總、PSMA和PSMA5 DNA的定量擴(kuò)增結(jié)果,見下表。 表1 PT、P及P5在外周血細(xì)胞和血漿中對PSMA總、PSMA和PSMA5 DNA的定量擴(kuò)增結(jié)果(×106copies/g) PSMA總DNAPSMA D

12、NAPSMA5 DNA 血細(xì)胞血漿血細(xì)胞血漿血細(xì)胞血漿 前列腺癌1.32±0.5602.15±1.3302993.65±2112.10 前列腺增生0.279±0.22010.9±3.45000 正常對照0.3±0.1200.3±0.1800.1±0.090 3 討論 實(shí)驗(yàn)過程中我們用PT、P及P5這三對引物分別對前列腺癌LNCap細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)。三種引物各自的擴(kuò)增產(chǎn)物長度經(jīng)電泳證明,分別與設(shè)計引物時所預(yù)測的長度相吻合;內(nèi)參GAPDH也能很好的從LNCap細(xì)胞上擴(kuò)增出來,而陰性對照蒸餾水經(jīng)定量PCR是沒有擴(kuò)

13、增產(chǎn)物的3。該結(jié)果表明該方法符合我們設(shè)計初衷。 已往的研究認(rèn)為PSMA是前列腺癌較好的腫瘤相關(guān)抗原,它在正常、增生、原發(fā)性前列腺癌及其轉(zhuǎn)移灶中以及腫瘤新生血管中均有表達(dá),且高水平的PSMA表達(dá)與腫瘤的侵襲力有關(guān)4。我們在研究中發(fā)現(xiàn)PSMA與PSMA5在正常前列腺組織中的平均表達(dá)量為0.94×103copies/l和0.4×103copies/l。在增生前列腺組織中PSMA和PSMA5的平均表達(dá)量為2.22×103copies/l和10.87×103copies/l。PSMA5 DNA在多個病例組織中被檢測到,證實(shí)了該變異體的存在不是個別的基因突變現(xiàn)象,而

14、是一個廣泛存在的基因調(diào)控的可變剪接結(jié)果5。此外,正常組織與病變前列腺組織中PSMA5 DNA的檢測結(jié)果具有明顯差異,與PSMA不同,后者在所有前列腺上皮組織中均有檢測。提示PSMA5具有更高的前列腺病變組織特異性,與前列腺組織的病變密切相關(guān)。在臨床上具有輔助診斷的應(yīng)用價值,有望成為前列腺癌生物治療的靶點(diǎn)。本研究首次將PSMA5的定量分析引入前列腺癌的診斷研究,發(fā)現(xiàn)其有著優(yōu)于PSMA的組織特異性和病變特異性,但兩者作為前列腺癌的生物學(xué)標(biāo)志物,如能將其綜合互補(bǔ)應(yīng)用在臨床診斷前列腺癌,相信將大大提高前列腺癌的檢出率及正確率。同時,此方法相對于病理學(xué)診斷具有無創(chuàng)、快速、簡便、易標(biāo)化等優(yōu)點(diǎn),更適于在定量

15、水平對患者進(jìn)行動態(tài)的觀察,對術(shù)后隨訪及療效評價都是一個有益的探索。 參考文獻(xiàn) 1 Cao KY,Mao XP,Wang DH,et al.High expression of PSM-E correlated with tumor grade in prostate cancer:a new alternatively spliced variant of prostate-specific membrane antigen.Prostate,2007,67(16):1791-1800. 2 曹開源,戴淑琴,肖娜,等.新型前列腺特異膜抗原剪接變異體的發(fā)現(xiàn)及臨床意義探討.中國病理生理雜志,200

16、6,22(11):2185-2188. 3 Neves AF,Araújo TG,Biase WK,et al.Combined analysis of multiple mRNA markers by RT-PCR assay for prostate cancer diagnosis.Clin Biochem,2008,41(14-15):1191-1198. 4 Tang QL,Yao MY.Updated application of prostate-specific membrane antigen to the diagnosis and treatment of prostate cancer.Zhonghua Nan Ke