冬蟲夏草鈣制劑對衰老小鼠的抗衰老和免疫調(diào)節(jié)作用

1、冬蟲夏草鈣制劑對衰老小鼠的抗衰老和免疫調(diào)節(jié)作用         11-01-11 16:13:00     作者：胡征 劉丹丹    編輯：studa20【摘要】  目的 研究冬蟲夏草鈣制劑對小鼠抗衰老和免疫調(diào)節(jié)作用，并探討其作用機制。方法 以D半乳糖所致亞急性衰老小鼠為模型，測定冬蟲夏草鈣制劑對衰老小鼠全血丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)、血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)及白細胞介素1、6、8(IL1、6、8)

2、含量。結(jié)果 蟲草組MDA含量顯著低于衰老模型組和空白對照組（P<0.05），SOD及GSHPx活性顯著高于衰老模型組和空白對照組（P<0.05）；蟲草組與衰老模型組比較，小鼠血清IL1，IL6水平無顯著性變化，但IL8水平升高，差異顯著（P<0.05）。結(jié)論 冬蟲夏草鈣制劑具備抗衰老活性和免疫活性。 【關(guān)鍵詞】  冬蟲夏草鈣制劑；抗衰老；免疫調(diào)節(jié)【Abstract】  Objective  To study antiaging and immunoregulation effects and mechanism of calcium agent

3、from cultured Cordyceps sinensis (CCS) on aged mice. Methods  The aged mice were induced by Dgalactose, they were given dose of 0.1 g/ml CCS by 0.5 ml everyday for 4 w. Then the contents of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) of blood cell and glutathione peroxidase (GSHPx) and

4、 interleukin (IL)1, 6, 8 in serum were measured. Results  In the mice treated with CCS, the content of MDA was lower than those in model and blank group (P0.05), the activity of SOD and GSHPx were ignificantly increased compared with other groups (P0.05). There were no significant difference of

5、 serum IL1 and IL6 among three experimental groups, but the CCS group could remarkably improve the activity of IL8 (P0.05). Conclusions  CCS shows antiaging and immunoregulation effects on the aged mice.    【Key words】  Calcium agent from cultured Cordyceps sinensis; Antiagi

6、ng; Immunoregulation冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis屬于麥角菌科(Clavicipitaceae)，蟲草屬Cordyceps (Fr.) Link真菌，在抗衰老和增強免疫功能的研究中占有日益重要的地位。冬蟲夏草都能增加小鼠腹腔吞噬細胞的吞噬指數(shù)，使小鼠外周血及脾臟淋巴細胞增殖；還可使小鼠胸腺縮小，提高潑尼松所致免疫抑制狀態(tài)小鼠的血清溶血素及脾細胞免疫溶血活性；具有明顯抗疲勞、耐高溫作用，可抑制肝脂質(zhì)過氧化物的生成，并使紅細胞超氧化物歧化酶（SOD）活力增高；還能提高衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶成績，提高衰老小鼠肝、腦、紅細胞SOD及全血谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)，

7、提高腦中鈉鉀三磷酸腺苷酶（Na+K+ATP酶）活性，降低肝、腦丙二醛(MDA)含量15。冬蟲夏草鈣制劑是在人工培養(yǎng)的冬蟲夏草菌絲體中添加CaCl2，通過真菌的生命活動將無機鈣離子吸收進細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為大分子的生物螯合態(tài)活性鈣。本課題組以D半乳糖所致亞急性衰老小鼠為模型，測定了冬蟲夏草鈣制劑對衰老小鼠全血MDA、SOD、血清GSHPx及白細胞介素1、6、8(IL1、6、8)的影響，從而驗證冬蟲夏草鈣制劑具備免疫活性和抗衰老活性。1  材料與方法1.1  樣品 冬蟲夏草鈣制劑，本實驗室自備，Ca2+濃度為300 mg/g6,用蒸餾水配置成0.1 g/ml溶液。1.2

8、60; 試劑和儀器 紫外分光光度計：UNICO UV2000；全自動酶標(biāo)分析儀：瑞士FAME 24 /20；所有試劑盒均由美國R&D 公司提供。1.3  實驗方法1.3.1  建立衰老動物模型 昆明二級種小鼠36只，雌雄各半，隨機分為3組，每組12只，分別為正常對照組、模型組、蟲草組。除正常對照組每日頸后皮下注射生理鹽水0.2 ml外，其余2組每日皮下注射D半乳糖水溶液120 mg/kg連續(xù)28 d。各組動物在建模同時每日灌腸胃相應(yīng)受試藥劑。蟲草組小鼠日給藥量0.5 ml，每日一次，連續(xù)灌胃4 w（正常對照組和衰老模型組用等量生理鹽水灌胃）。于末

9、次給藥30 min將小鼠斷頭取血，測定血清MDA、SOD、GSHPx、IL1、6、8的含量或活性。1.3.2  MDA含量測定 取上述體外實驗黏附前后的血液，制備血細胞懸浮液，用反復(fù)凍溶的辦法溶解血細胞。以硫代巴比妥酸(TBA)熒光微測定法檢測MDA含量，用=532 nm的熒光進行檢測。1.3.3  GSHPx活性測定 采用2硝基苯甲酸法（DTNB法），以GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線計算?？紤]到GSH，H2O2在沒有酶的條件下亦可進行上述反應(yīng)，故最后計算GSHPx活力時，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH減少。GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用0，0.02，0.04，0.06，0.

10、08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20 ml 1.0 mol/L GSH加0.61 mol/L TCA 1.6 ml，用雙蒸水稀釋制成濃度為0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 mol/L的GSH標(biāo)準(zhǔn)液各2 ml，再在各管內(nèi)依次加入0.32 mol/L Na2HPO4 2.5 ml，4 mol/L NaOH 120 l，1.0 mol/L 二硝基苯甲酸(DTNB) 0.5 ml。以空白管校零點，于423 nm波長處比色，讀取吸光度值A(chǔ)。1.3.4  SOD測定 采用黃嘌呤氧化酶羥胺法，依次加入待測血清(用dH2O稀釋50

11、倍)0.5 ml,dH2O 0.1 ml,基質(zhì)液0.1 ml,亞硝基發(fā)生劑0.1 ml,酶溶液0.2 ml,37 保溫30 min。然后加入顯色劑2 ml,室溫放置10 min,于550 nm 波長處測定其吸光度。對照管用0.5 ml dH2O代替血清樣。酶活性單位(NU)定義為在30 min內(nèi)能抑制50% 黃嘌呤氧化酶催化底物氧化所需酶量,血清SOD活性以每ml 血清所含酶的活性單位數(shù)表示。1.3.5  IL1、6、8含量 采用雙抗夾心ELISA法，末次給藥后30 min將小鼠斷頭取血（不抗凝），靜置，見血清析出后，經(jīng)3 000 r/min離心10 min,取足量血清待測

12、。分別用抗IL1、6、8單抗包被于酶標(biāo)板上,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的IL1、6、8分別與單抗結(jié)合,加入生物素化的抗IL1、6、8抗體,形成免疫復(fù)合物連接在板上,辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streepptavidin與生物素結(jié)合,加入酶底物鄰苯二胺(OPD),出現(xiàn)黃色,加終止液硫酸,顏色變深,在492 nm處取吸光度D()值,IL1、6、8濃度與D()成正比,用自動酶標(biāo)分析儀分析結(jié)果。     11-01-11 16:13:00     作者：胡征 劉丹丹    編輯：studa201.4&

13、#160; 統(tǒng)計學(xué)處理 各組數(shù)據(jù)用x±s表示，并采用單因素方差分析檢驗。2  結(jié)果2.1  MDA及抗氧化酶活性含量 蟲草組MDA水平明顯降低（P<0.05），血中SOD水平及GSHPx活性明顯升高（P<0.05）。見表1。表1  冬蟲夏草鈣制劑對小鼠全血MDA、SOD和GSHPx含量的影響(略)2.2  冬蟲夏草鈣制劑對小鼠IL1、6、8水平的影響 蟲草組與衰老模型組比較，小鼠血清IL1，IL6水平無顯著性變化，但 IL8水平升高，差異顯著（P0.05）。見表2。表2  冬蟲夏草鈣制劑對小鼠

14、血清IL1、6、8水平的影響(略)3  討論   衰老是自由基引起生物膜的脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致膜組織損傷和功能失活，D半乳糖在體內(nèi)氧化產(chǎn)生的大量自由基超過機體的清除能力，引發(fā)脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并且過氧化脂質(zhì)的降解產(chǎn)物MDA可與游離氨基的蛋白質(zhì)及核酸等形成希夫堿，使生物分子之間發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，溶解度降低，損傷細胞膜，引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙。SOD是機體內(nèi)的抗氧化酶，其作用是清除自由基堆積，使生物膜脂質(zhì)過氧化，防止自由基對細胞結(jié)構(gòu)的破壞。機體保護系統(tǒng)對各種氧化應(yīng)激反應(yīng)的主要特點是GSHPx活性增加。衰老過程中肝細胞中GSHPx大量釋放入血，催化血液中脂質(zhì)過氧

15、化物分解，防止脂質(zhì)過氧化物均裂和引發(fā)脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)街ф湻磻?yīng)，從而減少脂質(zhì)過氧化物形成，是機體抗衰老的重要防御機制之一。    本實驗表明，冬蟲夏草鈣制劑使血中SOD水平及GSHPx活性明顯升高，MDA水平明顯降低，說明加入高劑量鈣的人工冬蟲夏草菌也能抑制D半乳糖致脂類過氧化的作用，具有抗衰老活性。人體和動物的衰老和免疫防御的健全狀態(tài)密切相關(guān)，免疫系統(tǒng)在細胞和分子水平上的適度調(diào)節(jié)可以延緩衰老7。IL反映免疫能力的作用不僅僅伴有行為的變化，而且可表現(xiàn)有易疲勞，應(yīng)激能力，免疫能力下降。IL1、6、8等細胞生長因子是體內(nèi)調(diào)節(jié)分子，形成神經(jīng)內(nèi)分泌免疫穩(wěn)定軸心，調(diào)節(jié)機體的整

16、體生理活動。IL1能促進胸腺細胞和T細胞增殖，主要在細胞免疫激活中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；IL6參加機體炎癥反應(yīng)和抗感染防御機制，具有一定的調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)等生物學(xué)效應(yīng)；IL8對特異和非特異的免疫反應(yīng)細胞具有強烈的趨化作用。本實驗結(jié)果顯示，冬蟲夏草鈣制劑使小鼠血清IL1、IL6水平無顯著性變化；但血清IL8水平升高，差異顯著。說明冬蟲夏草鈣制劑具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，其作用機制是能促進特異和非特異性抗體的產(chǎn)生。本實驗只是為冬蟲夏草鈣制劑的抗衰老和免疫調(diào)節(jié)作用提供了一定的實驗依據(jù)，其他如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的老化包括 DNA損傷、神經(jīng)元數(shù)量等方面還需要進一步的探討與研究，彌補酶生化測定的不足?！緟⒖嘉墨I

17、】  1 王根維，唐仕川，陳向偉.冬蟲夏草水提物對巨噬細胞吞噬功能的實驗研究J.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000；31(1)：201.2 徐曦，陳國楨.冬蟲夏草對免疫及造血功能影響的實驗研究J.湖南醫(yī)學(xué)，1995；12(4)：2024.3 Koh JH，Yu KW，Suh HJ，et al.Activation of macrophages and the intestinal immune system by an orally administered decoction from cultured mycelia of Cordyceps sinensJ.Biosci Biotechnol Biochem，2002；66（2）：40711.4 Siu KM，Mak DH，Ciu PY，et al.Pharm