凋亡相關基因在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達意義

1、凋亡相關基因在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達意義【摘要】 目的：分析凋亡相關基因p 53和bcl- 2在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達，分析其關系及臨床意義。 方法：免疫組化法檢測51例眼眶腺樣囊性癌臨床標本和10例正常眼眶組織中P53和Bcl-2蛋白的表達狀況。 結果：P53和Bcl-2在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達陽性率分別為53%和 65%，顯著高于眼眶正常組織（53%,65%vs 10%，P0.01）。實性型腺樣囊性癌中P53的表達率顯著高于其在腺樣-管狀型中的表達率（86% vs 30%，P0.01）；P53和Bcl-2在復發(fā)組中的表達率顯著高于其在初發(fā)組中的表達率（85% vs 42%，P0

2、.01），（100% vs 53%，P0.01）；P53和Bcl-2二者在表達上具有相關性（ 21.461，P0.05）。結論：P53和Bcl-2蛋白的檢測對于判斷腫瘤對化療的敏感性和預后有參考價值。【關鍵詞】 眼眶腺樣囊性癌 凋亡相關基因 耐藥0引言腺樣囊性癌（adenoid cystic carcinoma, ACC）是一種高度惡性的上皮性腫瘤，可發(fā)生于全身各部位，如涎腺、頜下腺、氣管、肺、乳腺、皮膚等，于眼眶則好發(fā)于淚腺1。我們通過檢測眼眶腺樣囊性癌中凋亡相關基因的表達情況，了解并分析凋亡相關基因p 53和bcl- 2在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達與組織學分型和預后的關系及臨床意義。我們采

3、用的基因檢測方法是蛋白質(zhì)水平的免疫組織化學法，它是把血清學方法和顯微示蹤技術結合起來的一類技術，簡便易行,容易掌握，具有較高的抗原抗體反應的特異性和靈敏性，可以對組織細胞的成分準確定位和定量分析。1材料和方法1.1材料 免疫組化染色試劑盒（HistostainTM-Plus Kits）（SP-9000），鼠抗人P53 mAb（DO-7）(ZM-0408)，鼠抗人Bcl-2 mAb（Bcl-2-100）(ZM-0010),濃縮型DAB試劑盒（ZLI-9032）,磷酸鹽緩沖液（PBS）（配成0.01mol/L，1 000 mL，pH7.27.4）(ZLI-9061)。天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院眼科病理室

4、1992/2003年手術或活檢后經(jīng)病理組織學確診的眼眶腺樣囊性癌標本共51例，男22例，女29例，右眶20例，左眶31例。年齡1962歲，初發(fā)38例，術后復發(fā)13例。按組織學分型：腺樣-管狀型30例，實性型21例。全部標本經(jīng)40g/L甲醛固定，石蠟包埋，5連續(xù)切片，作病理組織學及免疫組化使用。對照組10例，取自相同時期眼眶內(nèi)良性腫瘤手術中同時取出的眶內(nèi)正常組織（脂肪、結締組織、淚腺等），標本處理方法同實驗組。1.2方法 采用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素（streptavidin peroxidase, SP）染色試劑盒。以已知陽性的切片做陽性對照，以PBS代替一抗作空白對照。Bcl-2的陽性產(chǎn)物

5、應定位于細胞膜和/或細胞質(zhì)，P53的陽性產(chǎn)物應定位于細胞核，呈棕黃色細小顆粒狀。以高倍鏡下（400）陽性細胞占腫瘤細胞的百分比為陽性判斷標準：0級：無著色；1級：陽性細胞占腫瘤細胞數(shù)10；2級：陽性細胞占腫瘤細胞數(shù)1050；3級：陽性細胞占腫瘤細胞數(shù)50。以01級為陰性（-），23級為陽性（ ）（本判斷標準由北京中杉金橋生物技術有限公司提供）。統(tǒng)計學處理：SPSS統(tǒng)計軟件包（Ver10.0），方法采用 2檢驗，顯著性水準為0.05。2結果2.1凋亡相關基因在眼眶腺樣囊性癌中的表達 研究結果顯示，P53和Bcl-2在眼眶腺樣囊性癌中均有不同程度的表達。P53的陽性染色為棕黃色，位于細胞質(zhì)和胞核，

6、胞核呈均勻明顯著色，且染色強度高于細胞質(zhì)。Bcl-2的陽性染色均勻分布于細胞膜和胞質(zhì)。眼眶腺樣囊性癌標本中27例P53表達陽性，陽性率53%，正常組織標本中1例表達陽性，陽性率10%，P53在眼眶腺樣囊性癌組織中的表達率顯著高于眼眶正常組織(27.128，P0.01）。腺樣囊性癌標本中33例Bcl-2表達陽性，陽性率64.7%，正常組織標本中1例表達陽性，陽性率10%，Bcl-2在腺樣囊性癌組織中的表達率顯著高于眼眶正常組織(211.034，P0.01）。2.2 P53和Bcl-2的表達與癌組織學分型的關系 P53在實性型腺樣囊性癌中18例表達陽性，陽性率86%，在腺樣?管狀型中9例表達陽性，

7、陽性率30%，P53在實性型中的陽性表達率較腺樣管狀型明顯增高，二率比較有顯著性差異(216.648，P0.01）。Bcl-2在實性型中15例表達陽性，陽性率71%，在腺樣管狀型中18例表達陽性，陽性率60.0%，二率比較無顯著性差異( 20.715，P0.01)。2.3 P53和Bcl-2的表達與癌初發(fā)與復發(fā)的關系 P53在復發(fā)組病例中11例表達陽性，陽性率85%，在初發(fā)組病例中16例表達陽性，陽性率42%，在復發(fā)組中陽性率明顯增高，二率比較有顯著性差異(2=7.634，P 0.01)。Bcl-2在復發(fā)組病例中13例表達陽性，陽性率100%，在初發(fā)組病例中20例表達陽性，陽性率53%，在復發(fā)

8、組中陽性率明顯增高，二率比較有顯著性差異(2=13.649，P 0.05)。3討論原發(fā)于眼眶的淚腺腺樣囊性癌是淚腺惡性上皮性腫瘤中最常見的，也是惡性度最高的腫瘤1,2，其發(fā)生率在淚腺腫瘤中僅次于淚腺多形性腺瘤居第2位。根據(jù)我科對歷年診治眼眶腫瘤的統(tǒng)計情況，腺樣囊性癌占上皮性腫瘤的19.2%，占淚腺惡性上皮性腫瘤的41.7%3,4。其發(fā)病年齡小于其他淚腺惡性腫瘤，30歲以下患者占一定比例，這在其他淚腺惡性腫瘤中是非常少見的。腺樣囊性癌病程較短，多在6mo以內(nèi)，主要臨床表現(xiàn)為眼球突出、移位和眶部腫塊。與其他淚腺腫瘤不同的是其疼痛的發(fā)生率可高達79%，自發(fā)痛和觸痛均存在，這是因為該腫瘤具有嗜神經(jīng)性，

9、腫瘤細胞易侵犯神經(jīng)，且沿神經(jīng)束蔓延，引起局部疼痛。影像學檢查除發(fā)現(xiàn)淚腺區(qū)不規(guī)則腫物外，常見臨近骨質(zhì)有蟲蝕樣破壞。腫瘤易向顱內(nèi)和鼻竇等部位擴散，或侵入周圍血管內(nèi)，形成瘤栓并經(jīng)血行遠處轉移。腺樣囊性癌雖然生長較為緩慢，但侵襲性強，浸潤的范圍往往超出手術時肉眼看到的腫瘤范圍，因此復發(fā)率和病死率均較高，我科統(tǒng)計復發(fā)率為77.4%，陳耀真等報道病死率為44.4%。腺樣囊性癌的大體標本為灰白色實體腫塊，表面有結節(jié)，無包膜或包膜不完整，常侵犯周圍組織，切面呈灰白或微黃色，可伴有出血或壞死，呈小囊樣改變，質(zhì)脆。鏡下腺樣囊性癌主要由導管上皮細胞和肌上皮細胞構成，群集成巢或條索狀，核深染而胞漿較少的小圓細胞構成。

10、根據(jù)目前采用的Perzin分類法5，可分為3型：腺樣型，又稱篩狀型,癌巢中有許多大小不等呈篩孔狀的囊樣腔隙，囊樣間隙多由肌上皮細胞圍繞，其內(nèi)充滿嗜堿性粘蛋白；管狀型：癌細胞排列成細長管狀結構，由二、三層上皮細胞圍繞而成，內(nèi)層為導管上皮，外層為肌上皮細胞，腔內(nèi)可有嗜伊紅分泌物；實性型：腫瘤細胞排列緊密呈團塊樣，形成圓形或不規(guī)則形實性癌巢，中間有纖維間隔，其內(nèi)可有少量腔隙，較大的團塊內(nèi)可出現(xiàn)壞死。由于腺樣型和管狀型結構常在同一腫瘤中同時出現(xiàn)，故又將其合并成腺樣-管狀型。一般認為腺樣-管狀型預后較好，實體型預后較差。目前對腺樣囊性癌的治療方法仍以手術為主。目前常用的手術方法是擴大的局部切除術，即手術

11、切除可見的腫瘤組織連同周圍的一部分正常組織，盡可能清除腫瘤細胞，術后再輔以放療或化療。隨著綜合治療理念的逐漸深入，從術后的輔助化療消滅手術后的殘余腫瘤細胞和微小轉移灶，到術前新輔助化療的術前“減瘤作用”，化療在腺樣囊性癌的治療中占踞了愈來愈重要的地位6。國內(nèi)外目前有報道用于腺樣囊性癌化療的方案很多,關于療效的說法也多有不一致之處，其中腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥是導致化療失敗的重要原因。多數(shù)化療藥物是通過誘導腫瘤細胞發(fā)生程序性死亡，即凋亡來達到治療目的的，反之，腫瘤細胞也可通過逃逸凋亡或拮抗凋亡獲得生存，即產(chǎn)生多藥耐藥7。細胞凋亡抑制可能是腫瘤細胞耐藥的一種標記，而且與細胞凋亡有關的因子在多藥耐

12、藥形成中起一定作用。近年研究已發(fā)現(xiàn)了一些與細胞凋亡抑制有關的癌基因(如bcl-2，突變的p53，F(xiàn)as/Ap101，Cmyc，raf-1，bcl/abl，cerbB-2/neu，NF-KB)的表達產(chǎn)物可阻斷或阻礙多種因素誘導的細胞凋亡，使細胞產(chǎn)生耐藥性。bcl-2是最重要的抑制細胞凋亡的基因，定位于18q21，但在多數(shù)腫瘤患者中，可發(fā)生染色體t（14；18）易位，使bcl-2基因位于14q32，接近Ig重鏈的轉錄增強子，導致bcl-2的高度表達。bcl-2基因的編碼產(chǎn)物為26ku的蛋白質(zhì)（P26-Bcl-2）,常位于核膜、線粒體膜和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，bcl-2基因的高水平表達與多種化療藥物誘導的

13、細胞凋亡受抑制顯著相關。bcl-2過度表達時，可能通過調(diào)節(jié)抗氧化途徑，作用于細胞凋亡過程，使細胞死亡率下降，對抗化療藥物的作用8。p53基因定位于17p13.1，在人類腫瘤發(fā)生中起著至關重要的作用，而且最易發(fā)生改變。野生型P53對維持細胞正常生長，抑制惡性增殖過程中有著重要作用，其所表達的蛋白產(chǎn)物半衰期較短，無法用免疫組化染色法檢測到。突變型p53基因的蛋白產(chǎn)物半衰期明顯延長，容易被檢測到。所以如果用免疫組化法在癌組織中檢測到P53蛋白的表達，則可以認為有p53基因的突變9。p53基因狀態(tài)與腫瘤細胞對于放療和化療的敏感性有關，目前研究認為，野生型p53有DNA復制啟動功能，當細胞在放、化療作用

14、下，DNA不能修復為正常狀態(tài)時，p53將誘發(fā)細胞凋亡，這種機制可抑制細胞增殖，并增強其對放、化療的敏感性，突變型p53基因則失去了這種細胞調(diào)節(jié)功能。p53基因的異常和P53蛋白的過度表達在很多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，Kopnin等10的研究表明，p53基因?qū)drl基因的啟動因子有調(diào)節(jié)作用，野生型p53能夠抑制mdrl轉錄，減少耐藥糖蛋白P170的生成，而突變型p53可增強mdrl基因的表達和P170的生成，P170具有藥泵作用，能夠逆濃度差將進入細胞內(nèi)的化療藥物排出細胞外，從而保護腫瘤細胞免受攻擊，導致腫瘤產(chǎn)生多耐藥性，造成化療失敗，這是許多腫瘤對化療不敏感的重要原因之一。目前國

15、內(nèi)外均有關于涎腺腺樣囊性癌中突變型P53和Bcl-2蛋白表達情況的研究報道，Papadaki等11在對涎腺腺樣囊性癌P53的表達的研究中發(fā)現(xiàn)，復發(fā)性ACC中突變型P53的表達高于初發(fā)人群，且與預后密切相關。其它對涎腺ACC中P53和Bcl-2表達情況的研究也表明12，二者在腫瘤中均存在過表達，且復發(fā)病例的表達率增高。目前尚未見對眼眶腺樣囊性癌中的P53和Bcl-2表達情況進行研究的報道。本實驗結果表明，突變型P53和Bcl-2蛋白在眼眶腺樣囊性癌中的表達率均顯著高于眼眶正常組織，表明眼眶ACC組織中存在著較為廣泛的p53突變和較高的bcl -2表達，二者的共同作用使腫瘤細胞的凋亡過程受到抑制，

16、腫瘤對化療藥物的抗藥性增加。P53在實性型ACC中的表達率為86%，明顯高于在腺樣-管狀型ACC中的表達率30%，表明實性型ACC細胞有較強的拮抗凋亡作用，對化療藥物抗藥性更高，因而預后較差。復發(fā)組突變型P53和Bcl-2蛋白的表達率均顯著高于初發(fā)組，提示復發(fā)性ACC的細胞凋亡過程受到抑制，對化療藥物反應性差，化療效果不佳。p 53和bcl- 2同屬凋亡相關基因，二者相互聯(lián)系，相互制約。眼眶ACC中P53和Bcl-2的表達具有正相關性，與它們共同在細胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮作用有關，其機制可能為13：野生型P53通過bcl-2家族調(diào)控凋亡，p 53激活bax靶基因，使其mRNA和蛋白的表達均升高，形成

17、Bax-Bax同源二聚體，使Bcl-2蛋白失活，誘導細胞凋亡。p 53基因發(fā)生突變后，失去了對Bcl-2蛋白的抑制作用，使細胞凋亡受抑制，化療藥物的毒性作用降低。所以，p 53的基因狀態(tài)與腫瘤細胞對于化療的敏感性密切相關。同時，bcl -2的高表達還可通過其抗凋亡機制，抑制野生型P53誘導的凋亡，bcl -2的過表達也是導致ACC耐藥的重要原因之一10。 【參考文獻】 1肖利華.眼眶淚腺上皮性腫瘤的影像學診斷.國際眼科雜志,2001;1(4):22-242劉琳,何彥津.淚腺腺樣囊性癌的放射治療.國際眼科雜志,2004;4(5):900-9043宋國祥,吳中耀.眼眶病學.第1版.北京:人民衛(wèi)生出

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