寒冷缺氧降低大鼠脾臟T淋巴細胞的增殖反應

1、寒冷缺氧降低大鼠脾臟T淋巴細胞的增殖反應    【摘要】  目的觀察缺氧和寒冷對大鼠脾臟T淋巴細胞功能的影響及其與腺苷脫胺酶之間的關(guān)系，探討冬季急進高原時機體免疫功能改變的規(guī)律和機制。方法大鼠分別在常溫常氧、寒冷常氧、常溫缺氧以及寒冷缺氧環(huán)境中生活3 d，用3H?TdR摻入法檢測脾臟T淋巴細胞增殖功能，用比色法測定脾臟T淋巴細胞腺苷脫胺酶活性。結(jié)果與常溫常壓對照組比較，單純寒冷或單純?nèi)毖蹙梢鹌⑴KT淋巴細胞在刀豆素A刺激下的刺激指數(shù)顯著降低，但缺氧復合寒冷大鼠脾臟T淋巴細胞的刺激指數(shù)并未進一步降低，而是接近單純?nèi)毖醮笫?。單純?nèi)毖鹾蛦渭兒洳⒉?/p>

2、改變大鼠脾臟T淋巴細胞上的腺苷脫胺酶活性，而缺氧復合寒冷則使其顯著降低。結(jié)論缺氧和寒冷均可抑制脾臟T淋巴細胞的功能，但兩者對脾臟T淋巴細胞功能的影響可能并無疊加效應；腺苷脫氨酶活性的改變可能參與寒冷缺氧大鼠脾臟T淋巴細胞功能的降低。 【關(guān)鍵詞】  缺氧 寒冷 T淋巴細胞 腺苷脫氨酶Effects of hypoxia and cold on the splenic lymphocyte proliferation in rat    Abstract: Objective To explore the effects of hypoxia and col

3、d on splenic T lymphocytes proliferation. Methods Wistar rats were housed in the following conditions: 1. normal (room temperature: 2025 at sea level); 2. cold (room temperature: 02 at sea level); 3. hypoxia (room temperature: 2025 at 5 000 m simulated high altitude in hypobaric chamber); 4. hypoxia

4、 plus cold (room temperature: 02 at 5 000 m simulated high altitude in hypobaric chamber). Three days later, the spleen lymphocyte were collected and stimulated with concanavalin A. The activity of adenosine deaminase was determined by spectrophotometer. Results Splenocyte proliferation was signific

5、antly decreased after 3 days exposure to cold or hypoxia. The splenocyte proliferation for living in hypoxia combined with cold condition was similar as for living in hypoxia. The activity of adenosine deaminase was not influenced by hypoxia or cold alone but was reduced by combined cold and hypoxia

6、. Conclusion Both hypoxia and cold can inhibit the function of lymphocyte but there is no additive effect between hypoxia and cold. Adenosine deaminase may be involved in the inhibitive effect induced by cold combined with hypoxia.    Keywords: hypoxia; cold; T?lymphocyte; adenosine d

7、eaminase    急進高原時，機體的免疫系統(tǒng)會發(fā)生顯著改變，表現(xiàn)為血液中免疫球蛋白含量改變、抗體的產(chǎn)生、T細胞數(shù)量和亞型改變等1。高原環(huán)境對人體的影響，主要因素是缺氧。但臨床資料顯示，冬季進入高原，急性高原反應的發(fā)病率明顯高于夏季，寒冷是誘發(fā)或加劇高原性疾病的重要因素。高原寒冷氣候特點，是否參與機體免疫系統(tǒng)功能的改變，尚缺乏實驗依據(jù)。本實驗利用減壓缺氧復合寒冷模型，觀察了大鼠脾臟T淋巴細胞功能改變，并對其機制進行了初步研究，以探討冬季急進高原時，免疫系統(tǒng)功能改變的規(guī)律及其在急性高原病發(fā)病中的意義。    1材料與方法 

8、   1.1動物模型    80只健康雄性Wistar大鼠（本校實驗動物中心提供），體重（180±15）g，常規(guī)分籠喂養(yǎng)，自由飲水進食。適應性喂養(yǎng)1周后，平均分為4組：常溫常氧對照組（n=20），動物在常溫減壓艙內(nèi)飼養(yǎng)，不減壓但保持足夠的通風量，環(huán)境溫度為2025 ，海拔高度為300 m；寒冷常氧組（n=20），動物在低溫減壓艙內(nèi)飼養(yǎng)，不減壓但保持足夠的通風量，艙內(nèi)溫度為02 ，海拔高度300 m；常溫缺氧組（n=20），動物在常溫減壓艙內(nèi)，艙內(nèi)溫度為2025 ，模擬海拔高度5 000 m；寒冷缺氧組（n=20），動物在低溫減壓艙內(nèi)，

9、艙內(nèi)溫度02 ，模擬海拔高度5 000 m。動物在上述環(huán)境條件下生活3 d后立即取出，在平原進行如下實驗。    1.2脾臟T淋巴細胞增殖實驗    動物脫頸致死，無菌取脾，剪碎，用不銹鋼絲網(wǎng)（180目和320目）制成單個細胞懸液。用大鼠淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。計數(shù)活細胞百分數(shù)96%。預實驗發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞分裂原?駁抖顧?(ConA) 刺激脾臟T淋巴細胞分裂的最佳濃度和次最佳濃度分別為5 g/ml和2.5 g/ml。因此，實驗中用5.0 g/ml和2.5 g/ml兩個ConA濃度刺激T淋巴細胞增殖。細胞在含15%小牛血清的RPMI

10、 1640的培養(yǎng)液中，37 、5% CO2孵箱中培養(yǎng)54 h后，每孔加入1.0 Ci 3H?TdR，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。用多頭細胞收集器將細胞收集在濾紙上，用Beckman公司生產(chǎn)的液體閃爍記數(shù)儀測定放射活性。每個ConA濃度點做5復孔。計算刺激指數(shù)（SI）。    1.3脾臟T淋巴細胞腺苷脫胺酶（ADA）活性測定    各組另取10只大鼠，同上制備淋巴細胞。準確記數(shù)淋巴細胞的數(shù)目，離心后，沉淀加入2 ml蒸餾水，反復凍融10次，顯微鏡下確認細胞破裂后，按Giusti G2報道的方法測定620 nm處的吸光度（UV?240分光光度計，日

11、本島津公司）。以每106個淋巴細胞樣品37 作用于腺苷60 min所產(chǎn)生氨氮的微克數(shù)作為酶的活性單位（U/106個淋巴細胞）。    1.4實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析    實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示。用SPSS軟件進行雙因素方差分析，P0.05為顯著性判斷標準。    2結(jié)果    2.1動物體重的變化    常溫常氧對照組和寒冷常氧組大鼠體重無明顯變化，而在常溫缺氧環(huán)境中生活3 d的大鼠和在寒冷缺氧環(huán)境中生活3 d的大鼠

12、體重卻明顯降低。說明缺氧可引起動物體重降低；而在寒冷缺氧環(huán)境中，動物體重的降低可能主要是由缺氧引起的(表1)。表1各組動物體重的變化     2.2大鼠脾臟T淋巴細胞增殖反應結(jié)果比較    對照組大鼠脾臟T淋巴細胞，5.0 g/ml ConA的刺激指數(shù)為（64.0±23.7）；2.5 g/ml ConA的刺激指數(shù)為（43.5±21.7）。動物從2025 進入02 環(huán)境中生活3 d后，用5.0 g/ml ConA刺激時，3H?TdR的摻入量明顯降低；而用2.5 g/ml ConA刺激時，無明顯變化。常溫缺氧條件下生活

13、3 d的大鼠，脾臟T淋巴細胞在兩個濃度ConA刺激下的3H?TdR的摻入量均顯著降低，刺激指數(shù)顯著下降；大鼠在寒冷缺氧環(huán)境中生活3 d后，脾臟T淋巴細胞在5.0 g/ml ConA刺激下的3H?TdR的摻入量與常溫缺氧和寒冷常氧組相比，未見進一步降低；而在2.5 g/ml ConA刺激下的3H?TdR的摻入量與常溫缺氧組相比未見明顯差異，但顯著低于寒冷常氧組(表2)。表2大鼠脾臟淋巴細胞增殖反應(刺激指數(shù))    2.3脾臟淋巴細胞腺苷脫胺酶活性測定脾臟淋巴細胞腺苷脫胺酶活性測定結(jié)果見表3。表3脾臟淋巴細胞ADA活性測定結(jié)果    3

14、討論    本實驗發(fā)現(xiàn)缺氧和寒冷均可在一定程度上抑制脾臟T淋巴細胞的增殖反應。當動物處于寒冷缺氧環(huán)境中時，T淋巴細胞在2.5 g/ml ConA刺激下的3H?TdR摻入量接近于單純?nèi)毖踅M動物，但顯著低于單純寒冷組，說明缺氧和寒冷兩者對脾臟T淋巴細胞的增殖反應可能并無疊加效應；在寒冷缺氧環(huán)境中，脾臟T淋巴細胞增殖反應降低可能主要是由機體缺氧引起的。    高原環(huán)境對人體的影響主要因素是缺氧。為對抗外環(huán)境缺氧的影響，機體通過各種神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，以維持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。缺氧時，機體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的變化，可能通過免疫細胞上的受體，影響機體的免

15、疫功能1。本實驗結(jié)果表明，缺氧可在一定程度上抑制脾臟T淋巴細胞的增殖反應。Caldwell等3實驗發(fā)現(xiàn)，將小鼠脾臟淋巴細胞培養(yǎng)在1%或2.5%的低氧環(huán)境中時，T淋巴細胞的成熟延緩，細胞因子的分泌發(fā)生改變。Klokker等4報道，5 400 m減壓缺氧20 min就可引起人體免疫系統(tǒng)顯著改變。Loeffler等5在研究腫瘤免疫時發(fā)現(xiàn)，腫瘤無氧區(qū)的T細胞浸潤數(shù)量雖無明顯變化，但其功能顯著降低。急性缺氧時，T細胞功能改變，可能在急性高原病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。但有人發(fā)現(xiàn)，缺氧對免疫功能的影響，不能完全用腎上腺皮質(zhì)反應增強來解釋，因為在切除腎上腺的大鼠，缺氧對免疫功能的影響依然存在6。 &

16、#160;  腺苷脫胺酶（adenosine deaminase, ADA）是嘌呤核苷酸代謝過程中起重要作用的酶，廣泛存在于人體各種組織和細胞中。在淋巴細胞中活性最高，是前T淋巴細胞分化為T淋巴細胞中不可缺少的酶，與淋巴細胞的增殖、分化有關(guān)，是反映細胞免疫功能的一個重要指標。當機體的腺苷脫胺酶活性降低或缺乏時，會引起以胸腺發(fā)育不全、T細胞減少和免疫功能降低為特征的嚴重的免疫缺陷病（severe combined immunodeficiency, SCID）7。將外源性ADA基因轉(zhuǎn)染到先天性ADA陰性的SCID病人的骨髓細胞和外周血淋巴細胞后，隨著病人T細胞、B細胞、粒細胞和骨髓細胞

17、等表達ADA正常，病人的免疫功能恢復正常8。研究表明9，ADA活性降低或缺乏引起的SCID，可能是由于ADA活性降低或缺乏時，細胞外腺苷不能被降解所致。在我們的實驗中，寒冷缺氧組大鼠ADA活性顯著降低，同時脾臟淋巴細胞的增殖反應明顯受到抑制，因此寒冷缺氧環(huán)境有可能通過降低ADA活性，減少腺苷的降解，增加淋巴細胞周圍的腺苷含量，從而抑制脾臟淋巴細胞的功能。單純?nèi)毖鹾蛦渭兒浣M大鼠脾臟淋巴細胞ADA活性無明顯改變，但淋巴細胞的增殖反應明顯降低。造成這種現(xiàn)象的原因不清楚，是否與腺苷、交感神經(jīng)興奮、兒茶酚氨增多及腎上腺皮質(zhì)激素增多有關(guān)，尚需進一步實驗證實。    通過本實

18、驗，我們可得出如下結(jié)論：缺氧和寒冷均可在一定程度上抑制脾臟T淋巴細胞的增殖反應，但兩者對脾臟T淋巴細胞的增殖反應可能并無疊加效應；在寒冷缺氧環(huán)境中，脾臟T淋巴細胞增殖反應降低可能主要是由機體缺氧引起的；腺苷脫氨酶活性的改變可能參與寒冷缺氧大鼠脾臟T淋巴細胞功能的改變。 【參考文獻】  1 高鈺琪.高原軍事醫(yī)學M.重慶：重慶出版社，2005.145-147.2 Giusti G, Galanti B. Methods of Enzymatic AnalysisM. the 3rd edit, Vol IV. New York: Verlag Chemie, Weinheim

19、and Academic Press, 1984. 315-321.3 Caldwell CC, Kojima H, Lukashev D, et al. Differential effects of physiologically relevant hypoxic conditions on T lymphocyte development and effector functionsJ. J Immunol, 2001,167(11):6140-6149. 4 Klokker M, Kharazmi A, Galbo H， et al. Influence of in vivo hypo

20、baric hypoxia on function of lymphocytes, neutrocytes, natural killer cells, and cytokinesJ. J Appl Physiol, 1993,74(3):1100-1106.5 Loeffler DA, Keng PC, Baggs RB, et al. Lymphocytic infiltration and cytotoxicity under hypoxic conditions in the EMT6 mouse mammary tumorJ. Int J Cancer, 1990, 45(3): 462-467.6 白海波，杜繼曾，賈紅衛(wèi). 低