外源性結(jié)締組織生長因子對人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞外基質(zhì)合

1、外源性結(jié)締組織生長因子對人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用    【摘要】  目的： 探討外源性結(jié)締組織生長因子（CTGF）在人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及細(xì)胞外基質(zhì)合成中的作用. 方法： 將體外培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞HK2分為三組：對照組；CTGF小劑量組（終濃度為2.5 g/L）；CTGF大劑量組（終濃度為20 g/L）. 用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；噻唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞增殖活性；RT?PCR檢測HK2細(xì)胞E?哺起鞍祝?E?cadherin），?財交?肌肌動蛋白（?SMA），纖連蛋白（FN）和膠原mRNA水平的變化；免疫組織化

2、學(xué)方法觀察HK2細(xì)胞FN和膠原的表達(dá). 結(jié)果： CTGF刺激使HK2 細(xì)胞由橢圓形變?yōu)樗笮危瑫r促進(jìn)HK2細(xì)胞增殖. 不同濃度的CTGF作用于HK2細(xì)胞48 h后，?SMA 和FN mRNA水平顯著升高（P<0.05），E?哺起鞍?mRNA的表達(dá)顯著下降（P<0.05）；大劑量CTGF刺激HK2細(xì)胞48 h后膠原mRNA水平顯著升高（P<0.05）. 小劑量CTGF組HK2 細(xì)胞胞質(zhì)FN表達(dá)水平顯著增加（P<0.05），大劑量CTGF組HK2細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)FN和膠原均顯著增加（P<0.05）. 結(jié)論： CTGF在體外能夠誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，并促進(jìn)FN的合成，

3、大劑量的CTGF可以增加其膠原的合成. 【關(guān)鍵詞】  結(jié)締組織生長因子；腎小管；上皮細(xì)胞；轉(zhuǎn)分化；細(xì)胞外基質(zhì)大量證據(jù)表明，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為間充質(zhì)細(xì)胞（epithelial?myofibroblast transdifferentiation, EMT）是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生機(jī)制之一1. 結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor, CTGF）是近年來發(fā)現(xiàn)與腎纖維化密切相關(guān)的細(xì)胞因子. 在新月體腎小球腎炎，IgA腎病，局灶性節(jié)段性腎小球硬化以及糖尿病腎病的腎活檢標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)CTGF表達(dá)增高，多種腎纖維化動物模型也證實(shí)存在CTGF表達(dá)上調(diào)2. 目前較

4、多研究證實(shí)，CTGF作為轉(zhuǎn)化生長因子（TGF?撥攏鬧饕?下游因子，參與了EMT的發(fā)生與發(fā)展，但有關(guān)CTGF對腎小管上皮細(xì)胞直接作用的機(jī)制仍不十分明確. 本研究我們探討外源性CTGF能否誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化及對細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用.1材料和方法1.1材料細(xì)胞： 正常人腎小管上皮細(xì)胞（HK2）購自中國武漢典型培養(yǎng)物保藏中心. 主要試劑：重組人CTGF蛋白（rhCTGF, peprotech），DMEM/F12培養(yǎng)基，HEPES(Gibcol),胎牛血清（杭州四季青公司）；RNA抽提試劑TRIzol（Invitrogen），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（promega）,Taq酶，DNA maker(Ta

5、KaRa ),羊抗人膠原pAb（1200，Santa Cruz）,小鼠抗人FN  mAb（1200，NeoMarkers），HRP標(biāo)記兔抗羊二抗，HRP標(biāo)記兔抗小鼠二抗，（1200），DAB顯色液（武漢博士德公司）；MTT（美國Sigma公司）；圖像分析處理系統(tǒng)（美國UVP公司）；聚合酶鏈反應(yīng)引物：均由Invitrogen公司合成 (表1). 表1引物序列（略）1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組將HK2細(xì)胞用含100 mL/L FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37，50 mL/L CO2 . 0.5 g/L胰酶0.2 g/L EDTA消化細(xì)胞后，1×108

6、/L細(xì)胞接種于50 mL塑料培養(yǎng)瓶. 先以100 mL/L FBS?DMEM/F12培養(yǎng)細(xì)胞，70%80融合時改用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長同步化. 棄去培養(yǎng)液，將HK2細(xì)胞分為三組. 對照組：加無血清DMEM/F12培養(yǎng)液；小劑量CTGF組：在無血清DMEM/F12培養(yǎng)液中加入CTGF（終濃度為2.5 g/L）；大劑量CTGF組：在無血清DMEM/F12培養(yǎng)液中加入CTGF（終濃度為20 g/L）. 每組設(shè)3個復(fù)瓶，作用48 h后收集細(xì)胞.1.2.2HK2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察加入各組試劑后，每6 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，48 h后倒置顯微鏡下照相.1.2.3MTT法將HK2細(xì)胞

7、制成懸液，按1×108/L接種于96孔板中，細(xì)胞分組同前，每組設(shè)6個復(fù)孔，刺激48 h后MTT比色法測定細(xì)胞增殖，以每孔A490 nm處吸光度（A）值表示.1.2.4RTPCR加入CTGF 48 h后，按照TRIzol說明書在培養(yǎng)瓶中提取總的RNA，經(jīng)紫外分光光度計鑒定，取總RNA2 g作逆轉(zhuǎn)錄，試驗步驟參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行. 取1 L逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng). GAPDH 反應(yīng)參數(shù)如下：預(yù)變性94 5 min,變性94 30 s，退火54. E?哺起鞍祝?E?cadherin）和纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）退火59，?SMA和膠原退火63, 

8、 40 s，延伸72 30 s，28個循環(huán)（E?cadherin，F(xiàn)N，?SMA和膠原  32個循環(huán)）后，72延伸7 min. 取PCR產(chǎn)物5 L在10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)成像后，用圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描，以密度代表其表達(dá)量. 用GAPDH量校正，計算出E?cadherin，?SMA，F(xiàn)N和膠原的相對表達(dá)量3. 重復(fù)3次獨(dú)立的RT?PCR全過程.1.2.5免疫組織化學(xué)細(xì)胞爬片制作： 將HK2細(xì)胞制成懸液，按1×108/L接種于置有波片的6孔板中，培養(yǎng)條件、細(xì)胞分組和處理方法同前，48 h后收集波片. 免疫組化染色：波片冰丙酮固定, Triton X?

9、100孵育，0.3 mL/L雙氧水孵育，兔血清37封閉，加一抗，二抗，SABC液孵育，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，PBS代替一抗做陰性對照. 結(jié)果判定： 以細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，采用捷達(dá)病理圖像分析軟件分析，各組細(xì)胞爬片隨機(jī)取6個視野，分別測定其平均吸光度（A）值.統(tǒng)計學(xué)處理： 所有數(shù)據(jù)由SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)以x±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，Dunne?t檢驗和非參數(shù)秩和檢驗. P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果2.1CTGF對HK2細(xì)胞形態(tài)的影響倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，正常HK2 細(xì)胞為橢圓形貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入CTGF

10、（2.5 g/L）48 h后，可見HK2細(xì)胞由橢圓形變?yōu)殚L梭形. 增加培養(yǎng)液中CTGF濃度（20 g/L），細(xì)胞形態(tài)的梭形化更加明顯.2.2CTGF對HK2細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示，每孔A490 nm處吸光度（A）值對照組為0.236±0.026；小劑量CTGF組為0.289±0.033；大劑量CTGF組為0.314±0.046. 與對照組比較結(jié)果顯示，不同劑量CTGF均可促進(jìn)細(xì)胞增殖（P<0.05）.2.3CTGF對HK2細(xì)胞Ecadherin和SMA mRNA水平的影響RTPCR結(jié)果顯示，正常HK2細(xì)胞表達(dá)Ecadherin，不表達(dá)?SMA. CTGF（2

11、.5, 20 g/L）刺激48 h后，Ecadherin mRNA的表達(dá)較對照組下降（P<0.05），SMA mRNA的表達(dá)較對照組提高（P<0.05，圖1）.2.4CTGF對HK2細(xì)胞FN和膠原mRNA水平的影響RT?PCR結(jié)果顯示，正常HK2細(xì)胞少量表達(dá)FN和膠原. CTGF（2.5, 20 g/L）刺激48 h后，F(xiàn)N mRNA的表達(dá)較對照組增加（P<0.05）. 小劑量CTGF組作用48 h后，膠原  mRNA的表達(dá)較對照組無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；大劑量CTGF組刺激48 h后，膠原  mRNA的表達(dá)較對照組顯著增加（P<0.05

12、，圖2）.2.5CTGF對HK2細(xì)胞胞質(zhì)FN和膠原表達(dá)的影響免疫組化結(jié)果顯示，與對照組比較，小劑量的CTGF可以提高HK2細(xì)胞胞質(zhì)FN的表達(dá)；增加CTGF的濃度，HK2細(xì)胞胞質(zhì)FN的表達(dá)量增加更多（P<0.05）. 小劑量CTGF組作用48 h后，HK2細(xì)胞胞質(zhì)膠原的蛋白表達(dá)較對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；大劑量CTGF組刺激48 h后，HK2細(xì)胞胞質(zhì)膠原 的蛋白表達(dá)較對照組增加（P<0.05，表2）. 表2CTGF對HK2細(xì)胞胞質(zhì)FN和膠原的表達(dá)(略）百事通 3討論自Strutz等4于1995年首先證實(shí)腎小管上皮細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞，以后稱為EMT，EMT在腎間

13、質(zhì)纖維化中的作用日益受到人們的關(guān)注. 目前研究顯示，有超過三分之一的肌成纖維細(xì)胞起源于腎小管上皮細(xì)胞1. EMT主要包括四個關(guān)鍵步驟:上皮黏附特性消失，?SMA表達(dá)和肌動蛋白重組，突破基底膜，細(xì)胞遷徙和侵襲增強(qiáng)5. Ecadherin是細(xì)胞間黏附蛋白，維持上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性和上皮極性，喪失E?cadherin會引起上皮細(xì)胞間緊密連接消失，細(xì)胞失去極性. ? SMA 是平滑肌的標(biāo)志蛋白,同時也是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白,現(xiàn)被普遍用于檢測腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化. 正常HK2  細(xì)胞表達(dá)E?cadherin，不表達(dá)?SMA. 肌成纖維細(xì)胞同時具有成纖維細(xì)胞和肌細(xì)胞

14、的特性，表達(dá)?SMA6. 我們的研究發(fā)現(xiàn)，CTGF能夠使培養(yǎng)的正常HK2細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞由橢圓變?yōu)殚L梭形，類似成纖維細(xì)胞形態(tài). 提示細(xì)胞骨架構(gòu)成發(fā)生改變. 研究也發(fā)現(xiàn)CTGF可以顯著提高HK2細(xì)胞的增殖活性. RT?PCR結(jié)果提示，對照組HK2細(xì)胞表達(dá)E?cadherin，幾乎不表達(dá)?SMA. CTGF作用于正常HK2細(xì)胞，能夠顯著降低E?cadherin mRNA的表達(dá)，提高?SMA mRNA的表達(dá). 這表明HK2細(xì)胞在CTGF作用下可能由上皮細(xì)胞表型向肌成纖維細(xì)胞表型發(fā)生轉(zhuǎn)變.細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)的過度沉積是引起腎間質(zhì)纖維化的主要原因7. FN和型膠原在間質(zhì)的表達(dá)增多是腎間質(zhì)纖維化的

15、主要病理變化. 型膠原不僅作為ECM的重要組成部分，同時能夠通過穩(wěn)定間充質(zhì)細(xì)胞的表型，進(jìn)一步促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展. 本研究中我們發(fā)現(xiàn)，不同濃度的CTGF可以顯著增加HK2細(xì)胞FN 基因的轉(zhuǎn)錄. 小劑量CTGF不能增加HK2細(xì)胞型膠原基因的轉(zhuǎn)錄. 大劑量CTGF刺激HK2細(xì)胞，型膠原基因的轉(zhuǎn)錄較對照組顯著提高. 免疫組化結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)CTGF可以提高HK2 細(xì)胞胞質(zhì)FN蛋白的表達(dá)，大劑量CTGF能夠增加HK2細(xì)胞胞質(zhì)型膠原蛋白的表達(dá). Qi等8在人近端小管上皮細(xì)胞，使用CTGF  20 g/L刺激48 h，能夠增加FN蛋白的表達(dá)，輕度增加型膠原的表達(dá). 張春等9的研究顯示CTGF可

16、以促進(jìn)人近曲小管上皮細(xì)胞分泌FN. Wang等10使用CTGF 1 g/L刺激小鼠近端小管上皮細(xì)胞48 h，型膠原的基因轉(zhuǎn)錄較對照組無顯著變化. 這些研究與本實(shí)驗結(jié)果相似. 我們研究發(fā)現(xiàn)CTGF 20 g/L刺激HK2細(xì)胞48 h，可以增加型膠原的表達(dá)，其與小劑量CTGF作用結(jié)果不同，考慮是由于CTGF劑量差異所致.綜上，CTGF可能通過誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，增加FN的合成，大劑量的CTGF可以增加其膠原的合成，參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展. 因此阻斷CTGF表達(dá)或者抑止其活性可能是更為有效的防治纖維化的手段.【參考文獻(xiàn)】  1Kalluri R, Neilson EG. Epit

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